血清HER2蛋白化學(xué)發(fā)光免疫檢測方法的建立及評價

王娟，程華，胡琛光，林斯，于飛，劉濤，劉朋朋

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 河北野生動物健康研究中心，河北 保定 071000；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071000；3.河北省科學(xué)院 生物研究所，河北 石家莊 050081；4.北京華科泰生物技術(shù)股份有限公司，北京 101111；5.天津華科泰生物技術(shù)有限公司,天津 300405)

乳腺癌已居女性惡性腫瘤之首，統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示2018年全球女性乳腺癌新發(fā)病例達(dá)210萬例，約占女性腫瘤的25%，且發(fā)病趨向年輕化，嚴(yán)重威脅女性生命健康[1-3].人表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor 2，HER2)基因也被稱為ERBB2，是位于人體17號染色體長臂上的原癌基因，編碼分子質(zhì)量為185 ku的跨膜蛋白，定位于細(xì)胞膜表面，由胞外配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和胞內(nèi)蛋白酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域3部分構(gòu)成，其可與EGFR、HER3結(jié)合形成異源二聚體或與自身結(jié)合形成同源二聚體，導(dǎo)致胞內(nèi)酪氨酸激酶結(jié)構(gòu)域自身磷酸化，激活下游PI3K/AKT、RAS/RAF、JAK/STAT3等信號通路，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移.HER2陽性乳腺癌占所有類型乳腺癌的15%～20%，且其惡性程度更高，預(yù)后更差[4-6].因此HER2是乳腺癌患者重要的預(yù)后指標(biāo)，也是抗HER2藥物治療的主要預(yù)測指標(biāo).

目前，免疫組織化學(xué)(IHC)和熒光原位雜交(FISH)技術(shù)是評價乳腺癌患者HER2表達(dá)的主要手段，然而對于乳腺癌HER2陽性患者的病程和治療效果動態(tài)監(jiān)控亟需開發(fā)更為簡便的方法[7].研究發(fā)現(xiàn)60.46%乳腺癌患者血清和組織HER2表達(dá)結(jié)果一致，提示血清HER2測定和組織學(xué)測定結(jié)果一致性較高，具有臨床應(yīng)用價值[8-9].HER2蛋白胞外區(qū)(extracellular domain，ECD)通過基質(zhì)金屬蛋白酶的作用脫落進(jìn)入血液，即血清HER2 ECD，可通過免疫測定的方法進(jìn)行定量檢測，因此血清HER2 ECD值可能作為檢測癌細(xì)胞復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移以預(yù)測治療反應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物[10-12].本研究建立了血清HER2蛋白磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫檢測法，并對其性能和已上市的西門子公司生產(chǎn)的同類型試劑盒的等效性進(jìn)行了評價，以期為臨床應(yīng)用提供科學(xué)參考.

1 材料和方法

1.1 材料及樣本來源

HER2抗體、抗原由河北省科學(xué)院生物研究所制備；標(biāo)記有鏈霉親和素(SA)的超順磁性磁微粒、牛血清白蛋白(BSA)以及堿性磷酸酶(AP)購自羅氏診斷產(chǎn)品(上海)有限公司；4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷羧酸-N-琥珀酰亞胺酯(SMCC)及酯化生物素(B)來自西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉、碳酸氫鈉、三羥甲基氨基甲烷(Tris)等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑北京有限公司；發(fā)光底物、洗滌液及磁微粒化學(xué)發(fā)光免疫分析儀(SAVANT-2020)由北京華科泰生物技術(shù)股份有限公司提供.乳腺癌患者及健康查體樣本于2021年1月至12月收集于華北煤炭總醫(yī)院，共100例.

1.2 檢測方法建立

1.2.1 校準(zhǔn)品的配制

采用牛血清稀釋液將HER2抗原稀釋至300、100、30、10、3、0 ng/mL，標(biāo)記為S5～S0，2～8 ℃保存.

1.2.2 生物素標(biāo)記抗體的制備

取包被抗體1 mg(該抗體經(jīng)Protein A親和純化，純度>95%)，放入0.05 mol/L碳酸緩沖液透析30 min后與1 mg酯化生物素室溫攪拌1 h，隨后將其置于磷酸緩沖液透析過夜.按照體積比1∶1 000，用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% BSA的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液配制試劑R1.

1.2.3 堿性磷酸酶標(biāo)記抗體

取標(biāo)記抗體1 mg(該抗體經(jīng)Protein A親和純化，純度>95%)，放入0.05 mol/L碳酸緩沖液透析30 min，隨后采用SMCC常規(guī)標(biāo)記方案進(jìn)行AP的偶聯(lián).最終按照體積比1∶3000的比例用含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1% BSA的0.1 mol/L Tris-HCl緩沖液配制試劑R2.

1.2.4 磁微粒的配制

按照磁微粒供應(yīng)商提供的操作指南，配制0.7 mg/mL的磁微粒試劑，標(biāo)注為M.

1.3 性能及等效性分析

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

采用西門子醫(yī)學(xué)診斷產(chǎn)品HER2蛋白測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)為企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)品賦值，隨后用制備的試劑進(jìn)行測定并繪制4參數(shù)方程

其中，A為曲線上漸近線估值；D為曲線下漸近線估值；C為最大結(jié)合一半時對應(yīng)的劑量；B為曲線的斜率.

1.3.2 空白限(limit of blank,LoB)評價

參照CLSI EP17-A2:2018(US)《Protocols for Determination of Limits of Detection and Limits of Quantitation;Approved Guideline》，建立廠家試劑盒LoB.LoB由空白樣本結(jié)果確定，設(shè)置Ⅰ類錯誤水平α和Ⅱ類錯誤水平β為5%，利用質(zhì)量濃度為0的校準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)性研究(n=180).取3個批次試劑分別對5個0值校準(zhǔn)品重復(fù)檢測，每天重復(fù)檢測2次，連續(xù)檢測6 d.若空白值呈正態(tài)分布，則LoB=μB+1.645 σB,其中，μB和σB分別為空白樣品檢測的均值和標(biāo)準(zhǔn)差.若空白值呈非正態(tài)分布，則LoB為第95百分位數(shù)(PctB)值，即0.95×Bn+0.5位置的結(jié)果.其中Bn為檢測的重復(fù)次數(shù).

1.3.3 外源性干擾

參照CLSI EP07-A2:2018(US)《Interference Testing in Clinical Chemistry;Approved Guideline》進(jìn)行實(shí)驗.分別在10、100 ng/mL HER2的模擬血清樣本中添加順鉑、環(huán)磷酰胺、鹽酸阿霉素、依托泊苷、甲氨蝶呤等藥物，計算模擬樣本的回收率，檢測其潛在干擾性.

1.3.4 內(nèi)源性干擾

參照CLSI EP07-A2:2018(US)《Interference Testing in Clinical Chemistry;Approved Guideline》進(jìn)行實(shí)驗.分別在10、100 ng/mL HER2的模擬血清樣本中添加結(jié)合膽紅素、未結(jié)合膽紅素、甘油三酯、血紅蛋白、膽固醇等干擾物質(zhì)，計算模擬樣本的回收率，檢測其潛在干擾性.

1.3.5 精密度

參照CLSI EP05-A3:2014(US)《Evaluation of Precision of Quantitative Measurement Methods;Approved Guideline》進(jìn)行實(shí)驗.擬采用5×5的精密度驗證方案，利用單因素方差分析試劑精密度.

1.3.6 回收率

取300 ng/mL的HER2標(biāo)準(zhǔn)品，加入到質(zhì)量濃度接近于5 ng/mL的陰性樣本中且標(biāo)準(zhǔn)品和陰性樣本的體積比不大于1∶9，重復(fù)測定3次，取平均值并計算回收率.

1.3.7 分析特異性

分析特異性實(shí)驗參照 CLSI EP07-A2:2018(US)《Interference Testing in Clinical Chemistry;Approved Guideline》進(jìn)行，分析人表皮生長因子受體(EGFR 或HER1)與該試劑的交叉反應(yīng)率.

1.3.8 穩(wěn)定性

將成品試劑盒置于2～8 ℃條件下保存，期間以12、24、36、48、60周為周期，將回收實(shí)驗、批內(nèi)重復(fù)性、LoB作為驗收條件，根據(jù)結(jié)果判斷試劑盒穩(wěn)定性.

1.3.9 一致性評價

采用本研究制備的試劑盒與西門子醫(yī)學(xué)HER2蛋白測定試劑盒(化學(xué)發(fā)光法)平行檢測100例臨床樣本，擬用Passing-Bablok回歸進(jìn)行相關(guān)性分析，采用Bland-Altman對樣本偏倚進(jìn)行分析，對本研究制備的試劑盒與市場已有產(chǎn)品進(jìn)行一致性評價.

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將樣本的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)，檢測發(fā)光值作為縱坐標(biāo)，用4參數(shù)方程擬合繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，曲線方程為

相關(guān)系數(shù)r為0.999 6，表明發(fā)光值和校準(zhǔn)品質(zhì)量濃度在0～300 ng/mL里具有很好的相關(guān)性(圖1).

圖1 磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法檢測HER2蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of the magnetic particles chemiluminescence immunoassay detection of HER2 protein

2.2 LoB

采用IBM SPSS Statistics 25中Kolmogorov-Smirnov和Shapiro-Wilk檢驗法對空白樣本檢測結(jié)果進(jìn)行正態(tài)性檢驗，鑒于樣本量小于5 000，則按照Shapiro-Wilk檢驗結(jié)果呈非正態(tài)分布(P<0.05)，使用非參數(shù)法計算LoB.第95百分位數(shù)(PctB)值為180×(95/100)+0.5=171.5，即LoB=X171+0.5(X172-X171)，X171與X172是第171和第172的觀測值.對180個檢測結(jié)果由小到大進(jìn)行排序，得到X171=0.48 ng/mL，X172=0.48 ng/mL，即空白限LoB=0.48 ng/mL(表1).

表1 LoB正態(tài)性檢驗Tab.1 LoB normal test

2.3 外源性干擾

在10 ng/mL和100 ng/mL HER2的模擬血清樣本中添加表2藥物，平均回收率<5%，表明該試劑具有很好的抗藥物干擾能力.

表2 外源性干擾Tab.2 Exogenous interference

2.4 內(nèi)源性干擾

在10 ng/mL和100 ng/mL HER2的模擬血清樣本中添加表3內(nèi)源性物質(zhì)，平均回收率<5%，表明該試劑同時具有很好的抗內(nèi)源性干擾能力.

表3 內(nèi)源性干擾Tab.3 Endogenous interference

2.5 精密度

對HER2質(zhì)量濃度為10 ng/mL和100 ng/mL的質(zhì)控品L/H以及質(zhì)量濃度約為14 ng/mL和70 ng/mL混合血清樣本S1/S2進(jìn)行檢測，結(jié)果如表4所示，批間與批內(nèi)CV均小于8%，證明該試劑有較高的精密度.

表4 精密度分析Tab.4 Accuracy analysis

2.6 回收率

回收率結(jié)果為98.21%，在90%～110%內(nèi)符合預(yù)期標(biāo)準(zhǔn).

2.7 分析特異性

與質(zhì)量濃度最大為10 000 ng/mL的人皮生長因子受體(EGFR或HER1)交叉反應(yīng)率為0.05%，可以忽略不計.

2.8 穩(wěn)定性

穩(wěn)定性測試結(jié)果如表5所示，在60周內(nèi)HER2試劑的回收率、空白限和重復(fù)性均滿足性能指標(biāo)，證明該試劑具有較好的穩(wěn)定性，在規(guī)定的儲存條件下有效期大于48周.

表5 穩(wěn)定性驗證Tab.5 Stability verification

2.9 等效性評價

分別應(yīng)用本研究建立的HER2/neu診斷方法與西門子公司生產(chǎn)的ADVIA Centaur HER2診斷試劑盒對來自于臨床的100個樣本進(jìn)行檢測，相關(guān)性和偏倚性分析結(jié)果顯示，相關(guān)系數(shù)r=0.995，樣本平均偏倚為-0.2 ng/mL(圖2，3),證明所開發(fā)試劑與西門子公司生產(chǎn)的HER2檢測試劑盒檢測結(jié)果具有很好的一致性.

ρ1.SAVANT測定值；ρ2.ADVIA Centaur測定值.圖2 HER2蛋白結(jié)果相關(guān)性分析Fig.2 Correlation analysis of HER2 protein

ρ.ADVIA Centaur和SAVANT測定均值.圖3 HER2蛋白結(jié)果偏倚分析Fig.3 Bias analysis of HER2 protein

3 討論

血清腫瘤標(biāo)志物是罹患腫瘤時存在于機(jī)體血液中的糖類、酶類以及激素等多種類型的特異性反應(yīng)產(chǎn)物，正常情況下機(jī)體血液中無表達(dá)或僅有少量表達(dá)，發(fā)生腫瘤時血液含量明顯升高，因此血液中腫瘤標(biāo)志物的種類和含量對于腫瘤的早期篩查、診斷以及腫瘤的預(yù)后跟蹤監(jiān)測和復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移具有重要意義[2,13].

研究發(fā)現(xiàn)，HER2基因在15%～20%的乳腺癌細(xì)胞中過表達(dá)，而且HER2陽性乳腺癌患者惡性程度更高，預(yù)后更差[14].目前基于組織學(xué)方法的HER2檢測方法有IHC和FISH等，然而對于HER2陽性乳腺癌患者的病程和治療效果動態(tài)監(jiān)控亟需開發(fā)更為簡便的方法[7,15].研究人員對乳腺癌患者治療前后和不同分期的血清和組織樣本進(jìn)行回顧性研究，發(fā)現(xiàn)早期乳腺癌患者血清HER2均為陰性，血清HER2升高或降低超過20%不僅與疾病進(jìn)展有關(guān)，而且與治療效果有關(guān)[8,16].對不同分期原發(fā)性乳腺癌患者血清和組織樣本研究，發(fā)現(xiàn)血清HER2水平與腫瘤組織中HER2胞內(nèi)段/胞外段高度一致，提示臨床上通過檢測腫瘤病人血清中的HER2蛋白水平作為腫瘤診斷以及治療方案制定的標(biāo)準(zhǔn)是具有科學(xué)依據(jù)的，其變化趨勢可作為腫瘤患者預(yù)后的評估指標(biāo)[17-20].此外，檢測血清中HER2蛋白水平可以避免組織活檢對患者的傷害，同時對復(fù)發(fā)性或轉(zhuǎn)移性的腫瘤進(jìn)行動態(tài)監(jiān)測以輔助判斷疾病進(jìn)程或治療效果.

為了開展試劑的研發(fā)工作，本研究首先建立了HER2蛋白試劑盒的檢測方法.在生物素標(biāo)記抗體的制備中，本課題組對所使用的抗體經(jīng)Protein A和Westorn blot方法進(jìn)行了鑒定，并對檢測條件進(jìn)行工藝篩選.此外，該試劑盒從檢測方法的建立到分析性能評估、等效性分析均符合國家藥監(jiān)局的要求，并參考了大量的CLSI文件.檢測結(jié)果顯示本試劑盒準(zhǔn)確度、重復(fù)性良好，且在線性范圍0～300 ng/mL內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r均不低于0.990 0，線性范圍廣，靈敏度高，且與西門子公司生產(chǎn)的HER2檢測試劑盒檢測結(jié)果具有很好的一致性.表皮生長因子受體家族包括4個成員：HER1受體、HER2受體、HER3受體和HER4受體，為了評估該試劑盒的特異性，測定了與質(zhì)量濃度最大為10 000 ng/mL的人表皮生長因子受體(EGFR或HER1)的交叉反應(yīng)率，結(jié)果為0.05%，表明該試劑盒的特異性良好.

本研究開發(fā)的試劑盒采用目前市面上主流的磁微?；瘜W(xué)發(fā)光法，與進(jìn)口廠家進(jìn)行試劑一致性分析，均具有較好的相關(guān)性，且該試劑盒結(jié)合全自動化學(xué)發(fā)光分析儀，可實(shí)現(xiàn)樣本的隨到隨檢，可降低總的檢測成本.

綜合以上評估，本試劑盒具有檢測時間短、操作簡便、自動化程度高、重復(fù)性和準(zhǔn)確度高、特異性好等特點(diǎn)，應(yīng)用和推廣前景巨大，但尚需收集相關(guān)臨床數(shù)據(jù)以評估其臨床效能，為進(jìn)一步優(yōu)化血清HER2蛋白檢測提供參考，為提升乳腺癌的診療效果提供技術(shù)支撐.