高通量測序同時檢測樣本中RNA病毒與DNA病毒混合感染

于詩筠，崔鶴馨，文會淇，喻鑫婷，呂金暉，張雅倩，張湘莉蘭，崔玉軍，米志強*，黃海龍*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學 動物科學技術(shù)學院，吉林 長春 130118；2.長春市農(nóng)業(yè)科學院，吉林 長春 130022；3.軍事科學院 軍事醫(yī)學研究院 微生物流行病研究所 病原微生物生物安全國家重點實驗室，北京 100071)

隨著經(jīng)濟水平與生活質(zhì)量的提高，貓現(xiàn)今已成為人們首選的伴侶動物之一。貓傳染性腹膜炎(FIP)是貓臨床常見傳染病之一，該病主要由感染貓冠狀病毒(FCoV)所導(dǎo)致，具有傳染性強、致死率高的特點。據(jù)報道，F(xiàn)CoV為單股正鏈RNA病毒，可分為貓腸道冠狀病毒(FECV)與貓傳染性腹膜炎病毒(FIPV)兩種[1]。一般來說，絕大多數(shù)幼貓接觸母體糞便后均有可能感染FECV，臨床癥狀一般表現(xiàn)為輕度腹瀉，因而容易被忽視[2]，然而該病毒容易突變?yōu)镕IPV，導(dǎo)致貓患傳染性腹膜炎，從而導(dǎo)致貓死亡[3]。

當前，獸醫(yī)臨床通常使用膠體金快速試紙法及其他傳統(tǒng)病原檢測法判斷貓病毒感染[3]，然而，這些檢測方法均存在一定的局限性。膠體金快速試紙法雖然簡便快捷，但其靈敏度不高，陽性結(jié)果不能說明一定感染了特定病毒[4]。其他傳統(tǒng)病原檢測法主要分為兩類，一類是通過細胞形態(tài)學、生理生化特征，以及培養(yǎng)分型識別病原，另一類則是通過特異性引物、探針、抗體等快速檢測病原[5]。雖然上述方法在病原檢測中具有重要作用，但是也存在一些不足之處。一方面，某些病原體的培養(yǎng)條件要求較高，難以在實驗室條件下進行培養(yǎng)。另一方面，基于引物、探針、抗體的檢測方法需要完整的病原基因組序列，只能針對已知病原感染。

近年來，隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展與成本降低，未知病原體感染的檢測水平獲得極大提高。相對于傳統(tǒng)病原檢測技術(shù)，高通量測序技術(shù)不依賴于病原培養(yǎng)與特異性基因序列，可對樣本內(nèi)痕量病原體的核酸進行高通量測序與分析。目前，高通量測序技術(shù)包含DNA建庫與RNA建庫兩種方法，盡管基于兩種建庫方法的高通量測序均能檢測到樣本中的病原體，但是，由于基于DNA建庫的測序技術(shù)無法捕捉到無DNA復(fù)制周期的RNA病毒，因此，基于RNA建庫的測序技術(shù)能夠檢測到更多的病原體。當前，高通量測序技術(shù)主要用于雞、鴨與豬等畜禽動物疫病的流行病學研究，較少用于貓混合病毒感染的檢測。

基于此，本研究利用RNA建庫技術(shù)對1例貓傳染性腹膜炎的腹水與血清樣本進行了高通量測序，并對所得數(shù)據(jù)進行分析以判斷感染病原，結(jié)果提示病貓腹水樣本中既攜帶RNA病毒也攜帶DNA病毒，包括FIPV(ssRNA)、貓星狀病毒(FeAstV，ssRNA)與犬細小病毒(CPV，ssDNA)3種病毒，血清樣本中攜帶FIPV(ssRNA)。總之，本研究不僅證實基于RNA建庫的高通量測序技術(shù)能夠同時檢測到RNA與DNA病毒混合感染，而且能夠為動物未知病原體感染的檢測提供新思路與參考。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑Qubit 2.0熒光計(賽默飛，美國)；NanoDrop微量分光光度計(賽默飛，美國)；病毒RNA提取試劑盒(羅氏，瑞士)；RNA建庫試劑盒(賽默飛，美國)；2100生物分析儀(安捷倫，美國)；高靈敏DNA試劑盒(安捷倫，美國)；Ion GeneStudio S5 Plus測序儀(賽默飛，美國)。

1.2 樣本來源與核酸提取所用樣本來源于7月齡發(fā)病雌貓的腹水與血清，該病貓的主要臨床癥狀為高燒、嗜睡、黃疸、腹圍增大、精神沉郁、食欲減退、消瘦。分別取400 μL腹水與血清樣本，使用羅氏核酸提取試劑盒提取樣本中總RNA并置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 cDNA文庫的構(gòu)建與測序使用RNA建庫試劑盒構(gòu)建cDNA文庫，具體方法如下：首先，將病毒RNA 隨機打斷成不同片段，其次，在每個片段末端添加接頭(adaptor)，最后，加入逆轉(zhuǎn)錄酶，使RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA，同時加入不同標簽序列(barcode)以區(qū)分不同樣本。接下來，使用NanoDrop 微量分光光度計對所得cDNA文庫進行定量，使用安捷倫2100生物分析儀分析文庫片段長度，隨后，使用Ion GeneStudio S5 Plus測序儀進行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析本研究對所得測序數(shù)據(jù)使用FastP 0.21.0軟件(http://github.com)與FastQC軟件(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk)進行質(zhì)控，即篩選堿基正確率為 99.9% 的reads(Q20)。所得質(zhì)控數(shù)據(jù)使用kraken2-2.0.7-beta軟件(https://ccb.jhu.edu)與minikraken2_v2_8GB_201904_UPDATE數(shù)據(jù)庫(https://ccb.jhu.edu/)，以及Centrifuge-1.0.3-beta軟件(https://ccb.jhu.edu)與p_compressed+h+v數(shù)據(jù)庫(https://ccb.jhu.edu)進行物種比對分析，得到檢測樣本中可能存在的病毒數(shù)據(jù)，并從NCBI Genome數(shù)據(jù)庫中下載相應(yīng)病毒的參考序列。然后根據(jù)病毒參考序列，使用CLC Genomics Workbench 3.6.1軟件[6](https://digitalinsights.qiagen.com)對腹水與血清樣本的質(zhì)控數(shù)據(jù)進行組裝。最后，使用NCBI BLASTn數(shù)據(jù)庫對組裝后的reads進行比對與驗證。

2 結(jié)果

2.1 RNA提取與cDNA文庫構(gòu)建Qubit 2.0熒光計測得腹水與血清樣本中提取的總RNA質(zhì)量濃度分別為11.8,8.0 mg/L，取100 ng RNA用于cDNA文庫構(gòu)建，NanoDrop 微量分光光度計測得腹水cDNA文庫濃度為166.7 pmol/L，血清cDNA文庫濃度925.8 pmol/L。使用2100生物分析儀測得腹水cDNA文庫平均片段長度為320 bp，血清cDNA文庫平均片段長度為237 bp，如圖1所示。

A.腹水cDNA文庫；B.血清cDNA文庫。圖中箭頭所示位置為cDNA文庫的片段大小

2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控腹水與血清cDNA文庫經(jīng)高通量測序分別獲得354.5 Mb與1.4 Gb原始數(shù)據(jù)，經(jīng)FastP 0.21.0與FastQC軟件對所得腹水與血清原始數(shù)據(jù)質(zhì)控后分別獲得1 323 407條與1 323 407條reads，結(jié)果見表1。

表1 測序數(shù)據(jù)質(zhì)控

2.3 測序數(shù)據(jù)分析通過kraken2-2.0.7-beta軟件與minikraken2_v2_8GB_201904_UPDATE數(shù)據(jù)庫對所得質(zhì)控數(shù)據(jù)進行物種比對分析，腹水樣本中可能攜帶12種病毒，血清樣本中可能攜帶6種病毒。使用Centrifuge-1.0.3-beta軟件與p_compressed+h+v數(shù)據(jù)庫對質(zhì)控數(shù)據(jù)進行比對分析，發(fā)現(xiàn)腹水樣本中可能攜帶10種病毒，血清樣本中可能攜帶10種病毒。從NCBI Genome數(shù)據(jù)庫中下載上述病毒參考序列，使用CLC Genomics Workbench 3.6.1軟件對質(zhì)控數(shù)據(jù)進行比對與組裝，結(jié)果見表2與圖2。最后，使用NCBI BLASTn數(shù)據(jù)庫對組裝后的reads進行比對與驗證可得：該病貓腹水樣本中攜帶FIPV(ssRNA)、FeAstV(ssRNA)與CPV(ssDNA)；血清樣本中攜帶FIPV(ssRNA)。

表2 質(zhì)控數(shù)據(jù)分析

A.貓腹水測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后在FIPV參考序列(NC_002306)上的分布和覆蓋度；B.貓腹水測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后在FeAstV參考序列(NC_022249)上的分布和覆蓋度；C.貓腹水測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后在CPV參考序列(NC_001539)上的分布和覆蓋度；D.貓血清測序數(shù)據(jù)經(jīng)質(zhì)控后在FIPV參考序列(NC_002306)上的分布和覆蓋度

3 討論

已有病毒的突變與新發(fā)病毒的不斷出現(xiàn)給動物和人類健康造成極大威脅。貓作為人類首選伴侶動物之一，對其攜帶的病毒進行監(jiān)測十分必要。傳統(tǒng)病原檢測多是基于病原生化特性、膠體金、PCR與ELISA等方法的單病原檢測。盡管多重PCR技術(shù)與微流控技術(shù)進一步提高了檢測病原體的種類，但還是無法對樣本中攜帶的全部病原體進行檢測，高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)彌補了這一缺陷。然而，高通量測序技術(shù)在未知病原體檢測方面的應(yīng)用同樣面臨挑戰(zhàn)，比如樣本中病原體含量過低時無法檢出，樣本受到環(huán)境污染影響測序結(jié)果的準確度，測序過程中存在PCR偏向性等問題。此外，部分RNA病毒在復(fù)制過程中沒有DNA產(chǎn)物，這導(dǎo)致基于DNA建庫的高通量測序方法無法獲得這些RNA病毒的序列[7]。

所有病原體在復(fù)制過程中都會有RNA產(chǎn)生，因此，基于RNA建庫的高通量測序技術(shù)在理論上能夠檢測到樣本中所有的病原體。與傳統(tǒng)病原檢測技術(shù)相比，該技術(shù)靈敏度高，且不依賴于已知基因組序列。本研究利用RNA建庫測序技術(shù)，通過對病貓腹水與血清樣本進行高通量測序與分析，發(fā)現(xiàn)腹水樣本中攜帶3種病毒，即FIPV、FeAstV與CPV，血清樣本中攜帶一種病毒FIPV，其中FIPV與FeAstV為單股正鏈RNA病毒，CPV為單鏈線狀DNA病毒。

FIPV通常由FECV突變而來，具有致死率高、傳染性強的特點。FeAstV的致病性尚不明確，因此診斷方法有限[8-9]。目前，部分研究報道可通過RT-PCR檢測FeAstV，但可能存在假陽性[10-11]。CPV通?？蓪?dǎo)致犬急性出血性腸炎、心肌炎等疾病。近年來，由于CPV的基因突變，其宿主范圍不斷擴大，現(xiàn)已有報道證實，CPV-2a、CPV-2b與CPV-2c亞型可感染貓科動物，其癥狀與貓泛白細胞減少癥相似[12]。目前，獸醫(yī)臨床常用膠體金快速試紙法檢測犬感染CPV，但是 ，該方法同樣存在假陽性。此外，由于貓感染CPV的癥狀與貓泛白細胞減少癥相似，故極易導(dǎo)致誤診[13-14]。FeAstV與CPV通常不能引起貓腹水，但是，當哺乳動物機體免疫功能降低時，星狀病毒屬能夠破壞腸道上皮屏障，致使其他組織器官感染[15-17]， 而CPV可以侵害淋巴組織、骨髓與腸黏膜，造成全身感染[18]。

本研究通過RNA建庫測序能夠同時檢測到貓腹水樣本中的RNA病毒與DNA病毒。該技術(shù)不僅在未知病原體檢測中發(fā)揮了重要作用，而且也為分析細胞轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控提供了有效手段[19]，此外，該測序技術(shù)還可以用于監(jiān)測病毒突變，對于傳染病的防控具有重要意義。