光固化涂料中光引發(fā)劑遷移行為及其細胞毒性的研究

俞自航,朱 葉,劉敬成,劉 仁

(光響應功能分子材料國際聯合研究中心,江南大學化學與材料工程學院,江蘇無錫 214122）

紫外光（UV）固化技術因其具有高效、節(jié)能、經濟、環(huán)保、適用性廣的“5E”優(yōu)點被廣泛應用于油墨、涂料、膠粘劑等行業(yè)[1-2]。光固化體系主要由低聚物、活性稀釋劑、光引發(fā)劑以及其他助劑組成；其中光引發(fā)劑雖然占比少，但卻是光固化體系中的重要組分。光引發(fā)劑在輻照下從基態(tài)躍遷至激發(fā)態(tài)，激發(fā)態(tài)的電子會導致自身化學鍵的斷裂或和其他組分發(fā)生相互作用形成活性種，使體系中的低聚物和活性稀釋劑發(fā)生聚合[3]。目前商品化的光引發(fā)劑大多為小分子，利用率較低，其在紫外光的輻照下并不會完全轉化為活性種來引發(fā)聚合反應，固化后所得的產品中會殘留大量未反應的光引發(fā)劑。這些小分子化合物在一定條件下會從固化產品中遷移到環(huán)境中[4]，對環(huán)境造成污染，甚至威脅生命體的健康[5-6]。

隨著科技的進步和人們生活水平的提高，光引發(fā)劑遷移問題受到越來越多的關注，各國政府也出臺了相應的法律法規(guī)：歐盟制定了《關于化學品注冊、評估、許可和限制的法規(guī)》（REACH）對市場上商品化的光引發(fā)劑進行預防性管理；美國頒布了《有毒物質控制法》（TSCA）來管控光引發(fā)劑的生產和使用；瑞士頒布了關于印刷油墨的RS 817.023.21 規(guī)定[7]，給出了諸如2-羥基-4'-（2-羥乙氧基）-2-甲基苯丙酮（2959）和2-芐基-2-（二甲基氨基）-1-[4-（4-嗎啉基）苯基]-1-丁酮（369）等裂解型光引發(fā)劑的特定遷移限值。國內也有學者針對光引發(fā)劑的遷移進行了研究：黃秀玲等[8]探究了1-羥基環(huán)己基苯基甲酮（184）、2，2-二甲氧基-2-苯基苯乙酮（651）由聚乙烯淋膜紙向食品模擬物遷移的影響因素，總結了光引發(fā)劑在不同溫度、不同溶劑中的遷移動力學規(guī)律；韓偉等[9]以65%乙醇和正己烷作為食品模擬物，探究了光引發(fā)劑在食品模擬物中的遷移行為，建立了食品包裝油墨中光引發(fā)劑遷移的實驗和檢測方法。劉珊珊等[10]總結了食品接觸材料中光引發(fā)劑的檢測方法，列舉了這些檢測方法的檢出限以及回收率。但國內對光引發(fā)劑遷移的研究多集中在食品包裝領域，很少涉及到光固化涂料。

紫外-可見（UV-Vis）分光光度計法、氣相色譜法（GC）和高效液相色譜法（HPLC）是檢測痕量光引發(fā)劑的主要方法。UV-Vis 分光光度計法[11]適用于組分單一的光引發(fā)劑的定性定量分析，一旦體系中含有2種或2種以上吸收光譜重疊的物質，就無法使用該儀器對待測光引發(fā)劑進行定量分析。GC[12]可以分離易揮發(fā)且熱穩(wěn)定好的物質，適用于大多數光引發(fā)劑的檢測，但對于相對分子質量較大、沸點較高的光引發(fā)劑如（2，4，6-三甲基苯甲?；┒交趸ⅲ═PO）和苯基雙（2，4，6-三甲基苯甲酰基）氧化膦（819）等，卻無法進行分離。HPLC[13]是一種利用樣品中不同組分與色譜柱吸附能力的差異實現分離檢測的方法，其在分析速度、效能以及檢測的靈敏度方面，都可以和GC 相媲美，目前已在生物制藥、食品以及環(huán)境監(jiān)測等領域獲得了廣泛的應用。HPLC 一般與質譜（MS）或二極管陣列檢測器（DAD）聯用，其中HPLCDAD 聯用儀可以對液相色譜分離出的物質的紫外-可見吸收光譜進行檢測，具有分離效果好、針對性強等優(yōu)點，對小分子光引發(fā)劑的分離與檢測具有普適性。

本文以環(huán)氧丙烯酸酯類光固化涂料為主要研究對象，通過HPLC-DAD 聯用儀建立了光固化涂料中光引發(fā)劑遷移量的檢測方法；通過該方法探究了溫度、涂料配方中活性稀釋劑的種類、含量以及固化工藝中輻照量和膜厚對光引發(fā)劑遷移行為的影響；并且通過MTT 法（細胞存活率分析法）和細胞熒光染色法對涂膜的細胞毒性進行了系統的評價。

1 實驗部分

1.1 主要原料和儀器

環(huán)氧丙烯酸酯（RY1101）：工業(yè)級，江蘇開磷瑞陽化工股份有限公司；2-羥基-2-甲基-1-苯基-1-丙酮（1173，純度98%，下同）、1-羥基環(huán)己基苯基甲酮（184，98%）、2-甲基-1-[4-（甲基硫代）苯基]-2-（4-嗎啉基）-1-丙酮（907，98%）、（2，4，6-三甲基苯甲?；┒交趸ⅲ═PO，98%）、乙腈（色譜純）：上海阿達瑪斯試劑有限公司；丙烯酸羥乙酯（HEA，97%）、二縮三丙二醇二丙烯酸酯（TPGDA，90%）、季戊四醇三丙烯酸酯（PETA，96%）、季戊四醇四丙烯酸酯（PET4A，95%）、二甲基亞砜（DMSO，99%生物技術級）、四甲基偶氮唑鹽（MTT，99%生物技術級）、鈣黃綠素AM（96%）、碘化丙啶（95%）：上海麥克林生化科技有限公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基（生物技術級）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（生物技術級）、緩沖液（PBS，生物技術級）：美國Hyclone Laboratories 責任有限公司；胰蛋白酶-EDTA 溶液（生物技術級）：西格瑪奧德里奇（香港）控股有限公司；小鼠胚胎成纖維細胞（L929）：蘇州賽爾飛生物科技有限公司。

Ultimate 3000 RS高效液相色譜儀：安捷倫；Q800型動態(tài)熱機械分析儀：美國TA 儀器公司；BYK 框式涂膜器：德國畢克化學公司；F300 型履帶式光固化機：美國 Fusion 公司；INFINITE 200 PRO 型多功能酶標儀：瑞士帝肯；Nikon 80i 正置熒光顯微鏡：日本尼康株式會社。

1.2 光引發(fā)劑標準曲線的測定

用乙腈分別配置質量濃度為1 g/L 的光引發(fā)劑1173、184、907以及TPO的標準儲備溶液，使用時稀釋成 一 系列 質量濃 度為 5 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、50 mg/L、100 mg/L、500 mg/L 的 待 測 溶 液 。 通 過HPLC-DAD 對4 種光引發(fā)劑的標準曲線進行測定。使用的色譜柱為SHIMSEN Ankylo C18 柱，柱溫為20 ℃，進樣量 20 μL；流動相A 為超純水，流動相 B 為乙腈，檢測1173 的流動相梯度見表1；檢測184、907和 TPO 的流動相梯度為：0~20 min，φ（流動相A）=φ（流動相B）=50%；總流速均為2 mL/min；測試時間為20 min；二極管陣列檢測器的吸收波長區(qū)間為190~400 nm，定量分析波長為245 nm；以光引發(fā)劑濃度為橫坐標，出峰面積為縱坐標，擬合得到表2 中4種光引發(fā)劑的標準曲線。

表1 流動相梯度Table 1 Mobile phase gradients

表2 4種光引發(fā)劑的線性方程與線性相關系數Table 2 Linear equations and linear correlation coefficients of four photoinitiators

1.3 UV固化涂料及涂膜的制備

光固化涂料具體配方如表3 所示。將光引發(fā)劑、活性稀釋劑以及光固化樹脂RY1101，在避光條件下充分攪拌均勻，真空脫泡后得到光固化涂料。文中所用光引發(fā)劑及活性稀釋劑結構如圖1所示。

表3 UV固化涂料配方Table 3 Formulation of UV-curable coatings

圖1 光引發(fā)劑和活性稀釋劑的結構式Fig.1 The structural formulas of photoinitiators and reactive diluents

用丙酮擦拭玻璃板表面，以除去基材表面的污染物。利用BYK 框式涂膜器在玻璃基材表面制備一層厚度為120 μm 的濕膜，隨后使用履帶式光固化機以5.7 m/min 的速度對濕膜進行6 次曝光固化，單次輻照能量約為150 mJ/cm2，輻照總能量為900 mJ/cm2。固化完成后，將涂膜從基材上剝離，進行后續(xù)實驗。

1.4 性能測試

1.4.1 涂膜中光引發(fā)劑遷移率測試

將固化后的涂膜用粉碎設備裁剪成一定尺寸，稱量約20 mg 涂膜，精確至0.1 mg，放置于離心管中；按照每0.1 g 涂膜加入10 mL 乙腈在一定溫度條件下進行恒溫浸提，提取時間為12 h；提取完畢后用0.22 μm 的有機相濾膜過濾提取液，再用乙腈將濾液稀釋10 倍。隨后使用HPLC-DAD 對浸提液進行測試，根據光引發(fā)劑在液相色譜柱中的保留時間以及二極管陣列檢測器測到的紫外-可見吸收光譜對光引發(fā)劑進行定性定量測試，液相色譜與二極管陣列檢測器的分析條件與1.2所述一致。

本實驗使用遷移率作為研究光引發(fā)劑遷移行為的評價對象，計算如式（1）所示。

式中：m1—光固化涂料中光引發(fā)劑質量，根據光引發(fā)劑在配方中的添加量得到的；m2—光引發(fā)劑的遷移質量，將溶劑浸泡涂膜后得到浸提液，利用HPLCDAD法來進行定量分析得到的。

1.4.2 涂膜交聯密度測定

涂膜的交聯密度采用動態(tài)熱機械分析儀進行測試，測試條件為從30 ℃開始以5 ℃/min的速率升溫到180 ℃，根據式（2）計算出涂膜的交聯密度[14]。

式中：E'—橡膠態(tài)平臺區(qū)的儲能模量，通常取比Tg高40 ℃處的儲能模量，Pa；R—理想氣體常數，8.314 J（/mol·K）；T—熱力學溫度，K。

1.4.3 涂膜表面細胞毒性測定

將涂料涂覆在厚度為0.05 mm 的304 食品級不銹鋼基材上，固化后剪成1 cm×1 cm 的正方形薄片，放入24孔培養(yǎng)板中，每孔中加入1 mL的L929細胞懸液（每mL 含2×105個L929 細胞），另設空白304 不銹鋼基材作為陰性對照；將24 孔板置于37 ℃培養(yǎng)箱（CO2體積分數5%，相對濕度95%）內培養(yǎng)，24 h 后每孔加入鈣黃綠素AM 溶液（1 mol/L 的DMSO 溶液）至其最終濃度為20 mmol/L，隨后馬上加入碘化丙啶（1 mol/L 的PBS 溶液）溶液至其最終濃度為40 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)10 min。取出樣品用無菌PBS溶液沖洗2 次，用正置熒光顯微鏡分別在493 nm 及535 nm的激發(fā)波長下觀察L929細胞在涂膜表面的生長形態(tài)及存活情況，每個樣品至少選取6個不同位置拍攝數碼照片。拍攝后將樣品轉移至每孔含1 mL 新鮮培養(yǎng)基的24 孔培養(yǎng)板中，再每孔加入100 μL 質量濃度為5 g/L 的MTT 溶液，培養(yǎng)4 h 后吸除混合培養(yǎng)基，每孔再加入1 mL 的DMSO 并振蕩溶解3 min；用酶標儀測定DMSO 溶液在570 nm 處的吸光度（OD值），以630 nm 作為參考波長，通過式（3）計算得到細胞相對活力。實驗中每個樣品至少3個獨立培養(yǎng)孔，實驗數據用平均值±標準偏差表示。

2 結果與討論

2.1 溫度對光引發(fā)劑遷移率的影響

不同的環(huán)境條件對光引發(fā)劑的遷移會有一定的影響，實驗以1173 為光引發(fā)劑，TPGDA 為活性稀釋劑，RY1101為低聚物制備了光固化涂膜，探究溫度對光引發(fā)劑1173遷移行為的影響，結果如圖2所示。

圖2 光引發(fā)劑1173遷移率隨遷移溫度的變化Fig.2 Migration ratio of 1173 varied with migration temperature

由圖2 可知，光引發(fā)劑的遷移率隨著時間的增加表現出先增加后不變的趨勢，當遷移時間達到6 h時，光引發(fā)劑的遷移率已趨于穩(wěn)定，因此后續(xù)的遷移實驗時間調整為12 h。此外，溫度對光引發(fā)劑遷移率的影響較為明顯，在前1 h 內，溫度越高，光引發(fā)劑的遷移率越高，但遷移時間達到6 h 后，雖然高溫加速分子的熱運動，但是對光引發(fā)劑遷移率幾乎沒有影響，從側面表明延長遷移時間不會進一步增加光引發(fā)劑的遷移率，考慮到光固化涂料的實際應用環(huán)境，最終選擇的遷移溫度為20 ℃。

2.2 活性稀釋劑對光引發(fā)劑遷移率和細胞毒性的影響

活性稀釋劑是光固化涂料的重要組成部分，它不僅可以用來代替溶劑調節(jié)光固化涂料配方的黏度，還可以用來改善涂膜的各種性能。本實驗以1173作為光引發(fā)劑，研究了活性稀釋劑的種類（官能度）對光引發(fā)劑遷移率和細胞毒性的影響，結果如圖3所示。

從圖3 可以看出隨著活性稀釋劑官能度的增加，光引發(fā)劑的遷移率從單官活性稀釋劑HEA 涂膜的48.60% 降到了雙官活性稀釋劑TPGDA 涂膜的38.98%，這一方面是因為單官能度活性稀釋劑的反應活性較高，引發(fā)聚合所需要的活性種更少，導致更多的光引發(fā)劑殘留在涂膜中，另一方面是因為隨著活性稀釋劑官能度的增加，涂膜的交聯密度從2 121.05 mol/m3增加到4 457.52 mol/m3，形成了更加致密的交聯網絡結構使光引發(fā)劑更難遷移出來，導致光引發(fā)劑的遷移率出現下降。而隨著活性稀釋劑官能度的進一步增加，遷移率幾乎不變，這是因為多官活性稀釋劑的反應活性基本相同并且聚合物交聯網絡無法阻礙溶劑進入涂膜中提取光引發(fā)劑，因此光引發(fā)劑遷移率保持不變。由于不同活性稀釋劑對光引發(fā)劑遷移率的影響不大，因此涂膜的細胞毒性沒有表現出一個較為明顯的規(guī)律，且培養(yǎng)基對光引發(fā)劑的提取率較低，導致涂膜表現出較低的L929細胞毒性，最終選用TPGDA作為后續(xù)實驗的活性稀釋劑。

圖3 活性稀釋劑種類對光引發(fā)劑遷移率和細胞毒性的影響Fig.3 Effects of type of reactive diluents on migration ratio of photoinitiators and cytotoxicity

圖4 為TPGDA 含量對光引發(fā)劑遷移率和細胞毒性的影響。

圖4 活性稀釋劑含量對光引發(fā)劑遷移率和細胞毒性的影響Fig.4 Effects of content of reactive diluents on migration ratio of photoinitiators and cytotoxicity

由圖4 可以發(fā)現活性稀釋劑含量對光引發(fā)劑遷移率的影響較小，其最大值為43.34%，最小值為38.56%。這是因為低聚物RY1101 與TPGDA 的丙烯酸酯官能團的反應活性相似，改變低聚物與活性稀釋劑的比例對聚合反應所消耗的活性種數目影響較小。此外還發(fā)現活性稀釋劑含量對涂膜的交聯密度的影響顯著低于活性稀釋劑種類的影響。由圖4（b）可知活性稀釋劑含量的變化對L929細胞的毒性幾乎無影響，這一方面是因為光引發(fā)劑的遷移率變化很小，另一方面是因為活性稀釋劑絕大部分參與到聚合反應中，僅有極少量的活性稀釋劑會發(fā)生遷移[15]。

2.3 光引發(fā)劑種類對遷移率和細胞毒性的影響

目前，市場上有很多商品化UV光引發(fā)劑，為了探究不同光引發(fā)劑對遷移率及細胞毒性的影響，除1173外本實驗還選用184、907和TPO作為研究對象，實驗結果如圖5所示，其中4種光引發(fā)劑均占配方總質量的3%，圖6為不同濃度的純光引發(fā)劑對L929的細胞毒性。

圖5 光引發(fā)劑種類對光引發(fā)劑遷移率和細胞毒性的影響Fig.5 Effects of type of photoinitiators on migration ratio of photoinitiators and cytotoxicity

由圖5 可知，使用不同光引發(fā)劑對涂膜遷移率的影響很大，一方面是由光引發(fā)劑的相對分子質量大小決定的，相對分子質量越大的光引發(fā)劑，其遷移率越低[16]；另一方面UV 光源發(fā)射波長與光引發(fā)劑吸收波長的匹配性[17]、光引發(fā)劑的量子產率[18]和生成初級自由基的活性差異[19]的共同作用導致TPO 在涂膜中的殘留量較少，故TPO 的遷移率會更低。結合圖6分析可知，在TPO 濃度較高的情況下，其表現出較為明顯的細胞毒性。但是將TPO 引入到光固化涂料中，發(fā)現其幾乎沒有細胞毒性，這是因為涂膜中的TPO遷移率很低。除TPO 外，其余3種光引發(fā)劑及其參與固化的涂膜均沒有表現出明顯的細胞毒性。因此，選擇光固化涂料配方不僅要考慮光引發(fā)劑本身的毒性，最好還要結合實際應用對涂料的毒性進行測試，兩者的結果可能并不一致。

圖6 不同光引發(fā)劑及其濃度對細胞毒性的影響Fig.6 Effects of different photoinitiators and concentrations on cytotoxicity

2.4 光引發(fā)劑含量對遷移率和細胞毒性的影響

為了提高光固化涂料中的活性種濃度以抑制氧阻聚作用并提高UV 固化效率[20]，實際應用中會增加光引發(fā)劑的用量。圖7為光引發(fā)劑1173的含量從1%逐步增加至9%的過程中，遷移率和細胞毒性的變化情況，其中光引發(fā)劑含量以配方總質量計。

圖7 光引發(fā)劑含量對光引發(fā)劑遷移率和細胞毒性的影響Fig.7 Effects of content of photoinitiators on migration ratio of photoinitiators and cytotoxicity

由圖7 可知，隨著光引發(fā)劑含量的增加，其遷移率由36.25%逐漸增加至50.15%。這是因為在輻照量固定的前提下，被UV 所激發(fā)生成活性種并引發(fā)聚合反應的光引發(fā)劑是有限的[21]，因此隨著光引發(fā)劑含量的增加，涂膜中殘留光引發(fā)劑的比例會隨之增加，導致光引發(fā)劑遷移率增加。隨著光引發(fā)劑含量的增加，涂膜的細胞毒性逐漸顯現出來，當光引發(fā)劑含量達到5%及以上時，細胞活性＜80%，表現出對L929 細胞有一定的毒性作用?？傮w來看，細胞毒性與光引發(fā)劑遷移率是正相關的。

圖8 為不同光引發(fā)劑含量對細胞形態(tài)變化的熒光染色照片。

圖8 不同光引發(fā)劑含量對細胞形態(tài)變化的熒光染色照片Fig.8 Fluorescence staining photos of cell morphological changes with different photoinitiator contents

由圖8 可知，1%光引發(fā)劑含量的涂膜上存活的細胞（被染為綠色）生長非常密集，且多數細胞呈紡錘形，死亡的細胞（被染為紅色）較少。當光引發(fā)劑含量超過5%時，細胞生長的密度較低，且死亡細胞的比例更高，這表明高光引發(fā)劑含量的涂膜對細胞生長有一定的抑制作用。因此在實際應用中1173 添加量最好選擇低于5%的配方作為光固化涂料。

2.5 輻照量對光引發(fā)劑遷移率和細胞毒性的影響

UV 是誘導光引發(fā)劑分解生成自由基的能量來源，光的輻照劑量直接決定了光引發(fā)劑的分解程度，而光輻照時間與光輻照劑量成正比關系，可以通過調控光輻照的時間來控制光輻照的劑量。實驗選取1173 作為光引發(fā)劑，研究了輻照量對光引發(fā)劑遷移率的影響，結果如圖9所示。

圖9 輻照量對光引發(fā)劑遷移率和細胞毒性的影響Fig.9 Effects of UV irradiation on migration ratio of photoinitia?tors and cytotoxicity

由圖9 可知，隨著輻照量的增加，光引發(fā)劑的遷移率從63.99%降低至38.98%且其降低速率逐漸變小，最終保持不變。這是因為在聚合反應初期隨著光輻照次數的增加，更多的光引發(fā)劑會被激發(fā)誘導聚合反應，導致光引發(fā)劑的遷移率出現了明顯的下降，而隨著輻照量的進一步增加，由于該反應體系已經達到很高的轉化率，籠蔽效應導致光引發(fā)劑產生的活性種無法參與聚合反應[22]，用以引發(fā)聚合的光引發(fā)劑會顯著減少，導致最終光引發(fā)劑的遷移率趨于穩(wěn)定。當輻照次數較少時，涂膜中光引發(fā)劑的遷移率較高且體系的固化程度還沒達到完全，由于丙烯酸酯基團對細胞有一定的刺激作用[23]，因此表現出一定的細胞毒性，隨著輻照量的進一步增加，涂膜完全固化，其生物相容性變好。

圖10 為不同輻照量對細胞形態(tài)變化的熒光染色照片。

由圖10 可以發(fā)現，較低輻照量的涂膜對細胞抑制生長的作用十分顯著，涂膜上的細胞密度較低且死細胞數較多。當輻照次數＞3 次后，涂膜抑制細胞生長的作用較小，輻照4次時，細胞的生長情況最好。這可能是因為輻照量的進一步增加會導致光引發(fā)劑光解產物量的小幅度增加，從而抑制了細胞的生長。

圖10 不同輻照次數對細胞形態(tài)變化的熒光染色照片Fig.10 Fluorescence staining photos of cell morphological changes with different UV irradiation

2.6 膜厚對光引發(fā)劑遷移率和細胞毒性的影響

圖11 為濕膜厚度對光引發(fā)劑1173 遷移率和涂膜細胞毒性的影響。

由圖11 可知，120 μm 涂膜的光引發(fā)劑遷移率比60 μm 的涂膜高9.8%，因為表層的光引發(fā)劑能夠吸收部分紫外光，導致深層的光引發(fā)劑吸收的紫外光強度下降，而這一作用隨著膜厚的增加而增強，因此膜厚的增加會提升涂膜中光引發(fā)劑的遷移率。增加膜厚雖然會在一定程度上提升光引發(fā)劑的遷移率，但卻不會抑制細胞的生長，3 種膜厚的涂膜均沒有表現出明顯的細胞毒性。因此，膜厚不是影響毒性的主要因素。

圖11 膜厚對光引發(fā)劑遷移率和細胞毒性的影響Fig.11 Effects of film thickness on migration ratio of photoinitia?tors and cytotoxicity

3 結 語

本研究建立了UV 固化涂料中光引發(fā)劑遷移率的檢測和涂膜細胞毒性的評價方法，使用HPLCDAD 得到了不同涂料配方和固化工藝所制得涂膜的光引發(fā)劑遷移率，此外還用MTT 和細胞熒光染色法評價了不同涂膜的細胞毒性，結合光引發(fā)劑遷移率等因素對細胞毒性結果進行分析。研究發(fā)現高光引發(fā)劑含量及低UV 輻照量對光引發(fā)劑遷移率的影響較大，從而導致涂膜存在細胞毒性；不同的光引發(fā)劑對遷移率影響較大，而對細胞毒性的影響不大；活性稀釋劑的種類和添加量對遷移率的影響有限，且均沒有表現出較為明顯的細胞毒性。