新型冠狀病毒水貂變異株重組水泡性口炎病毒載體假病毒的拯救及鑒定

王 申，王瑋琦,2，閆飛虎*，馮 娜，趙永坤，王鐵成，高玉偉，楊松濤*，夏咸柱,2

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 長春獸醫(yī)研究所 吉林省人獸共患病預(yù)防與控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130122；2.吉林大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院 人獸共患病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，吉林 長春 130062)

新型冠狀病毒肺炎(coronavirus disease 2019,COVID-19)的大流行對世界人民生命健康安全及全球經(jīng)濟(jì)造成了巨大的沖擊。截止到2021年10月23日，COVID-19已造成超過2.42億人感染，超過492萬死亡病例[1]。新型冠狀病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)變異株的頻繁出現(xiàn)是造成此次疫情綿延不斷的重要原因。目前多個(gè)SARS-CoV-2變異株相繼被報(bào)道出來，包括英國變異株α(B.1.1.7)[2]，南非變異株β(B.1.351)[3]，巴西變異株γ(P.1)[4]，印度變異株△(B.1.617.2)[5]等。其中與水貂密切相關(guān)的水貂變異株(cluster 5)備受關(guān)注，伴隨著SARS-CoV-2水貂變異株由水貂向人類傳播的病例被證實(shí)，荷蘭、丹麥等國家數(shù)百萬只水貂被撲殺[6-9]。目前國內(nèi)外對于動(dòng)物感染SARS-CoV-2的關(guān)注程度日益密切，相應(yīng)的疫苗研究及接種計(jì)劃也正在有序的推進(jìn)。在這種形勢下，構(gòu)建SARS-CoV-2水貂變異株假病毒對于針對SARS-CoV-2水貂變異株的血清學(xué)研究、水貂用疫苗評估具有重要意義。

水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)屬于彈狀病毒科，水皰病毒屬，是一種不分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒[10]。VSV基因組較為簡單，編碼5種主要的蛋白，從3′端到5′端分別為：核蛋白(N)，磷蛋白(P)，囊膜糖蛋白(G)，多功能基質(zhì)蛋白(M)和大聚合酶蛋白(L)[11]。VSV具有宿主噬性廣、復(fù)制能力強(qiáng)、生長滴度高、安全性好、最大可容納4.5 kb的外源基因、不易整合到宿主基因組中等優(yōu)點(diǎn)[12-13]。在早期VSV反向遺傳系統(tǒng)建立之后[14-15]，歷經(jīng)多次改造及優(yōu)化，VSV作為假病毒載體[16-17]，病毒疫苗載體[18-20]，溶瘤病毒載體[21]得到了廣泛的應(yīng)用。先前的研究已經(jīng)驗(yàn)證了SARS-CoV-2重組VSV載體假病毒表現(xiàn)出與真實(shí)SARS-CoV-2相似的針對中和抗體及可溶性人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2蛋白的反應(yīng)特性[16]，因此開發(fā)基于VSV載體的SARS-CoV-2假病毒可作為一種真實(shí)反映SARS-CoV-2病毒中和、病毒入侵抑制的有效替代模型。

本研究旨在構(gòu)建并拯救SARS-CoV-2水貂變異株重組VSV載體假病毒并結(jié)合生長動(dòng)力學(xué)曲線檢測、RT-PCR鑒定、Western blot鑒定、透射電鏡觀察等技術(shù)對拯救的假病毒進(jìn)行鑒定。這一假病毒為SARS-CoV-2水貂變異株的中和抗體評價(jià)和抗病毒藥物篩選奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑BSR(BSR-T7)、Vero E6細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存、以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)。DMEM、胎牛血清購自Gibco；PCR酶、AnzaT4連接酶購自TaKaRa；DNA Marker購自全式金；蛋白Marker、各種限制性核酸內(nèi)切酶購自Thermo；RT-PCR試劑盒、磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen；兔抗SARS-CoV-2 S多克隆抗體購自義翹神州；山羊抗兔HRP抗體購自Bioworld；RNA提取試劑盒購自QIAGEN。

1.2 感染性克隆全長及輔助質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

1.2.1VSV骨架cDNA克隆的構(gòu)建及鑒定 基于VSV印第安納株正鏈全長序列(GenBank ID:NC_001560.1)，在其5′起始端添加T7啟動(dòng)子序列5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′；錘頭狀核酶序列：5′-TGTTAAGCGTCTGATGAGTCCGTGAGGACGAAACTATAGGAAAGGAATTCCT-ATAGTC-3′；在N基因下游轉(zhuǎn)錄終止序列(GS)后添加2個(gè)酶切位點(diǎn)BsiWⅠ、PacⅠ：5′-CGTACGTTAATTAA-3′及轉(zhuǎn)錄起始序列(GE)：5′-AACAGATATC-3′，eGFP序列(GenBank ID:HV192862.1)；在P基因上游非編碼區(qū)添加GS：5′-TATGAAAAAAA-3′、2個(gè)酶切位點(diǎn)BstEⅡ、BsiWⅠ：5′-GGTAACCGTACG-3′；在G基因的上游非編碼區(qū)添加AscⅠ、SanDⅠ2個(gè)酶切位點(diǎn)：5′-GGCGCGCCAGATGGAGGGACCC-3′；下游非編碼區(qū)添加PvuⅠ、Bsu36Ⅰ2個(gè)酶切位點(diǎn)：5′-GCGATCGCAGATGGACCTGAGG-3′；在全基因序列的3′末端添加丁型肝炎核酶序列：5′-GGGTCGGCATGGCATCTCCACCTCCTCGCGG-TCCGACCTGGGCATCCGAAGGAGGACGCAC-GTCCACTCGGATGGCTAAGGGAGGGCG-3′及T7終止子序列：5′-CTAGCATAACCCCTTGG-GGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTT-G-3′。

所構(gòu)建的全長質(zhì)粒交由上海生工生物工程有限公司以全基因合成的方式構(gòu)建于pcDNA3.1(+)載體上，多克隆酶切位點(diǎn)選擇為：NotⅠ、XhoⅠ。VSV骨架cDNA克隆命名為P3.1-VSV-eGFP。

1.2.2SARS-CoV-2重組VSV載體假病毒全長質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 SARS-CoV-2 水貂變異株cluster 5 S基因(GISAID ID：EPI_ISL_616695)由上海生工生物工程有限公司合成。將酶切位點(diǎn)AscⅠ、PvuⅠ分別設(shè)計(jì)于S基因的上、下游引物中，使用下列引物對合成的SARS-CoV-2 S基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

引物F：5′-ATGGCGCGCCATGTTTGTTT-TTCTTGTTTTA-3′;R：5′-CGATCGTTATGTGTAATGTAATTT-3′。

將VSV骨架cDNA克隆P3.1-VSV-eGFP及SARS-CoV-2 S基因的PCR產(chǎn)物同時(shí)使用AscⅠ、PvuⅠ進(jìn)行雙酶切，膠回收P3.1-VSV-eGFP及SARS-CoV-2 S酶切產(chǎn)物，室溫連接過夜，連接產(chǎn)物命名為P3.1-VSV△G-S-eGFP，對P3.1-VSV△G-S-eGFP進(jìn)行AscⅠ、PvuⅠ雙酶切鑒定。

1.2.3輔助質(zhì)粒構(gòu)建及鑒定 通過NheⅠ和NotⅠ酶切位點(diǎn)分別將VSV N、P、L及G基因的開放式閱讀框(open reading frame,ORF)序列構(gòu)建于pcDNA3.1(+)載體上,分別命名為P3.1-VSV-N；P3.1-VSV-P；P3.1-VSV-L和P3.1-VSV-G。對構(gòu)建的輔助質(zhì)粒進(jìn)行NheⅠ、NotⅠ雙酶切鑒定。

1.3 重組病毒的拯救及傳代培養(yǎng)BSR細(xì)胞具有表達(dá)T7 RNA聚合酶的能力，同時(shí)具有較高的轉(zhuǎn)染效率，因此被用于VSV病毒的拯救。BSR細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，細(xì)胞傳代至35 mm 6孔板培養(yǎng)過夜，生長密度為90%時(shí)用于轉(zhuǎn)染。采用Invitrogen磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑，具體步驟參見說明書。6孔板中每孔質(zhì)粒轉(zhuǎn)染量為：P3.1-VSV-eGFP/P3.1-VSV△G-S 2.5 μg，P3.1-VSV-N 1.5 μg，P3.1-VSV-P 2.5 μg，P3.1-VSV-L 0.5 μg，P3.1-VSV-G 4.0 μg。2個(gè)重組病毒各拯救6個(gè)孔。轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞用含5%胎牛血清的DMEM進(jìn)行培養(yǎng)，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱16 h，再以含10% DMSO的PBS休克2.5 min，然后加入新鮮的含5%胎牛血清的DMEM，培養(yǎng)至72 h，進(jìn)行傳代。傳代時(shí)，收集細(xì)胞及上清，-80℃凍融后，3 000 r/min離心5 min，去除細(xì)胞碎片，于Vero E6細(xì)胞上傳代，37℃感作2 h，隨后加入含5%胎牛血清的DMEM，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，細(xì)胞病變大于90%時(shí)收集細(xì)胞及上清，分裝保存于-80℃，用于對救獲病毒VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP進(jìn)行生長動(dòng)力學(xué)檢測。

1.4 重組病毒的生長動(dòng)力學(xué)檢測用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)Vero E6細(xì)胞，當(dāng)Vero E6細(xì)胞在6孔板內(nèi)生長密度為80%～90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基后用第5代(P5)母本病毒VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP以MOI約為0.01的劑量分別感染Vero E6細(xì)胞，感染l h后用含10% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。分別于感染后0，12，24，36，48，60，72，84和96 h收集細(xì)胞上清液200 μL。將樣品進(jìn)行連續(xù)10倍稀釋并且設(shè)置12個(gè)稀釋度(10-12～10-1)，然后分別接種預(yù)先鋪好的90%密度的Vero E6細(xì)胞的96孔板內(nèi)，每個(gè)稀釋度接種8個(gè)孔。接種72 h后觀察細(xì)胞病變并統(tǒng)計(jì)每個(gè)稀釋度的Vero E6細(xì)胞感染孔數(shù)，進(jìn)行樣品的半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量(50% tissue culture infective dose,TCID50)測定。

1.5 重組病毒的RT-PCR鑒定利用QIAGEN RNA提取試劑盒提取P5代重組病毒VSV△G-S-eGFP的基因組RNA，提取方法參照說明書。對所提取的RNA進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。引物同SARS-CoV-2 S基因的PCR引物。對擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行電泳及測序鑒定。設(shè)置母本病毒VSV-eGFP作為陰性對照組。

1.6 重組病毒的Western blot鑒定用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)Vero E6細(xì)胞，當(dāng)Vero E6細(xì)胞在6孔板內(nèi)生長密度為90%時(shí)，棄去培養(yǎng)基后用P5代VSV△G-S-eGFP以MOI約為0.01的劑量分別感染Vero E6細(xì)胞，在37℃的條件下感染1 h后用含10% FBS的DMEM繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞。感染24 h后分別收集細(xì)胞，用NP-40裂解液在4℃的條件下裂解細(xì)胞l h，然后進(jìn)行SDS-PAGE電泳并將目的蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜，5%脫脂乳室溫封閉30 min。以兔抗SARS-CoV-2 S(1∶2 500)為一抗室溫孵育2 h后用PBST洗3次，再以山羊抗兔IgG-HRP(1∶10 000)為二抗室溫孵育1 h后用PBST洗3次，最后利用化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)Tanon-5200Multi進(jìn)行成像。設(shè)置母本病毒VSV-eGFP作為陰性對照組。

1.7 重組病毒的透射電鏡觀察收獲VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP F5代病毒感染細(xì)胞上清液，12 000 r/min 離心30 min，取100 μL上清采用磷鎢酸負(fù)染法制備樣本，透射電鏡觀察病毒粒子形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1 感染性克隆全長及輔助質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

2.1.1VSV骨架cDNA克隆的構(gòu)建及鑒定 在VSV印第安納株正鏈全長序列的基礎(chǔ)上添加了一系列反向遺傳元件：在5′起始端添加錘頭狀核酶、T7啟動(dòng)子序列；在N基因與P基因之間添加eGFP標(biāo)簽序列，eGFP上游添加BsiwⅠ和PacⅠ2個(gè)酶切位點(diǎn)及GE序列，eGFP下游添加BstEⅡ和BsiwⅠ2個(gè)酶切位點(diǎn)及GS序列；在G基因的上、下游分別添加AscⅠ、SanDⅠ及PvuⅠ、Bsu36Ⅰ2對酶切位點(diǎn)；在3′末端添加丁型肝炎核酶、T7終止子序列。將上述改造后VSV正鏈全基因序列合成于pcDNA3.1(+)載體上，多克隆位點(diǎn)為NotⅠ和XhoⅠ，pcDNA3.1(+)載體上的CMV啟動(dòng)子對接VSV正鏈基因組的5′端(圖1A)。P3.1-VSV-eGFP經(jīng)雙酶切得到5 428和12 198 bp 2條目的條帶，大小與預(yù)期相符，即VSV骨架cDNA克隆P3.1-VSV-eGFP構(gòu)建正確(圖1C)。

2.2.2SARS-CoV-2重組VSV載體假病毒全長質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 以SARS-CoV-2 S基因替換VSV骨架cDNA克隆P3.1-VSV-eGFP中的G基因，得到SARS-CoV-2重組VSV載體假病毒全長質(zhì)粒P3.1-VSV△G-S-eGFP(圖1B)。經(jīng)雙酶切鑒定，得到2條目的條帶分別為16 050和3 816 bp，與預(yù)期大小一致，即SARS-CoV-2重組VSV載體假病毒全長質(zhì)粒構(gòu)建正確(圖1D)。

2.2.3輔助質(zhì)粒的鑒定 輔助質(zhì)粒經(jīng)雙酶切鑒定，得到的條帶大小分別為5 428,1 269 bp(P3.1-VSV-N);5 428,798 bp(P3.1-VSV-P);5 428,1 576 bp(P3.1-VSV-L);5 428,6 330 bp(P3.1-VSV-G)。其中pcDNA3.1(+)載體的大小為5 428 bp,因此所得條帶大小與預(yù)期一致，即輔助質(zhì)粒P3.1-VSV-N、P3.1-VSV-P、P3.1-VSV-L、P3.1-VSV-G構(gòu)建正確(圖1C)。

A.VSV骨架cDNA克隆P3.1-VSV-eGFP質(zhì)粒圖譜；B.重組cDNA克隆P3.1-VSV△G-S-eGFP質(zhì)粒圖譜；C.P3.1-VSV-eGFP及輔助質(zhì)粒P3.1-VSV-N、P3.1-VSV-P、P3.1-VSV-G及P3.1-VSV-L酶切鑒定結(jié)果；D.P3.1-VSV△G-S-eGFP酶切鑒定結(jié)果；M1.Trans15K DNA Marker;1.P3.1-VSV-eGFP;2.P3.1-VSV-N;3.P3.1-VSV-P;4.P3.1-VSV-G;5.P3.1-VSV-L;M2.Trans5K DNA Marker;6.P3.1-VSV△G-S-eGFP

2.2 重組病毒VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP的拯救將全長質(zhì)粒P3.1-VSV-eGFP或P3.1-VSV△G-S-eGFP與輔助質(zhì)粒P3.1-VSV-N，P3.1-VSV-P，P3.1-VSV-L及P3.1-VSV-G共轉(zhuǎn)染BSR細(xì)胞48 h后，于倒置熒光顯微鏡下觀察，轉(zhuǎn)染后的BSR細(xì)胞出現(xiàn)明顯的合胞體并伴隨著綠色熒光(圖2A,B)。傳代至Vero E6細(xì)胞后，Vero E6細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的圓縮病變，并顯示綠色熒光(圖2D,E)。VSV△G-S-eGFP與母本病毒VSV-eGFP在BSR及Vero E6上引起的病變相似。結(jié)合傳代過程中出現(xiàn)的綠色熒光及細(xì)胞病變，判斷重組病毒VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP拯救成功。VSV-eGFP在所有孔中(6/6)均拯救成功，而VSV△G-S-eGFP在大部分孔中(4/6)拯救成功，即重組病毒拯救效率較高。

A.BSR細(xì)胞拯救VSV-eGFP 48 h(熒光，100×，合胞體形成如箭頭所示)；B.BSR細(xì)胞拯救VSV-eGFP 48 h(自然光，100×，合胞體形成如箭頭所示)；C.BSR細(xì)胞拯救VSV△G-S-eGFP 48 h(熒光，100×，合胞體形成如箭頭所示)；D.BSR細(xì)胞拯救VSV△G-S-eGFP 48 h(自然光，100×，合胞體形成如箭頭所示)；E.正常BSR細(xì)胞(自然光，100×)；F.E6細(xì)胞接毒VSV-eGFP F2代24 h(熒光，50×，細(xì)胞圓縮如箭頭所示)；I.E6細(xì)胞接毒VSV-eGFP F2代24 h(自然光，50×，細(xì)胞圓縮如箭頭所示)；J.E6細(xì)胞接毒VSV△G-S-eGFP F2代24 h(熒光，50×，細(xì)胞圓縮如箭頭所示)；K.E6細(xì)胞接毒VSV△G-S-eGFP F2代24 h(自然光，50×，細(xì)胞圓縮如箭頭所示)；L.正常E6細(xì)胞(自然光，50×)

2.3 重組病毒的生長動(dòng)力學(xué)曲線使用VSV-eGFP及VSV△G-S-eGFP感染Vero E6細(xì)胞后，根據(jù)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)收集病毒的TCID50繪制一步生長曲線。VSV-eGFP的最高生長滴度出現(xiàn)在36 h左右，生長滴度可達(dá)109.2TCID50/mL。由于重組了較大的外源基因，VSV△G-S-eGFP與母本病毒VSV-eGFP相比生長滴度有所降低，最高生長滴度出現(xiàn)在72 h左右，生長滴度可達(dá)106.8TCID50/mL(圖3)。

圖3 母本病毒VSV-eGFP及重組病毒VSV△G-S-eGFP的生長動(dòng)力學(xué)曲線

2.4 重組病毒的RT-PCR鑒定結(jié)果使用SARS-CoV-2-S特異性引物進(jìn)行RT-PCR鑒定時(shí)，VSV△G-S-eGFP組可在3 816 bp左右出現(xiàn)特異性條帶，經(jīng)測序所得序列與預(yù)期一致。而VSV-eGFP則不能出現(xiàn)特異性條帶(圖4)。上述結(jié)果表明重組病毒VSV△G-S-eGFP拯救成功。

2.5 重組病毒的Western blot鑒定結(jié)果VSV△G-S-eGFP組在180 kDa左右觀察到特異性條帶，而VSV-eGFP組未觀察到特異性條帶(圖5)。結(jié)果表明SARS-CoV-2的S蛋白在重組病毒VSV△G-S-eGFP中有效表達(dá)。

M.Trans5K DNA Marker;1.VSV△G-S-eGFP;2.VSV-eGFP

M.Thermo 26619 protein Marker;1.VSV△G-S-eGFP;2.VSV-eGFP

2.6 重組病毒的透射電鏡觀察結(jié)果母本病毒VSV-eGFP及重組病毒VSV△G-S-eGFP在電鏡下呈典型的子彈狀形態(tài)，粒子表面有纖突。重組病毒的直徑在200 nm左右，與文獻(xiàn)報(bào)道一致(圖6)。

圖6 重組病毒VSV-eGFP(A)及VSV△G-S-eGFP(B)的透射電鏡觀察(40 000×)

3 討論

自2019年COVID-19首次報(bào)道以來[22]，COVID-19疫苗及抗體藥物的研究迅速鋪展開來，截至2021年10月24日，已經(jīng)有128款COVID-19疫苗獲批進(jìn)入人類臨床試驗(yàn)階段，194款疫苗處于臨床前階段[23]。伴隨著多個(gè)SARS-CoV-2變異株的相繼出現(xiàn)，SARS-CoV-2變異株對于現(xiàn)有疫苗、抗體及藥物保護(hù)效力影響的研究是一項(xiàng)迫在眉睫的需要。然而，SARS-CoV-2的實(shí)驗(yàn)室研究需要在配備正壓呼吸器的生物安全三級(biosafety level 3,BSL3)實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行，而目前BSL3實(shí)驗(yàn)室數(shù)量有限，因此開發(fā)出能模擬SARS-CoV-2抗原表位的假病毒可作為一種替代模型，實(shí)現(xiàn)生物安全二級實(shí)驗(yàn)室(biosafety level 2,BSL2)條件下的SARS-CoV-2假病毒中和試驗(yàn)、病毒入侵抑制試驗(yàn)[16-17,24-25]。與HIV慢病毒系統(tǒng)包裝的SARS-CoV-2假病毒相比，慢病毒系統(tǒng)包裝的假病毒需要在使用前臨時(shí)制備，且易受細(xì)胞狀態(tài)等多方面因素的影響。而SARS-CoV-2重組VSV假病毒可大量儲(chǔ)備，使用方便。目前尚無SARS-CoV-2水貂變異株重組VSV載體假病毒的相關(guān)報(bào)道，因此，本研究拯救的SARS-CoV-2水貂變異株重組VSV載體假病毒，填補(bǔ)了國內(nèi)外空白，不僅可用于現(xiàn)有疫苗、抗體對SARS-CoV-2水貂變異株的中和能力評估，同時(shí)可用于針對水貂動(dòng)物群體的疫苗評估。

VSV載體假病毒的拯救依賴于VSV反向遺傳操作系統(tǒng)。pcDNA3.1(+)作為高效的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體，在狂犬病病毒的反向遺傳中表現(xiàn)出了比PCI載體更高的病毒拯救效率[26]，因此本研究選擇將VSV感染性克隆全長質(zhì)粒及輔助質(zhì)粒均構(gòu)建于pcDNA3.1 (+)載體上，由此確保更高的轉(zhuǎn)錄效率及病毒拯救效率。經(jīng)典的VSV拯救方法依賴于穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的牛痘病毒或T7輔助質(zhì)粒來增強(qiáng)病毒拯救過程中T7 RNA聚合酶的表達(dá)，提高病毒拯救效率[14-15]。該方法在后續(xù)傳代過程中需要通過反復(fù)過濾并加入阿拉伯糖苷等方式來抑制痘病毒的繁殖，且痘病毒與VSV之間的相互作用目前尚不明確，在重組較大的外源基因如SARS-CoV-2 S基因后病毒拯救及傳代十分困難[16,18]。本研究中無需痘病毒或T7輔助質(zhì)粒的摻入，將VSV感染性克隆構(gòu)建于高效的pcDNA3.1(+)哺乳動(dòng)物表達(dá)載體上，搭配使用穩(wěn)定表達(dá)T7 RNA聚合酶的BSR細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了對VSV的高效拯救。

使用SARS-CoV-2的S基因替換VSV骨架cDNA克隆中的G基因后，本研究構(gòu)建并拯救了VSV△G-S-eGFP這一攜帶綠色熒光標(biāo)簽的SARS-CoV-2水貂變異株重組VSV假病毒。通過對救獲病毒的生長動(dòng)力學(xué)曲線檢測、RT-PCR鑒定、Western bolt鑒定、透射電鏡觀察等技術(shù)，證實(shí)SARS-CoV-2重組VSV載體假病毒VSV△G-S-eGFP拯救成功。VSV△G-S-eGFP這一假病毒對于SARS-CoV-2水貂變異株血清學(xué)研究、抗體篩選、病毒入侵抑制類藥物篩選及疫苗誘導(dǎo)的中和抗體評估具有重要意義。