響應(yīng)面法優(yōu)化金針菇漆酶產(chǎn)酶條件

張嘉清 牛 麗 單玉虹 張?zhí)煊?唐小婷 王 越張建偉 馬懿賢 王 霞 王盼盼 馮九海 梁倩倩 丁玲強

（1河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生態(tài)工程學(xué)院，甘肅張掖734000；2河西學(xué)院生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅張掖734000；3河西學(xué)院甘肅省應(yīng)用真菌工程實驗室，甘肅張掖734000）

漆酶（laccase）是一類含銅的多酚氧化酶[1]。近年來，在對漆酶性質(zhì)和作用進行研究后發(fā)現(xiàn)，漆酶在食品工業(yè)、造紙業(yè)、環(huán)境保護過程中都起著重要的作用，從而促進了漆酶的進一步研究[2]。據(jù)研究發(fā)現(xiàn)，不同食用菌產(chǎn)漆酶的能力也不同，食用菌產(chǎn)漆酶能力與其培養(yǎng)周期有關(guān)，產(chǎn)漆酶能力強的菌株，其液體發(fā)酵培養(yǎng)的周期短；而產(chǎn)漆酶能力較弱或者是不產(chǎn)漆酶的菌株，液體發(fā)酵培養(yǎng)的周期長[3]。但是目前漆酶的應(yīng)用潛力還未得到充分挖掘，主要原因在于現(xiàn)有漆酶的低催化效率和高生產(chǎn)成本[4]。目前漆酶的工業(yè)化還需在縮短預(yù)處理周期、研制高效的經(jīng)濟介體、實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)等方面加強研究[5]。其中實現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)是漆酶工業(yè)化的重要內(nèi)容之一。

響應(yīng)面法（RSM）能夠在有限的次數(shù)內(nèi)，對影響生物過程的關(guān)鍵因子及其交互作用進行優(yōu)化、評價，以獲得影響過程的最佳條件，已成功應(yīng)用于種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵條件的優(yōu)化[6]。筆者以漆酶產(chǎn)量較高的金針菇閩金1 號為材料，采用P-B（plackettburma）設(shè)計、響應(yīng)面法、中心組合試驗CCD（central composite design，）設(shè)計優(yōu)化營養(yǎng)培養(yǎng)基組成，考察碳源、氮源、Cu、K+、VB1[7]等因素對金針菇漆酶分泌的影響，尋找適宜的營養(yǎng)及培養(yǎng)條件，以提高金針菇閩金1 號分泌漆酶的能力，為其進一步開發(fā)利用和相關(guān)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

金針菇菌株：閩金1號，由河西學(xué)院應(yīng)用真菌工程實驗室提供。

主要試劑：ABTS[2，2’‐azino‐bis（3‐ethylbenzo thiazoline‐6‐sulfonic）]購自Sigma 公司，蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、酒石酸銨、蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇、麩皮、MgSO4、KH2PO4、VB1、CuSO4等均為國產(chǎn)分析純。

主要儀器：SF-CJ-2 A 凈化工作臺（揚州市三發(fā)電子有限公司），HZQ-X400 恒溫振蕩培養(yǎng)箱（華美生化儀器廠），日本立洋移液槍（上海澤權(quán)儀器設(shè)備有限公司），DKB-501 恒溫水浴鍋（揚州三發(fā)電子有限公司），LRH-500-D恒溫培養(yǎng)箱（韶關(guān)市泰蟲醫(yī)療器械有限公司），CL-32 L 蒸汽滅菌鍋（日本ALP 公司），數(shù)顯恒溫磁力攪拌器（常州國華電器有限公司），SP-722 型分光光度計（上海光譜儀器有限公司），TCL-20M 臺式高速冷凍離心機（湖南賽特湘儀離心機儀器有限公司），IMS-50制冰機（江蘇格林電器有限公司），BK-FL 熒光倒置顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）。

1.2 供試培養(yǎng)基

固體培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，麩皮30 g，磷酸二氫鉀1 g，蛋 白 胨4 g，葡 萄 糖20 g，瓊 脂20 g，水1 000 mL，pH 自然，115 ℃滅菌20 min?；A(chǔ)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，麩皮30 g，磷酸二氫鉀1 g，蛋白胨4 g，葡萄糖20 g，水1 000 mL，pH 自然，115 ℃滅菌20 min。

1.3 菌液制備

將供試菌株接種于平板固體培養(yǎng)基，25 ℃活化培養(yǎng)5 d；用0.8 cm 打孔器取活化后的菌餅三塊，接種于裝液量80 mL 的液體培養(yǎng)基三角瓶（250 mL）中，25 ℃、120 r/min培養(yǎng)3 d。

1.4 粗酶液的制備

取5 mL 活化菌液轉(zhuǎn)到裝液量為80 mL 的供試產(chǎn)酶培養(yǎng)基中（250 mL），25 ℃、120 r/min 培養(yǎng)9 d。將培養(yǎng)好的產(chǎn)酶菌液用雙層擦鏡紙過濾，濾液在4 000 r/min 下離心10 min，上清液即為粗酶液。-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 漆酶活性測定

以ABTS為底物[8]（λ420 nm處ABTS的摩爾吸光系 數(shù)：3.6×104mol/cm），3 mL 反 應(yīng) 混 合 液 中 含2.75 mL pH3.8 的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液，200 μL 0.5 mmol/LABTS 和50 μL 粗酶液，25 ℃反應(yīng)2 min 后立即用冰浴終止反應(yīng)，于420 nm 處測定吸光度。以滅活的酶液反應(yīng)混合液為對照。酶活單位定義：1 min 內(nèi)催化氧化1 mmol ABTS 的酶量為1個酶活單位[9]。

式 中：ε420（ABTS）=3.6×104 mol/cm；Δt—2 min；ΔOD—2 min 內(nèi)吸光度OD 的變化值；V1—酶反應(yīng)中反應(yīng)液的總體積，3 mL；V2—酶反應(yīng)中酶液的體積（mL）

1.6 碳源、氮源單因素試驗

碳源的篩選：分別用蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、甘露醇、麩皮代替基本產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的碳源，配制成5 種不同碳源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，考察不同碳源下菌株的產(chǎn)酶量。

氮源的篩選：分別用7 種氮源代替基本產(chǎn)酶培養(yǎng)基中的蛋白胨，配制成7 種不同氮源的產(chǎn)酶培養(yǎng)基，考察不同氮源下菌株的產(chǎn)酶量。7 種氮源為：蛋白胨、酵母粉、硫酸銨、酒石酸銨、蛋白胨+酵母粉、蛋白胨+硫酸銨、蛋白胨+酵母粉+硫酸銨。

1.7 P-B因素水平設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，選取蔗糖、蛋白胨+酵母粉、MgSO4、KH2PO4、CuSO4、VB16 個營養(yǎng)因素，采用11 因素12 個試驗組的P-B 試驗，因素水平設(shè)置如表1。

表1 P-B試驗因素和水平

1.8 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計

根據(jù)P-B 設(shè)計結(jié)果篩選出的3 個顯著影響因素（蔗糖、MgSO4、KH2PO4），采用CCD 設(shè)計對閩金1 號產(chǎn)漆酶發(fā)酵條件進行3 因素5 水平的響應(yīng)面分析。因素水平設(shè)置如表2。

表2 CCD設(shè)計因素和水平

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源篩選結(jié)果

如圖1 可見，以蔗糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶活力較高，考慮經(jīng)濟原因，確定蔗糖為金針菇閩金1號產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的最佳碳源。

圖1 碳源對供試菌株（閩金1號）漆酶產(chǎn)量的影響

2.2 氮源篩選結(jié)果

如圖2可見，蛋白胨+酵母粉為氮源的培養(yǎng)基漆酶活力最高（682.22 μ/mL），其余6 種氮源培養(yǎng)基漆酶活力依次是蛋白胨＞酵母粉＞酒石酸銨＞蛋白胨+硫酸銨＞蛋白胨+酵母粉+硫酸銨＞硫酸銨。因此，確定蛋白胨+酵母粉為閩金1 號產(chǎn)漆酶培養(yǎng)基的最佳氮源。

圖2 氮源對供試菌株（閩金1號）漆酶產(chǎn)量的影響

2.3 P-B試驗結(jié)果

P-B 試驗選取蔗糖、蛋白胨+酵母粉、MgSO4、KH2PO4、CuSO4、VB16 個營養(yǎng)因素，添加5 個虛擬因素進行全面考察，選用n=12 的P-B 設(shè)計，每個因素選高低2 個水平，以漆酶活性為響應(yīng)值（Y），按表3設(shè)計進行試驗。

表3 P-B試驗設(shè)計

由表4 可知，各因素中蛋白胨+酵母粉、VB1對漆酶活性具有正效應(yīng)，而蔗糖、MgSO4、KH2PO4、CuSO4為負效應(yīng)?；旌蠣I養(yǎng)培養(yǎng)基組分中顯著影響漆酶活性的因素依次為：KH2PO4、蔗糖、MgSO4，貢獻率分別為38.36%、17.83%和15.89%。因此，選取KH2PO4、蔗糖和MgSO4作為顯著因素，進一步優(yōu)化。

表4 P-B設(shè)計結(jié)果及效應(yīng)分析

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

結(jié)果見表5。模型的建立與方差分析以KH2PO4、蔗糖、MgSO4為自變量。通過Design-Ex‐pert 8.5軟件對表5數(shù)據(jù)進行二次多項回歸擬合獲得編 碼 的 回 歸 方 程 為Y=920.10+7.4×A-64.03×B+21.19×C-24.06×A×B+23.65×A×C+35.52×B×C-38.82×A2-109.83×B2-4.94×C2。

表5 CCD實驗設(shè)計及結(jié)果

回歸模型的方差分析結(jié)果見表6，模型的F=5.92，P＜0.05，表明該模型顯著。模型失擬項（lack of fit）表示模型預(yù)測值與實際值不擬合的概率，P＞0.05，失擬項不顯著[10]，因此模型選擇正確。模型中的參數(shù)B 和B2達顯著水平，表明MgSO4體積質(zhì)量對漆酶酶活性具有顯著的線性效應(yīng)和曲面效應(yīng)。模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.8420，表明方程擬合較好。綜上所述，回歸方程為閩金1 號營養(yǎng)培養(yǎng)基產(chǎn)漆酶預(yù)測分析提供了一個合適的模型。

表6 二次多項回歸模型的方差分析

由圖3 可以看出，隨MgSO4體積質(zhì)量的上升，漆酶活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，而蔗糖對酶活性的影響相對較小。在等高線圖中，沿MgSO4軸方向，等高線變化密集，而沿蔗糖軸方向，等高線的變化稀疏。故MgSO4對酶活性最大值的影響大于蔗糖，是影響酶活性的主要效應(yīng)因子。圖4 顯示KH2PO4和蔗糖對酶活性的交互影響，從等高線圖可以看出此二因素間的交互作用較顯著，因為等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強弱大小，橢圓形等高線表示二因素交互作用顯著。當(dāng)KH2PO4體積質(zhì)量較高時，可獲得較高的酶活性，隨蔗糖體積質(zhì)量的增加，酶活性呈現(xiàn)先高后低的變化趨勢。圖5表明在選定的試驗水平范圍內(nèi)，較低體積質(zhì)量的MgSO4可獲得較高的酶活性，而KH2PO4的體積質(zhì)量影響不大。從等高線圖可見，MgSO4對酶活性的影響遠大于KH2PO4，是主要的影響因素。

圖3 MgSO4和蔗糖對供試菌株（閩金1號）漆酶產(chǎn)量的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖4 KH2PO4和蔗糖對供試菌株（閩金1號）漆酶產(chǎn)量的響應(yīng)面圖和等高線圖

圖5 KH2PO4和MgSO4對供試菌株（閩金1號）漆酶產(chǎn)量的響應(yīng)面圖和等高線圖

因此，KH2PO4與蔗糖對酶活性的交互影響顯著，MgSO4與KH2PO4和蔗糖對酶活性的交互影響不顯著。通過優(yōu)化頂點分析，得到模型的3 個優(yōu)化參數(shù) 分 別 為 蔗 糖22.27 g/L、MgSO40.96 g/L、KH2PO41.25 g/L，預(yù)測的最大漆酶活性為945.981 U/L。

3 小結(jié)

采用響應(yīng)面優(yōu)化法中的P-B 設(shè)計，從11 個營養(yǎng)因素中篩選出影響金針菇閩金1 號產(chǎn)酶的主要營養(yǎng)因素依次為蔗糖、MgSO4、KH2PO4。在此基礎(chǔ)上，進一步采用CCD 設(shè)計建立了預(yù)測閩金1 號高產(chǎn)漆酶的模型，優(yōu)化了主要參數(shù)的水平。通過中心組合試驗，采用統(tǒng)計學(xué)的方法得出閩金1 號發(fā)酵產(chǎn)漆酶的二次多項數(shù)學(xué)模型，得到蔗糖、MgSO4、KH2PO4對漆酶活性最大值的影響大小依次為MgSO4＞蔗糖＞KH2PO4，所得優(yōu)化混合培養(yǎng)基參數(shù)為蔗糖22.27 g/L、MgSO40.96 g/L、KH2PO41.25 g/L。模型預(yù)測的最大漆酶活性為945.981 U/L。此結(jié)果為今后金針菇閩金1 號菌株進一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。