熱損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞對巨噬細(xì)胞極化的影響

張玲琴, 謝建剛, 王倩梅, 徐云云, 黃 楊

熱射病即重癥中暑，是由于暴露在高溫高濕環(huán)境中導(dǎo)致身體核心溫度迅速升高，超過40 °C，伴有皮膚灼熱、意識障礙(如譫妄、驚厥、昏迷)等多器官系統(tǒng)損傷的嚴(yán)重臨床綜合征[1]。熱射病相關(guān)炎癥反應(yīng)類似于全身炎癥反應(yīng)綜合征(systemic inflammatory response syndrome, SIRS)，導(dǎo)致臨床狀態(tài)迅速惡化，導(dǎo)致彌散性血管內(nèi)凝血、急性肺損傷、多器官功能障礙綜合征和死亡[2]。熱射病SIRS具有特殊性和復(fù)雜性，是一種由細(xì)胞熱毒性、組織缺血缺氧及內(nèi)毒素血癥共同導(dǎo)致的劇烈免疫反應(yīng)，并伴隨著內(nèi)皮細(xì)胞的廣泛參與。正確認(rèn)識熱射病SIRS的特點(diǎn)，及時予以干預(yù)措施，阻斷SIRS進(jìn)一步發(fā)展在熱射病治療中亟需引起重視[3-5]。研究表明，熱射病時免疫細(xì)胞的增加和功能調(diào)控可能與內(nèi)皮細(xì)胞激活/功能障礙導(dǎo)致有關(guān)[6]。我們前期通過熱射病患者外周血單個核細(xì)胞測序，利用生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)趨化因子5(chemokine ligand 5，CCL5)基因上調(diào)可能是熱射病預(yù)后的關(guān)鍵基因[7]。因此，本研究擬通過建立內(nèi)皮細(xì)胞熱損傷模型觀察內(nèi)皮CCL5是否對巨噬細(xì)胞功能有一定調(diào)控作用，以期對熱射病SIRS的形成進(jìn)一步闡釋，對熱射病臨床靶向治療提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1材料 小鼠巨噬細(xì)胞系(RAW264.7)細(xì)胞、小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(MPVECs)細(xì)胞均由空軍軍醫(yī)大學(xué)免疫學(xué)教研室饋贈。CO2恒溫培養(yǎng)箱購自美國熱電公司；超微量核酸分析儀購自杭州奧盛儀器有限公司；安捷倫Mx3005P實(shí)時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)儀購自Agilengt公司；Western blot電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司；全自動酶標(biāo)儀購自Therm Scienctific公司；SH800流式細(xì)胞儀購自日本索尼公司；定量PCR常規(guī)引物合成由陜西擎科生物公司合成；RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、定量PCR試劑盒購自北京Genestat公司；ELISA試劑盒購自北京中杉金橋生物公司；胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基購自美國Gibico公司。馬拉韋羅(UK-427857，Maraviroc)購自美國MCE公司。

1.2方法

1.2.1 細(xì)胞常規(guī)處理 從液氮中取出RAW264.7細(xì)胞、MPVECs細(xì)胞并37 ℃水浴快速復(fù)蘇，用含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基在恒溫37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培育。

1.2.2 熱處理細(xì)胞模型建立 培養(yǎng)MPVECs細(xì)胞至對數(shù)生長期，消化細(xì)胞并計數(shù)，取適量細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)過夜。放入恒溫40 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中處置1.5、3、6 h作為實(shí)驗(yàn)組，未熱處理細(xì)胞作為對照組，完成內(nèi)皮細(xì)胞熱處理模型的構(gòu)建。顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，胰酶消化后充分混勻細(xì)胞，取100 μL進(jìn)行臺盼藍(lán)染色并計算細(xì)胞活性。其余細(xì)胞800 r/min離心5 min后吸取上清200 μL，ELISA檢測培養(yǎng)上清中CCL5的含量。根據(jù)細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活力和CCL5含量，選取熱處理時間。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.3 內(nèi)皮細(xì)胞熱處理上清刺激RAW264.7細(xì)胞 選定熱處理時間后，將MPVECS細(xì)胞熱處理后，2000 g離心20 min，留取上清后利用0.22 μm濾器過濾備用。吸棄RAW264.7細(xì)胞培養(yǎng)液，換MPVECs細(xì)胞培養(yǎng)上清，根據(jù)加入MPVECs細(xì)胞培養(yǎng)上清的差異分為對照組(37 ℃培養(yǎng)上清)、處理組(40 ℃熱處理培養(yǎng)上清)、干預(yù)組[40 ℃熱處理培養(yǎng)上清+趨化因子5受體(chemokine receptor 5，CCR5)阻斷劑Maraviroc 200 μg/mL]，將三組RAW264.7細(xì)胞在恒溫37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h，收取細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測巨噬細(xì)胞M1/M2極化 各組培養(yǎng)6 h后收取細(xì)胞，吸棄培養(yǎng)上清，用預(yù)冷的流式洗液洗滌后，小心刮取細(xì)胞，使用CD11b、CD206抗體避光染色30 min，再次洗滌后上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，所得結(jié)果使用FlowJo軟件進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

1.2.5 實(shí)時定量PCR檢測RAW264.7細(xì)胞白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的mRNA表達(dá) 各組培養(yǎng)6 h后收取細(xì)胞，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄，按以下反應(yīng)體系將相應(yīng)試劑加入0.1 mL熒光定量PCR 8聯(lián)管：反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物1 μL，前后引物各0.5 μL，SYBR Green 5 μL，無RNA酶去離子水3 μL。樣本加好后，按以下方法設(shè)置兩步法反應(yīng)程序：95 ℃持續(xù)2 min，模板變性；(95 ℃持續(xù)10 s，53 ℃持續(xù)15 s)×40次循環(huán)。按照2-△△Ct公式處理各組CT值并計算相對定量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。

2 結(jié)果

2.1熱處理3 h的培養(yǎng)上清適合用于刺激RAW264.7細(xì)胞 MPVECs細(xì)胞放入恒溫40 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中處置1.5、3、6 h，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果顯示，1.5、3 h組細(xì)胞透明度良好，折光性強(qiáng)，細(xì)胞輪廓不清晰，胞質(zhì)空泡較少，6 h組細(xì)胞透明度一般，折光性較差，細(xì)胞輪廓清晰，胞質(zhì)空泡較多(見圖1A)；行臺盼藍(lán)染色并計算細(xì)胞活性發(fā)現(xiàn)，1.5、3 h組細(xì)胞活性較好，6 h組細(xì)胞活性稍差(見圖1B)；ELISA檢測培養(yǎng)上清CCL5含量發(fā)現(xiàn)，3、6 h組CCL5含量較1.5 h組升高(見圖1C)。MPVECs細(xì)胞40 ℃熱處理3 h，細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞活性和培養(yǎng)上清CCL5含量均較好，適合作為熱處理截止時間。

注：CCL5為趨化因子5；與0 h組比較，*P<0.05，**P<0.01

2.2各組RAW264.7細(xì)胞M1極化情況 各組細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞染色及檢驗(yàn)，結(jié)果表明，與對照組比較，處理組和干預(yù)組M1極化比例均明顯上升，而阻斷CCR5后干預(yù)組較處理組M1極化明顯下降(P=0.002)。見圖2。

注：CD11c為白細(xì)胞分化抗原11c，巨噬細(xì)胞M1極化標(biāo)志；CD206為白細(xì)胞分化抗原206，巨噬細(xì)胞M2極化標(biāo)志；與對照組比較，*P<0.01；與處理組比較，#P<0.01

2.3各組RAW264.7細(xì)胞IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)和培養(yǎng)上清IL-1β、IL-6、TNF-α含量檢測 實(shí)時定量PCR檢測各組RAW264.7細(xì)胞炎癥因子的mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，處理組IL-1β、IL-6、TNF-α的mRNA表達(dá)較對照組明顯升高，干預(yù)組較處理組下降。ELISA檢測各組細(xì)胞因子表達(dá)發(fā)現(xiàn)，處理組IL-1β、IL-6、TNF-α含量明顯高于對照組(P<0.01)。其中干預(yù)組IL-1β明顯低于處理組(P<0.01)，且基本下降到對照組的水平(P>0.05)。干預(yù)組的IL-6雖高于對照組(P>0.05)，但明顯低于處理組(P<0.05)。TNF-α含量在干預(yù)組與處理組中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3。

注：IL-1β為白細(xì)胞介素-1β；IL-6為白細(xì)胞介素-6；TNF-α為腫瘤壞死因子-α；與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01；與處理組比較，△P<0.05，△△P<0.01

3 討論

趨化因子CCL5屬于CC趨化因子家族的成員，具有介導(dǎo)免疫細(xì)胞定向趨化的作用[8]，其受體有3個，分別是CCR1、CCR3和CCR5，其中以CCL5與CCR5的親和力最強(qiáng)，構(gòu)成了CCL5/CCR5生物軸[9]。在炎性反應(yīng)中，CCL5與配體特異結(jié)合，激活下游G蛋白，導(dǎo)致胞內(nèi)鈣離子濃度增加，進(jìn)一步活化蛋白激酶C，產(chǎn)生相應(yīng)免疫細(xì)胞的募集并激活免疫反應(yīng)[10]。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)勞力性熱射病預(yù)后不良患者外周血單個核細(xì)胞CCL5基因表達(dá)水平和血漿CCL5含量較對照組患者明顯升高，且與IL-6、PCT、CRP等促炎因子的表達(dá)正相關(guān)，強(qiáng)烈提示CCL5可能調(diào)控免疫細(xì)胞功能促進(jìn)熱射病SIRS的發(fā)生發(fā)展[7]。

趨化因子CCL5與其受體CCR5組成的通路軸參與各種病理過程，包括炎癥、慢性疾病、癌癥以及新型冠狀病毒感染(COVID-19)[11]。一項對COVID-19相關(guān)的免疫反應(yīng)和機(jī)制研究表明，CCL5/CCR5軸促進(jìn)了免疫細(xì)胞活化及炎癥損傷[12]?？?CCR5 化合物Maraviroc 是第一個獲得 FDA 批準(zhǔn)的趨化因子受體靶向藥物[13]，在對抗COVID-19引起的細(xì)胞因子風(fēng)暴中Maraviroc發(fā)揮出了意想不到的良好效果[14]。但是目前尚無阻斷CCL5/CCR5軸在熱射病中的研究報道。熱射病發(fā)生時廣泛的內(nèi)皮細(xì)胞尤其是血管內(nèi)皮細(xì)胞首先受到損傷[15]，血管內(nèi)皮細(xì)胞TLR4受體激活后促進(jìn)CCL5等細(xì)胞因子的合成和釋放[16]。CCL5的受體CCR5主要在巨噬細(xì)胞表面分布，血管內(nèi)皮釋放的CCL5可能與巨噬細(xì)胞表面的CCR5結(jié)合，調(diào)控巨噬細(xì)胞功能，參與熱射病免疫調(diào)控過程。

為了驗(yàn)證血管內(nèi)皮細(xì)胞來源的CCL5是否通過CCR5調(diào)控巨噬細(xì)胞功能，本研究設(shè)計了利用熱處理后的血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清刺激巨噬細(xì)胞，觀察巨噬細(xì)胞功能的相關(guān)實(shí)驗(yàn)。首先，發(fā)現(xiàn)40 ℃熱處理血管內(nèi)皮細(xì)胞3 h細(xì)胞形態(tài)好、細(xì)胞活性高，且培養(yǎng)上清CCL5含量明顯上升，適合作為熱處理截止時間。其次，建立共培養(yǎng)體系刺激巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞明顯向促炎的M1型極化，并且促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)明顯升高。巨噬細(xì)胞極化為M1型起促炎作用，可以釋放大量的促炎細(xì)胞因子，擴(kuò)大加重炎癥，而巨噬細(xì)胞極化為M2型起抑炎作用，局限減輕炎癥[17]。為了驗(yàn)證血管內(nèi)皮細(xì)胞熱損傷后釋放的CCL5是否是促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1型極化的關(guān)鍵，本研究通過使用Maraviroc，靶向阻斷CCL5/CCR5軸，發(fā)現(xiàn)阻斷后巨噬細(xì)胞M1極化和促炎細(xì)胞因子表達(dá)均明顯下降，尤其IL-1β基本下降到正常對照組的水平，提示血管內(nèi)皮細(xì)胞熱損傷后釋放的CCL5是促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化的關(guān)鍵。CCL5對巨噬細(xì)胞的作用研究既往在腫瘤中開展較多，其在癌細(xì)胞增殖、抗凋亡、抗藥性、遷移和侵襲中有不同的作用[18-20]。最近也有研究發(fā)現(xiàn)，CCL5 是巨噬細(xì)胞極化中的新型先天免疫調(diào)節(jié)劑，促進(jìn)巨噬細(xì)胞向M1極化，導(dǎo)致了藥物性肝損傷[21]。而另一項關(guān)于輻射誘導(dǎo)食道癌細(xì)胞的研究發(fā)現(xiàn)，上調(diào) CCL5 表達(dá)促進(jìn)THP-1 衍生的巨噬細(xì)胞向 M2 亞型極化，從而增強(qiáng)細(xì)胞轉(zhuǎn)移[22]。對巨噬細(xì)胞極化作用的差異可能與機(jī)體狀態(tài)有關(guān)。本研究通過監(jiān)測M1極化相關(guān)的炎癥因子表達(dá)發(fā)現(xiàn)，熱處理血管內(nèi)皮細(xì)胞上清可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β、IL-6、TNF-α，利用Maraviroc阻斷CCL5/CCR5途徑明顯減少IL-1β的表達(dá)，但TNF-α含量無明顯變化。這些變化可能與血管內(nèi)皮細(xì)胞熱損傷時分泌其他趨化因子及膜糖蛋白脫落有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。

總之，通過研究發(fā)現(xiàn)熱處理血管內(nèi)皮細(xì)胞可以釋放CCL5促進(jìn)巨噬細(xì)胞M1極化，并促進(jìn)IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌，使用Maraviroc阻斷CCL5/CCR5途徑可以抑制巨噬細(xì)胞M1極化和促炎細(xì)胞因子IL-1β、IL-6的分泌。使用Maraviroc靶向CCL5/CCR5軸可能對熱射病SIRS防治有一定作用。