熒光探針PCR檢測(cè)牛嵴病毒的方法建立

師志海，王文佳，孟紅麗，王亞州，閆祥洲，邱祥琦，程 燕，滑留帥，施巧婷，徐照學(xué)*

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/鄭州市獸醫(yī)生物信息重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002；2.河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 動(dòng)物醫(yī)藥學(xué)院，河南 鄭州 450046)

腹瀉是導(dǎo)致犢牛死亡的主要原因，尤其對(duì)斷奶前犢牛影響最為顯著，給養(yǎng)牛業(yè)帶來巨大經(jīng)濟(jì)損失。腹瀉病因復(fù)雜，病毒、細(xì)菌[1]、寄生蟲和日常飼養(yǎng)等因素都可能引起犢牛腹瀉。牛嵴病毒(bovine kobuvirus，BKoV)可在健康犢牛的消化系統(tǒng)中存活，但近年來報(bào)道健康和腹瀉犢牛糞便中BKoV的檢出率差異較大[2]，提示BKoV與腹瀉可能存在一定關(guān)聯(lián)。

BKoV是小核糖核酸病毒科(Picornavirusfamily)、嵴病毒屬(Kobuvirusgenus)成員，為單股正鏈無包膜RNA病毒，基因組全長(zhǎng)約8.3 kb。2003年，BKoV U-1株首次在含10%犢牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)物中被鑒定[3]。目前，BKoV已在全球四大洲13個(gè)國家的糞便樣本中檢出[4]，表明BKoV已在世界范圍內(nèi)廣泛存在。我國西北地區(qū)、中部地區(qū)和東北地區(qū)等主要的牛養(yǎng)殖集群區(qū)也有BKoV流行[5]。BKoV是否能夠引起犢牛發(fā)生消化系統(tǒng)感染，目前尚無定論，但越來越多的研究證據(jù)表明BKoV可能是牛犢腹瀉的常見病原體之一[6]。有學(xué)者利用二代測(cè)序技術(shù)(next-generation sequencing，NGS)在11日齡持續(xù)低燒的犢牛腦脊液中檢測(cè)出BKoV，表明該病毒還可引起全身感染[7]。

目前，有關(guān)BKoV在我國牛群中的發(fā)病情況、致病性及分子流行特征等信息較為缺乏。本研究基于BKoV的3D基因，利用熒光探針建立快速檢測(cè)BKoV的方法，以期為BKoV在我國犢牛群中的流行現(xiàn)狀和與犢牛腹瀉的關(guān)聯(lián)探究提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 毒株及被檢樣品BKoV、牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛星狀病毒由本實(shí)驗(yàn)室保存。221份糞便樣本采集自河南地區(qū)出現(xiàn)腹瀉癥狀的犢牛，樣本置-80℃超低溫冰箱保存。

1.2 主要試劑及儀器病毒RNA提取試劑盒，cDNA一鏈合成試劑盒，pMD18-T載體，2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)等購自TaKaRa公司；質(zhì)粒小提試劑盒，購自寶生物工程有限公司。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，購自上海宏石醫(yī)療科技公司；梯度PCR儀，購自TaKaRa公司；超微量分光光度計(jì)，購自賽默飛世爾科技公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)及探針根據(jù)GenBank 登錄的BKoV基因系列，針對(duì)BKoV 3D基因的保守序列，設(shè)計(jì)特異性引物和熒光集團(tuán)標(biāo)記的探針(表1)，引物由擎科生物科技有限公司合成。

表1 BKoV引物及熒光探針序列

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立

1.4.1質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 用病毒RNA提取試劑盒提取糞便樣本中的RNA，并反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以cDNA為模板，使用“1.3”中上、下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收純化后克隆于pMD18-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD18T-3D，后經(jīng)PCR和測(cè)序鑒定。測(cè)序結(jié)果與GenBank中相關(guān)的核酸序列進(jìn)行Blast比對(duì)分析，將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒用超微量分光光度計(jì)測(cè)定濃度，將濃度換算成拷貝數(shù)，作為質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，放置于-80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2反應(yīng)條件優(yōu)化 將反應(yīng)退火溫度設(shè)置為56，57，58，59，60和61℃，選擇Ct值最小的溫度作為最佳退火溫度。將上、下游引物終濃度設(shè)置為0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 μmol/L，探針終濃度設(shè)置為0.05，0.10，0.20，0.25，0.30和0.40 μmol/L進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，選擇最佳的引物和探針終濃度。

1.4.3標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制 將質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取102～108拷貝/μL等不同濃度的質(zhì)粒作為模板，按照“1.4.2”優(yōu)化后的條件進(jìn)行PCR擴(kuò)增，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4特異性評(píng)價(jià) 以牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛星狀病毒為模板，利用本研究建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增，以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對(duì)照，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照，評(píng)價(jià)方法的特異性。

1.4.5敏感性評(píng)價(jià) 以濃度梯度為100～108拷貝/μL的質(zhì)粒為模板，利用本研究建立的方法和常規(guī)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，對(duì)比兩種方法的靈敏性。

1.4.6重復(fù)性評(píng)價(jià) 選取104～107拷貝/μL等4個(gè)不同濃度的質(zhì)粒為模板，利用建立的方法分別進(jìn)行組內(nèi)和組間擴(kuò)增，每個(gè)樣本設(shè)3個(gè)重復(fù)，計(jì)算Ct值的標(biāo)準(zhǔn)差和變異系數(shù)，評(píng)價(jià)方法的重復(fù)性。

1.5 臨床樣本的檢測(cè)利用本研究建立的方法和YAMASHITA等[3]建立的RT-PCR方法檢測(cè)221份臨床樣本，比較2種方法對(duì)BKoV的檢出率。

2 結(jié) 果

2.1 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備重組質(zhì)粒測(cè)序后經(jīng)BLAST檢索，為BKoV的 3D基因片段。經(jīng)測(cè)定，重組質(zhì)粒的質(zhì)量濃度為33.28 mg/L，計(jì)算得到其拷貝數(shù)為1.10×1010拷貝/μL。

2.2 PCR反應(yīng)體系及條件優(yōu)化選取濃度為1.10×105拷貝/μL的質(zhì)粒為模板進(jìn)行反應(yīng)體系優(yōu)化，當(dāng)引物和探針在反應(yīng)體系中的終濃度分別為0.2和0.1 μmol/L時(shí)，Ct值最小，擴(kuò)增效率較穩(wěn)定。反應(yīng)體系確定為20 μL：2×Premix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，探針(10 μmol/L)0.2 μL，模板2 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s并收集熒光信號(hào)，共40個(gè)循環(huán)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制重組質(zhì)粒在1.10×102～1.10×108拷貝/μL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(圖1)，回歸方程為y= -3.31x+40.987，R2=0.9998。

圖1 BKoV 102～108 拷貝/μL濃度模板標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性評(píng)價(jià)以牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒和牛星狀病毒的cDNA為模板，質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為陽性對(duì)照，ddH2O為陰性對(duì)照，利用本研究建立的方法分別檢測(cè)。結(jié)果顯示，僅BKoV有特異性擴(kuò)增曲線，其他病原及陰性對(duì)照無擴(kuò)增出現(xiàn)(圖2)。

2.5 敏感性評(píng)價(jià)以濃度梯度為1.10×100～1.10×108拷貝/μL的質(zhì)粒為模板，利用本研究建立的方法進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，該方法和常規(guī)PCR對(duì)BKoV的最低檢出限分別為 11.0 拷貝/μL(圖3A)和1.10×102拷貝/μL(圖3B)，表明該檢測(cè)方法更靈敏。

1.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品，1.10×106 拷貝/μL；2～6.牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛星狀病毒和ddH2O

1～9.質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為1.10×108～1.10×100 拷貝/μL；10.陰性對(duì)照

2.6 重復(fù)性評(píng)價(jià)以1.10×104～1.10×107拷貝/μL等4個(gè)濃度的質(zhì)粒為模板，分別進(jìn)行組內(nèi)和組間PCR擴(kuò)增。結(jié)果顯示，組內(nèi)Ct值變異系數(shù)為0.26%～0.50%，組間Ct值變異系數(shù)為0.71%～1.91%，均在2.0%以下(表2)，表明該檢測(cè)方法重復(fù)性較好。

表2 重復(fù)性試驗(yàn)擴(kuò)增結(jié)果

2.7 臨床樣品的檢測(cè)本試驗(yàn)所建方法檢出BKoV的樣品數(shù)為20份，檢出率為9.05%，YAMASHITA等[3]所建方法檢出BKoV陽性樣品數(shù)17份，檢出率為7.69%，本試驗(yàn)所建方法可用于對(duì)臨床樣本的檢測(cè)(表3)。

表3 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 討 論

腹瀉是犢牛的常見綜合征，可引起犢牛死亡，斷奶前犢牛尤為顯著[8]，死亡率高達(dá)58%[9]，給養(yǎng)牛業(yè)帶來極大的經(jīng)濟(jì)損失。BKoV自2003年被發(fā)現(xiàn)以來，一直廣受關(guān)注，因健康犢牛和腹瀉犢牛的糞便中均可檢出BKoV，故其是否直接導(dǎo)致犢牛腹瀉，目前尚無定論。相關(guān)報(bào)道指出腹瀉犢牛糞便中BKoV的檢出率要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于健康犢牛糞便中的檢出率[2,10-12]，提示BKoV極有可能參與了腹瀉的致病和發(fā)展進(jìn)程；且在腹瀉犢牛中BKoV作為單一病原被檢出[13]，也提示BKoV可能是引起犢牛腹瀉的病毒性病原之一。但由于BKoV目前尚無建立成熟的細(xì)胞培養(yǎng)模型，加之相關(guān)動(dòng)物試驗(yàn)數(shù)據(jù)的空白，無法從體內(nèi)、體外兩個(gè)方面確定BKoV在犢牛腹瀉的病程演變中扮演何種角色，后續(xù)BKoV的分離純化和對(duì)其致病性的研究亟需進(jìn)行。

目前，RT-PCR仍然是各國檢測(cè)BKoV的主流技術(shù)，擴(kuò)增的靶序列主要為3D[2,11,14-15]、VP1[10,16]、VP0[10]等基因的部分序列或全長(zhǎng)；WANG等[4]通過構(gòu)建核酸文庫利用NGS技術(shù)從犢牛糞便樣本中檢測(cè)BKoV，并獲得IL35164毒株的全基因組序列，但該技術(shù)經(jīng)濟(jì)成本頗高，且對(duì)采樣及樣品運(yùn)輸?shù)冗^程要求較高，并不適用于臨床大批量樣本的檢測(cè)。另外，迄今為止除日本U-1株成功分離外，尚無其他BKoV毒株成功分離的報(bào)道。盡管SAVARD等[13]應(yīng)用熒光定量探針法檢測(cè)BKoV，與本研究類似，但前者擴(kuò)增片段為114 bp，本研究設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增目的片段僅為60 bp，目的片段較前者更短，擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間也更短，且前者擴(kuò)增的靶序列與本研究靶序列核苷酸相似性較低；目前世界范圍內(nèi)已報(bào)道的熒光定量探針法檢測(cè)BKoV的方法僅有前者一種，故本研究建立的BKoV熒光定量檢測(cè)方法豐富了該研究領(lǐng)域。

盡管BKoV 能否直接引起犢牛腹瀉尚無定論，且目前市場(chǎng)上也無有效疫苗對(duì)其進(jìn)行有效防疫，另外臨床檢測(cè)發(fā)現(xiàn)BKoV常與其他犢牛腹瀉病原如牛冠狀病毒、牛輪狀病毒、牛病毒性腹瀉病毒、牛環(huán)曲病毒等[10-11,13]混合感染，加重腹瀉的程度。所以及時(shí)盡早檢測(cè)病原，并進(jìn)行有效凈化，仍舊是防控BKoV的主要手段。本研究使用熒光探針對(duì)BKoV進(jìn)行定量檢測(cè)，其對(duì)BKoV的最低檢出量為11.0 拷貝/μL，靈敏性高，為BKoV的快速檢測(cè)和流行情況探查提供了新的實(shí)驗(yàn)室手段。