注射用頭孢硫脒雜質(zhì)譜分析及質(zhì)量控制

崇小萌 田冶 劉穎 姚尚辰 尹利輝 許明哲

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

頭孢硫脒是由我國自行研制并首先應用于臨床的半合成頭孢菌素[1]，作為第1代頭孢菌素，頭孢硫脒對革蘭陽性菌作用較強，尤其對葡萄球菌和腸球菌具有很強的抗菌活性，臨床應用較為廣泛[2-3]。穩(wěn)定性實驗結(jié)果顯示注射用頭孢硫脒具有較好的化學穩(wěn)定性及物理穩(wěn)定性[4]。

頭孢硫脒的合成路線主要有兩種，第一種為以7-ACA為起始原料，在低溫、堿性條件下與溴乙酰溴反應制得溴乙酰7-ACA，再與N,N'-二異丙基硫脲在三乙胺存在下制得，第二條是先由N,N'-二異丙基脲基-2-硫代乙酸鹽酸鹽與Vilsmeier試劑作用制得活性酯，再將活性酯與帶有硅基保護基的7-ACA反應制得[5]。合成路線不同、生產(chǎn)工藝參數(shù)不同會導致終產(chǎn)品中所含有的雜質(zhì)種類不同，因此通過分析產(chǎn)品中的雜質(zhì)譜情況可初步判斷生產(chǎn)廠家所采用的工藝路線及參數(shù)是否合理，對產(chǎn)品中雜質(zhì)的分析與控制是質(zhì)量控制的重點。藥物雜質(zhì)譜表征存在于藥品中的所有已知雜質(zhì)和未知雜質(zhì)的種類和含量[6]，其與藥物生產(chǎn)的工藝路線、原輔料屬性、工藝參數(shù)等密切相關(guān)，目前在仿制藥注冊、原料藥產(chǎn)地變更、補充申請藥品注冊標準等方面已被予以高度關(guān)注[7-9]。對頭孢硫脒原料中部分雜質(zhì)分析已有文獻報道[10-11]，但對注射用頭孢硫脒中雜質(zhì)譜的系統(tǒng)分析尚未見文獻報道，本文在對4個廠家10批頭孢硫脒原料以及12個廠家143批注射用頭孢硫脒的雜質(zhì)進行分析的基礎(chǔ)上，總結(jié)出注射用頭孢硫脒特征雜質(zhì)譜，并對各雜質(zhì)進行了定性分析，探索雜質(zhì)與生產(chǎn)工藝及關(guān)鍵質(zhì)控點的相關(guān)性，為工藝路線、產(chǎn)品質(zhì)量評價提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品與試劑

頭孢硫脒原料：4廠家10批；注射用頭孢硫脒：12廠家143批。

十二水合磷酸氫二鈉: 國藥集團化學試劑有限公司，20130427，≥99.0%；一水合檸檬酸：國藥集團化學試劑有限公司，20160108，≥99.8%；頭孢硫脒對照品：中國食品藥品檢定研究院，130523-201203，99.0%。

2 檢測方法

2.1 HPLC法測定有關(guān)物質(zhì)

液相色譜儀：Agilent1200 infinity Series，工作站：Agilent OpenLab2.3。

色譜柱：Kromasil 100-5C18(4.6 mm×250 mm 5 μm)；流動相：磷酸鹽緩沖液(取無水磷酸氫二鈉2.76 g，檸檬酸1.29 g，加水溶解并稀釋成1000 mL)-乙腈(86:14)。流速：1.0 mL/min；檢測器：紫外PDA；檢測波長：254 nm；柱溫：30℃；進樣器溫度：4℃；進樣體積：10 μL。

2.2 LC-MS方法確認雜質(zhì)結(jié)構(gòu)

2.2.1 采用柱切換HPLC-MS方法

3201 S1-2雙元泵，3202 S1-2真空脫氣機，3014 S1-2柱溫箱，3012 S1-2柱切換系統(tǒng)，3133 S1-2自動進樣器，以上來自SHISEIDO(Tokyo, Japan), Accela二極管陣列檢測器(Thermo Fisher Scientific Inc.,Massachusetts, USA)；3200Q TRAP質(zhì)譜儀(Applied Biosystems Inc., California, USA)；工作站為Analyst?軟件(version 1.6.2)。

色譜柱為Capcell Pak MGⅡC18(150 mm× 4.6 mm，5 μm)；切換閥：六通閥A和B；切換用定量環(huán)體積：500 μL；流動相：C相： 含有1%甲酸的水溶液；D相：乙腈-1%甲酸溶液；梯度洗脫[0 min(100%C～0 B)；5.5 min (100%C～0 D)；25 min(0 C～100%D)；30min (0 C～100%D)]。MS參數(shù)：ESI離子源，二級質(zhì)譜掃描，掃描范圍：100～1000Da；氣簾氣：20 L/h，電離電壓：+5000 V；離子源溫度：400.00℃；吹掃氣1：60 L/h；吹掃氣2：60 L/h；碰撞誘導解離：中等；解簇電壓：+30.0 V；入口電壓：+6.0 V；碰撞電源：+62.00 V；碰撞電壓：35 V，出口電壓：+3.00 V。

2.2.2 采用柱切換HPLC-MS方法

Thermal QExactive Focus高分辨質(zhì)譜儀；Dionex U3000 雙三元液相色譜儀。DIANOX P680A 二維液相色譜系統(tǒng)。

色譜柱為Capcell Pak MGⅡC18(150 mm× 4.6 mm,5 μm)；切換閥：六通閥A和B；切換用定量環(huán)體積：500 μL；流動相：C相： 含有1%甲酸的水溶液；D相：乙腈-1%甲酸溶液；梯度洗脫 [0 min(100%C～0 B)；5.5min(100%C～0 D)；25 min(0 C～100%D)；30 min (0 C～100%D)]。LC-MSn質(zhì)譜方法：掃描電壓(+)3000.0V，毛細管溫度(+)350.0℃，鞘氣(+)35L/h，輔助氣(+)10.00L/h，最大噴霧電流(+)100.00，探針加熱器溫度(+)350.00℃，S-棱鏡RF水平50.00，離子源為HESI，掃描范圍：100～1000 Da；一級質(zhì)譜方法：正離子模式，分辨率70000，二級質(zhì)譜方法：分辨率17500；分離窗口：3.0m/z；(N)CE: 10V；缺省電荷狀態(tài)：1。

2.3 粉末X-衍射測定原料晶型

Rigaku Smartlab粉末X-射線衍射儀。陽極靶:Cu；電壓及電流：45 kV，200 mA；單色儀：Ni濾光片；檢測器：D/teX Ultra 250一維陣列檢測器；掃描范圍：2θ＝3°～60°；掃描間隔：0.01°；掃描速度：8°/min；狹縫系統(tǒng)：Soller Slit：5.0°；IS：1/2°；ISL：10.0 mm；RS1：20.0 mm ；RS2：20.0 mm。制樣方法：取供試品約100 mg，置載樣玻璃片上，用玻璃板正壓法制片。

2 結(jié)果與討論

2.1 頭孢硫脒原料有關(guān)物質(zhì)分析

對4個廠家頭孢硫脒原料進行分析，其典型色譜圖如圖1所示，由圖中可知，頭孢硫脒原料中共檢出6種主要雜質(zhì)，其中雜質(zhì)1為各廠家最大單個雜質(zhì)。每個廠家所含雜質(zhì)種類不同，有2個廠家的原料不含雜質(zhì)2和雜質(zhì)5，只有1個廠家的原料含有雜質(zhì)6。

2.2 注射用頭孢硫脒有關(guān)物質(zhì)分析

對12廠家143批注射用頭孢硫脒有關(guān)物質(zhì)進行HPLC分析，其典型色譜圖如圖2所示，全部樣品中共檢出6種主要雜質(zhì)，與原料一致，可見注射用頭孢硫脒中的主要雜質(zhì)均來自原料，在制劑生產(chǎn)過程中并未引入新的雜質(zhì)。其中，雜質(zhì)1、雜質(zhì)3和雜質(zhì)4含量較高，雜質(zhì)1為各廠家制劑中最大單個雜質(zhì)；雜質(zhì)2和雜質(zhì)5的含量較低，樣品中這兩種雜質(zhì)均小于0.1%，部分樣品中不含有雜質(zhì)2和雜質(zhì)5。143批樣品中僅有13批樣品含有雜質(zhì)6，且含量均小于0.1%，13批樣品均來自同一廠家，但此廠家其余27批樣品中未檢出雜質(zhì)6，造成此結(jié)果的原因可能是由于所采用的原料生產(chǎn)工藝不穩(wěn)定。各雜質(zhì)在樣品中的含量分布見圖3。

頭孢硫脒原料及注射用頭孢硫脒中均未檢出中國藥典中的雜質(zhì)C(頭孢硫脒?；铫?即溴乙酰-7-ACA(含量低于0.05%)，雜質(zhì)C為頭孢硫脒合成過程中的中間產(chǎn)物(合成路線如圖4所示)，文獻報道[12]，控制調(diào)節(jié)溴乙酰-7-ACA與N,N'-二異丙基硫脲反應時的溫度可有效地降低溴乙酰-7-ACA的殘留，再進一步精制可使其含量再降低，說明目前各廠家原料合成過程中初始原料的配比以及反應條件控制得更精確，工藝更優(yōu)化。

3 雜質(zhì)結(jié)構(gòu)確證

采用柱切換LC-MS方法，對注射用頭孢硫脒樣品中全部6種雜質(zhì)結(jié)構(gòu)進行了確證。

3.1 雜質(zhì)1結(jié)構(gòu)確證

雜質(zhì)1的+EMS圖及+EPI@m/z431.3[M+H]+的二級質(zhì)譜如圖5所示，由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知，該雜質(zhì)的[M+H]+峰為431.0，分子量為430.0；根據(jù)EPI碎片離子，推測裂解途徑如圖6所示，推測雜質(zhì)1為頭孢硫脒3位側(cè)鏈脫去乙酰基后形成的降解雜質(zhì)，即去乙酰頭孢硫脒。

3.2 雜質(zhì)2結(jié)構(gòu)確證

雜質(zhì)2的+EMS圖及+EPI@m/z431.2[M+H]+的二級質(zhì)譜如圖7所示，該質(zhì)譜圖中存在m/z431.0[M+H]+峰以及m/z452.9[M+Na]+峰，因此推斷其分子量為430.0；根據(jù)分子量，初步判斷該雜質(zhì)可能為雜質(zhì)1的同分異構(gòu)體(包括Δ-3異構(gòu)和7S異構(gòu))以及去乙酰氧頭孢硫脒的亞砜異構(gòu)體。

質(zhì)譜圖中存在m/z201.2、m/z159.2以及m/z117.2的碎片峰，說明雜質(zhì)分子中含有與頭孢硫脒相同的7位側(cè)鏈；存在m/z258.2的碎片峰，說明發(fā)生了頭孢類化合物典型的A型裂解，進一步說明該雜質(zhì)含有與頭孢硫脒相同的7位側(cè)鏈；而對于m/z313.1碎片離子裂解途徑的推斷可以判定該雜質(zhì)不是去乙酰氧頭孢硫脒的亞砜異構(gòu)體，推測裂解途徑如圖8所示。

比較雜質(zhì)1和雜質(zhì)2的紫外光譜圖(圖9)可知，兩個雜質(zhì)的最大吸收波長一致，推斷兩個雜質(zhì)的共軛結(jié)構(gòu)一致，故初步推斷雜質(zhì)2為雜質(zhì)1的7S異構(gòu)體，該雜質(zhì)屬于頭孢硫脒的降解產(chǎn)物。在注射用頭孢硫脒的一些部頒標準中需要控制氯乙酰-7-ACA(頭孢硫脒酰化物Ⅱ)，該雜質(zhì)相對頭孢硫脒的保留時間為0.4，與雜質(zhì)2一致，在進行檢驗中容易將雜質(zhì)2誤判為頭孢硫脒?；铫?，通過此次質(zhì)譜分析，明確了該雜質(zhì)結(jié)構(gòu)，確定了頭孢硫脒原料及制劑中均未檢出頭孢硫脒?；铫颉５谀壳爸袊幍?015年版頭孢硫脒有關(guān)物質(zhì)分析的色譜方法中，無法準確區(qū)分雜質(zhì)2和頭孢硫脒酰化物Ⅱ。

3.3 雜質(zhì)3結(jié)構(gòu)確證

雜質(zhì)3的+EMS圖及+EPI@m/z415.2[M+H]+的二級質(zhì)譜如圖10所示，由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知，該雜質(zhì)的[M+H]+峰為415.1，推測其分子量為414.1；根據(jù)EPI碎片離子，推測裂解途徑如圖11所示，推測雜質(zhì)3為頭孢硫脒3位側(cè)鏈脫去乙酰氧基的降解雜質(zhì)，即去乙酰氧頭孢硫脒。

3.4 雜質(zhì)4結(jié)構(gòu)確證

雜質(zhì)4的+EMS圖及+EPI@m/z413.3[M+H]+的二級質(zhì)譜圖如圖12所示，由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知，該雜質(zhì)的[M+H]+峰為413.3，推測其分子量為412.3，其裂解規(guī)律與雜質(zhì)3類似，推測裂解途徑如圖13所示，推測雜質(zhì)4為頭孢硫脒內(nèi)酯。

3.5 雜質(zhì)5結(jié)構(gòu)確證

雜質(zhì)5的+EMS圖及+EPI@m/z489.0[M+H]+的二級質(zhì)譜圖如圖14所示，由該雜質(zhì)的質(zhì)譜圖可知，該雜質(zhì)的[M+H]+峰為489.1，推測其分子量比頭孢硫脒多了16Da，說明雜質(zhì)5比頭孢硫脒多了一個氧原子。進一步的二級質(zhì)譜分析表明，存在m/z429.0的脫3位側(cè)鏈特征碎片峰，推斷該氧原子在母核或7位側(cè)鏈上，二級質(zhì)譜圖中存在m/z201.1、159.1和117.1 3個7-位側(cè)鏈特征碎片峰，故氧原子不在7-位側(cè)鏈上而是在母核上，初步推斷為母核6元雜環(huán)中的硫原子形成亞砜，此雜質(zhì)屬于頭孢硫脒合成過程中的工藝雜質(zhì)。裂解途徑如圖15所示。

3.6 雜質(zhì)6結(jié)構(gòu)確證

由于雜質(zhì)6在質(zhì)譜中不易電離，我們采用了QExactive Focus高分辨質(zhì)譜儀對雜質(zhì)6進行柱切換分析。其一級質(zhì)譜圖如圖16所示，在一級質(zhì)譜圖中，豐度較高的3個離子峰(m/z為489.91、412.86和384.87)均有同位素峰，且同位素豐度比為1:2:1，推斷這些離子峰中均含有2個Br原子。m/z為489.91的離子其二級質(zhì)譜圖如圖17所示，由圖中可知，其二級質(zhì)譜包括了m/z為412.86和384.87的碎片離子，兩個碎片離子與m/z為489.91的離子相差77.05和105.04，根據(jù)頭孢硫脒裂解規(guī)律，此應為脫去3位側(cè)鏈產(chǎn)生的碎片離子，故推測此化合物3位側(cè)鏈與頭孢硫脒相同；此化合物并未產(chǎn)生頭孢硫脒7位側(cè)鏈特征碎片離子(m/z201、159和117)，故推測此化合物7位側(cè)鏈也與頭孢硫脒不同；在二級質(zhì)譜圖中，產(chǎn)生了m/z156.01的碎片離子，此離子為頭孢硫脒母核進行A裂解后的典型碎片離子，故推測此化合物可能與頭孢硫脒具有相同的母核結(jié)構(gòu)。此化合物[M+H]+峰為偶數(shù)，故此化合物含氮原子數(shù)目與頭孢硫脒不相同。綜合上述結(jié)果，初步推斷此化合物為頭孢硫脒原料中的工藝雜質(zhì)。經(jīng)調(diào)研，原料中含有此雜質(zhì)的生產(chǎn)廠家所采用的合成路線與其它廠家是一致的，可能是合成反應過程中某個參數(shù)控制不當，造成了含溴中間體的產(chǎn)生，或者是合成的物料純度不高，含有此雜質(zhì)。

4 關(guān)鍵指針雜質(zhì)的確定

綜上所述，通過對頭孢硫脒原料及注射用頭孢硫脒中雜質(zhì)譜的分析，對全部6種雜質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行了確證，對其來源進行了分析，結(jié)果見表1。

表1 6種主要雜質(zhì)名稱、來源及檢出水平Tab.1 The name, source and detected level of 6 main impurities

在全部廠家的原料以及制劑中，最大單個雜質(zhì)均為雜質(zhì)1，即去乙酰頭孢硫脒，此雜質(zhì)可進一步產(chǎn)生雜質(zhì)2，即去乙酰頭孢硫脒7S-異構(gòu)體，雜質(zhì)1脫水即可產(chǎn)生雜質(zhì)3，即去乙酰氧頭孢硫脒，而雜質(zhì)1的3位羥基與4位羧基發(fā)生酯化反應即可產(chǎn)生雜質(zhì)4，及頭孢硫脒內(nèi)酯。由此可見，頭孢硫脒中的降解雜質(zhì)2、3、4均與雜質(zhì)1相關(guān)，故雜質(zhì)1可作為關(guān)鍵指針性雜質(zhì)反應產(chǎn)品的降解情況。頭孢硫脒可通過多種途徑產(chǎn)生雜質(zhì)1，包括加熱，酸降解、堿降解等，故此雜質(zhì)的含量還可以反映出原料以及制劑在貯存、運輸?shù)冗^程中的條件是否合理。

原料及制劑中均未檢出頭孢硫脒?；?酰化物Ⅰ、Ⅱ)，說明目前在原料合成過程中，生產(chǎn)廠家已經(jīng)注意控制起始原料的質(zhì)量、反應物的配比以及工藝參數(shù)，使得頭孢硫脒?；镫s質(zhì)的產(chǎn)生降到最低，遠低于質(zhì)量標準中要求的限度。但個別廠家原料中產(chǎn)生了新的工藝雜質(zhì)，即雜質(zhì)6，質(zhì)量標準中應對此雜質(zhì)進行關(guān)注，以全面反映原料生產(chǎn)過程中的工藝控制。雜質(zhì)6可作為反映產(chǎn)品生產(chǎn)工藝控制情況的指針性雜質(zhì)。

5 頭孢硫脒原料晶型

頭孢硫脒原料存在多種晶型，不同晶型的化學穩(wěn)定性不同。對4個不同廠家的原料進行粉末X-衍射分析，衍射圖譜如圖18所示，各廠家原料均為結(jié)晶型原料，特征衍射峰的峰位置、數(shù)量及相對強度基本一致，只是在2θ為15～20°之間的衍射峰數(shù)量及峰形略有不同，說明各廠家頭孢硫脒原料晶型基本一致。該結(jié)果提示，良好的工藝控制，可以保證頭孢硫脒原料最終產(chǎn)品均有較好的晶型，進而保證制劑產(chǎn)品的穩(wěn)定性。

6 結(jié)論

綜上所述，頭孢硫脒原料及注射用頭孢硫脒中共檢出6種主要雜質(zhì)，雜質(zhì)種類較少，各廠家制劑產(chǎn)品中雜質(zhì)含量均小于現(xiàn)行標準規(guī)定的限度，制劑有關(guān)物質(zhì)整體水平較好，這說明良好的原料晶型控制可以在一定程度上保證制劑的質(zhì)量。確定針對降解反應以及工藝控制的關(guān)鍵指針性雜質(zhì)，有助于從雜質(zhì)譜方面更加準確快速地了解產(chǎn)品質(zhì)量以及生產(chǎn)工藝情況。