猴樟葉片轉(zhuǎn)錄組測序及鹽堿脅迫響應(yīng)基因表達模式研究

韓浩章 張麗華 李素華 趙 榮 王曉立 王 芳

（宿遷學(xué)院建筑工程學(xué)院，江蘇 宿遷，223800）

猴樟(Cinnamomun bodinieri)為樟科、樟屬常綠喬木，樹形美觀，材質(zhì)優(yōu)良，具有生長迅速、適應(yīng)性強等優(yōu)點，多分布于我國湘西、湖北、云南、貴州、四川等省，在城鎮(zhèn)荒山綠化中有較大面積栽培，是重要的造林綠化樹種和經(jīng)濟樹種[1]。目前，國內(nèi)外關(guān)于猴樟的報道主要集中于精油資源[2]、材用特性[3?4]、光合特性[5]和育苗技術(shù)[6]等方面。河南農(nóng)業(yè)大學(xué)2012 年將猴樟引入北方地區(qū)栽培，認為猴樟的抗寒性要優(yōu)于香樟[7?8]，其盆栽幼苗在?7 ℃低溫持續(xù)過程中可表現(xiàn)出一定的抗寒性[9]，使猴樟在我國鄭州地區(qū)栽培成為可能。樟屬植物在鹽堿栽培環(huán)境條件下常表現(xiàn)為生長緩慢、葉色黃化、光合速率下降、抗性下降等現(xiàn)象[1]，課題組從2016 年開始將猴樟優(yōu)系引種至江蘇地區(qū)進行栽培，發(fā)現(xiàn)猴樟在蘇北地區(qū)鹽堿栽培條件下表現(xiàn)比樟（C.camphora）更好的抗性[1,10]。植物響應(yīng)堿脅迫的機制十分復(fù)雜，已發(fā)現(xiàn)甜菜堿醛脫氫酶基因（BADH）等滲透調(diào)節(jié)相關(guān)基因、抗壞血酸酶基因（APX）等抗氧化相關(guān)基因、Na+/K+轉(zhuǎn)運蛋白基因（HKT）等離子區(qū)隔轉(zhuǎn)運基因、質(zhì)子泵基因（VHA）等生長調(diào)節(jié)相關(guān)基因、苯丙烷類次生代謝途徑因子（MYB）等轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子均與鹽堿脅迫密切相關(guān)[11]。在櫸樹（Zelkova schneideriana）[12]、銀杏（Ginkgo biloba）[13]、白沙蒿（Artemisia sphaerocephala）[14]上的研究結(jié)果表明，鹽堿脅迫條件下植物體內(nèi)的脯氨酸含量會大大提高，抗性強的樹種中含有更高的脯氨酸含量。外源施用脯氨酸能夠促進植物光合能力和水分利用能力[15?16]，還能通過誘導(dǎo)紫花苜蓿（Medicago sativa）抗氧化酶活性提高抗鹽堿脅迫能力[17]，脯氨酸在猴樟耐堿脅迫過程中起重要作用。基于此，課題組在前期研究基礎(chǔ)上[10]，以2 個耐鹽堿猴樟品系和1 個鹽堿敏感品系猴樟3 年生種苗為材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)，分析猴樟耐鹽堿脅迫相關(guān)代謝通路，篩選出差異表達基因，以期為猴樟耐鹽堿脅迫機理研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗在宿遷學(xué)院樟屬植物栽培基地鹽堿土壤環(huán)境試驗區(qū)進行。試驗區(qū)土壤pH 值8.17，電導(dǎo)率1 153 μS/cm，含有機質(zhì)13.85 g/kg、有效鉀15.94 μg/g、有效鐵12.07 μg/g、銨態(tài)氮61.75 μg/g、硝態(tài)氮266.75 μg/g、有效磷36.55 μg/g，可溶性鹽含量15.89 mg/g。

試驗材料取自樟屬植物栽培基地耐鹽堿性表現(xiàn)較好的同一株優(yōu)樹，于2017 年10 月采種，2018年3 月上旬播種，2020 年3 月上旬進行種苗表型鑒定與標記，2 個耐鹽堿猴樟品系（標注為YYHZ和HJHZ）和1 個鹽堿敏感猴樟品系（標注為HDHZ）3 年生種苗，其中HJHZ 為普通猴樟，YYHZ 和HDHZ 為猴樟變種，YYHZ 和HJHZ 鹽堿耐受能力優(yōu)于HDHZ[10]。同時移入鹽堿土壤環(huán)境試驗區(qū)進行栽培，株行距均為1.5 m。2020 年8 月20 日取3 個表型猴樟作為材料，同一高度枝條頂部幼嫩葉片進行液氮速凍后，于?80 ℃冰柜保存，各設(shè)3 個生物學(xué)重復(fù)。

1.2 研究方法

1.2.1 總RNA 提取、文庫構(gòu)建及測序

用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）試劑盒提取葉片材料總RNA，利用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA 的完整性，利用艾本德Bio-Photometer D30 核酸蛋白測定儀測定OD260/280的值，檢測總RNA 的純度和濃度，委托南京綠正生物科技有限公司進行cDNA 文庫構(gòu)建，采用qRT?PCR 對文庫有效濃度進行準確定量，庫檢合格后進行Illumina 測序。

1.2.2 基因功能注釋

對猴樟采用無參考基因組的轉(zhuǎn)錄組分析，經(jīng)過原始數(shù)據(jù)過濾、測序錯誤率檢查、GC 含量分布檢查，獲得后續(xù)分析使用的過濾后數(shù)據(jù)（clean reads），對聚類得到的基因序列（Unigene）進行基因功能注釋?；蚬δ茏⑨屗玫降臄?shù)據(jù)庫包括 NR(NCBI non-redundant protein sequences)、NT（NCBI nucleotide sequences）、PFAM（Protein family）、KOG（euKaryotic Ortholog Groups）、SwissProt（A manually annotated and reviewed protein sequence database）、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genesand Genome)、GO(Gene?Ontology)。

1.2.3 差異表達基因篩選

采用 DESeq 對基因表達進行差異分析，首先對原始讀數(shù)（read count）進行標準化，然后通過統(tǒng)計學(xué)模型進行假設(shè)檢驗概率（Pvalue）的計算，最后進行多重假設(shè)檢驗校正（BH），得到錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR 值）。差異基因（DEGs）的篩選條件 為Pvalue≤ 0.01，| log2Fold Changes | ≥ 1。其中，F(xiàn)old Changes 代表不同處理之間基因表達量的比值。該值大于1 時，則該基因認定為上調(diào)表達；反之，則為下調(diào)表達。

1.2.4 差異表達基因功能注釋和富集分析。

采用GOseq 和KOBAS 軟件對每個差異比較組合的上調(diào)差異基因集、下調(diào)差異基因集進行GO 功能富集分析和KEGG 通路富集分析，以判定差異 Unigene 主要影響的生物學(xué)功能或通路。

1.3 差異表達基因驗證

為了驗證猴樟耐鹽堿脅迫轉(zhuǎn)錄組結(jié)果的準確性，從差異基因數(shù)據(jù)庫中挑選6 個參與精氨酸與脯氨酸代謝的差異表達基因進行分析。用RNAperp Pure Plant Kit（天根，北京）試劑盒提取材料的總RNA，按照PrimeScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa，大連）方法去除基因組DNA 后，用TR Prime Mix（random primer）進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得cDNA 產(chǎn)物。以課題組前期篩選出的Actin1 為內(nèi)參基因，利用 Primer 5.0 設(shè)計引物，由南京天擎科技有限公司合成引物，引物序列已列出（表1）。按照AceQ qPCR SYBR Green Master Mix (without ROX)試劑盒方法配制10 μL反應(yīng)體系。通過Bio?Rad CF96X（伯樂，美國）進行實時熒光定量 PCR 分析。具體反應(yīng)體系如下：5 μL 2×SYBR Green Mix，各 0.5 μL 上/下游引物（10 μmol/L），2 μL cDNA 模 板，2 μL dd H2O，反應(yīng)條件如下：預(yù)變性 95 ℃ 5 min；擴增95 ℃ 10 s，60 ℃退火延伸 30 s，共 40 個循環(huán)；熔解曲線95 ℃ 15 s，65 ℃ 1 min，95 ℃ 30 s，95 ℃15 s。采用 2?ΔΔCT法計算相對表達量，每個樣品 3次重復(fù)。

表1 驗證基因的引物序列Table 1 The primer sequence of the validated gene

2 結(jié)果與分析

2.1 猴樟葉片總RNA 質(zhì)量檢測結(jié)果分析

由表2 可以看出，3 個不同表型的猴樟共構(gòu)建了9 個cDNA 文庫用于轉(zhuǎn)錄組測序。9 個樣品最后得到21 634 177～23 235 930 條clean reads，堿基數(shù)6.49～6.97 G，數(shù)據(jù)整體測序錯誤率均為0.03%，Q20 為97.62%～97.99%，Q30 為93.1%～93.9%，GC含量為46.87%～47.49%。表明猴樟轉(zhuǎn)錄組測序的質(zhì)量控制良好，得到的過濾后數(shù)據(jù)庫（clean data）質(zhì)量合格，數(shù)據(jù)可用于后續(xù)基因注釋和功能分類等要求。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)質(zhì)量Table 2 Transcriptome sequencing quality

2.2 Unigenes 的基因功能注釋

以NR、NT、KEGG、SwissProt、PFAM、GO、KOG 這7 個數(shù)據(jù)庫為參考，利用Blast 將de novo 組裝得到的72 369 條Unigenes 與之進行比對和注釋（見表3）。注釋到NR、NT、KEGG、Swiss-Prot、PFAM、GO、KOG 數(shù)據(jù)庫中的Unigenes 分別有33 769、20 048、11 186、22 952、24 988、24 986和6 513 條，其中注釋到NR 的Unigenes 最多，占比46.66%，而注釋到KOG 數(shù)據(jù)庫中的Unigenes最少，占比8.99%。在7 個數(shù)據(jù)庫中至少1 個數(shù)據(jù)庫注釋成功的Unigenes 有39 156 條，占比54.1%，而與7 個數(shù)據(jù)庫都能匹配成功的Unigenes 有3 884條，占比5.36%，另有33 213 條Unigenes 尚未成功注釋，占比45.9%。

表3 基因注釋結(jié)果統(tǒng)計Table 3 Statistics of annotation results

2.3 Unigenes 的NR 功能注釋

利用Blast 將已組裝所獲得的Unigenes 序列與NR 數(shù)據(jù)庫進行信息比對，得到屬于同源序列的物種和各物種的同源序列數(shù)目。由圖1 可知，共有5 個同源性較高的物種，成功注釋33 769條Unigenes，其中猴樟與沉水樟（C.micranthum）有26 036 條同源Unigenes，占 比77.1%；與蓮（Nelumbo nucifera）有1 114 條同源Unigenes，占比3.3%；與葡萄（Vitis vinifera）有743 條同源Unigenes，占比2.2%；與博落回（Macleaya cordata）有642 條同源Unigenes，占比1.9%；與茶（Camellia sinensis）有203 條同源Unigenes，占比0.6%；另外，仍有14.9% 的Unigenes 未能得到NR 數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果。

圖1 猴樟Unigenes 在NR 數(shù)據(jù)庫比對統(tǒng)計Fig.1 Statistical chart of C.bodinieri Unigenes in NR database

2.4 差異基因表達分析

如圖2、圖3 所示，以HJHZ 為對照，統(tǒng)計分析差異基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在 HDHZ vs.HJHZ 組中共有5 415 個DEGs，包含3 204 個上調(diào)基因和2 211 個下調(diào)基因，在 YYHZ vs.HJHZ 組中共有4 665 個DEGs，包含2 546 個上調(diào)基因和2 119 個下調(diào)基因。HDHZ vs.HJHZ 組和 YYHZ vs.HJHZ 組共有的上調(diào)基因數(shù)量為701 個，共有的下調(diào)基因為773 個。從 DEGs 數(shù)量可以看出，鹽堿土壤條件下，HDHZ vs.HJHZ 上調(diào)基因相對較多，說明HDHZ 對鹽堿土壤環(huán)境更敏感。

圖2 HDHZ vs.HJHZ 和YYHZ vs.HJHZ 上調(diào)差異基因表達韋恩圖Fig.2 Wayne map of HDHZ vs.HJHZ and YYHZ vs.HJHZ up regulating differential gene expression

圖3 HDHZ vs.HJHZ 和YYHZ vs.HJHZ 下調(diào)差異基因表達韋恩圖Fig.3 Wayne map of HDHZ vs.HJHZ and YYHZ vs.HJHZ down-regulating differential gene expression

2.5 差異表達基因的GO 功能分析

GO 是描述基因功能的綜合性數(shù)據(jù)庫（http://www.geneontology.org/），可分為生物過程（Biological Process，BP）和細胞組成（Cellular Component，CC ）分子功能（Molecular Function，MF）3 個本體（ontology）。GO 功能顯著性富集分析基于基因組背景，以Padj（通過Benjamini-Hochberg 校正的Pvalue值）小于0.05 為顯著富集，給出差異表達基因與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)，并統(tǒng)計被顯著富集的各個GO term 中的基因數(shù)。由表4 可知，HDHZ vs.HJHZ 組的上調(diào)基因中共有3 834 個DEGs 顯著富集到GO 注釋的42個小分類中，包括20 個BP 子分類、2 個CC 子分類和20 個MF 子分類。在BP 分類中，含有DEGs 數(shù)目最多的前3 個小分類為“蛋白質(zhì)磷酸化”、“磷酸化”和“磷代謝過程”。在CC 分類中主要是“轉(zhuǎn)錄調(diào)控復(fù)合物”。在MF 分類中富集的 DEGs 總數(shù)量最多，其中最多的為“轉(zhuǎn)移酶活性”、其次是“作用于蛋白質(zhì)的催化活性”和“核苷酸結(jié)合”，再次是“腺嘌呤核苷酸結(jié)合”、“腺苷酸結(jié)合”、“含磷基團轉(zhuǎn)移酶活性”，說明磷素代謝、核苷酸代謝、能量代謝和轉(zhuǎn)錄調(diào)控參與HDHZ 響應(yīng)鹽堿脅迫過程。HDHZ vs.HJHZ 組的下調(diào)基因中共有169 個DEGs 顯著富集到GO 注釋的8 個小分類中，包括2 個 BP 子分類、6 個MF 子分類。在BP 分類中主要是“DNA 整合”，在MF分類中富集的 DEGs 總數(shù)量最多的為“ADP 結(jié)合”、其次是“作用于成對供體上、與分子氧結(jié)合或還原的氧化還原酶活性”，再者是“碳氧裂解酶活性”及“鎂離子結(jié)合”，說明鹽堿脅迫可能影響了HDHZ 的能量代謝和鎂離子結(jié)合能力，進一步影響葉綠素合成。

表4 猴樟轉(zhuǎn)錄組DEGs 的GO 功能分類統(tǒng)計Table 4 GO functional classification and statistics of C.bodinieri transcriptome Unigenes

續(xù)表4

續(xù)表4

YYHZ vs.HJHZ 組的上調(diào)基因中共有188 個DEGs 顯著富集到 GO 注釋的7 個小分類中，包括1 個 BP 子分類、6 個 MF 子分類。在 BP 分類中，主要是“DNA 整合”，在 MF 分類中富集的DEGs 總數(shù)量最多的為“ADP 結(jié)合”、其次是“轉(zhuǎn)移己糖基的轉(zhuǎn)移酶活性”，說明糖基化在YYHZ 響應(yīng)鹽堿脅迫中起重要作用。YYHZ vs.HJHZ 組的下調(diào)基因中共有143 個DEGs 顯著富集到 GO 注釋的4 個MF 小分類中。主要為“ADP結(jié)合”、“四吡咯結(jié)合”、“血紅素結(jié)合”、“作用于成對供體上、與分子氧結(jié)合或還原的氧化還原酶活性”，說明色素合成、呼吸代謝與HJHZ響應(yīng)鹽堿脅迫有關(guān)。

2.6 差異表達基因的KEGG 代謝通路分析

DEGs 富集的 KEGG 通路分析是指 DEGs 在某一通路上是否發(fā)生顯著差異（over-presentation）通常用富集因子（Enrichment Factor，DEGs 注釋到某通路的基因比例與所有基因中注釋到該通路的基因比例的比值）和qvalue（多重假設(shè)檢驗校正之后的Pvalue）來表示，一般富集因子越大，表示DEGs 在該通路中的富集水平越顯著,qvalue越小，表示差異表達基因在該通路中的富集顯著性越可靠，因此，在 DEGs 注釋的 KEGG 通路散點圖中越靠近右下角的圖形代表的通路，參考價值越大。由圖4～5 可知，在HDHZ vs.HJHZ 組中，上調(diào)差異表達基因主要富集于酪氨酸代謝、植物?病原菌互作、苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成、異喹啉生物堿生物合成、類胡蘿卜素生物合成、精氨酸和脯氨酸代謝。由此可以看出，生物堿類代謝、氨基酸代謝在HDHZ 響應(yīng)鹽堿脅迫中起重要作用。下調(diào)差異表達基因主要富集于倍半萜和三萜的生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、卟啉和葉綠素代謝、植物?病原菌互作、光合作用?天線蛋白、角蛋白、枯草堿和蠟質(zhì)生物合成、光合生物的碳固定、檸檬酸循環(huán)（TCA 循環(huán)）。說明HDHZ 的光合作用、呼吸作用及生長發(fā)育受到鹽堿脅迫的抑制。如圖6、圖7 所示，在YYHZ vs.HJHZ 組中，上調(diào)差異表達基因主要富集于倍半萜和三萜的生物合成、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白質(zhì)加工、植物?病原菌互作、類黃酮生物合成；下調(diào)差異表達基因主要富集于酮體的合成與降解、二苯乙烯、二芳基庚烷和姜辣素的生物合成、非同源末端連接、鞘糖脂生物合成?globo 系列、丁酸代謝。說明YYHZ 和 HJHZ 響應(yīng)鹽堿脅迫的機制不盡相同。

圖4 HDHZ vs.HJHZ 組上調(diào)差異表達基因KEGG 富集散點圖Fig.4 HDHZ vs.HJHZ group upregulated differential expression gene KEGG enrichment distribution map

圖5 HDHZ vs.HJHZ 組下調(diào)差異表達基因KEGG 富集散點圖Fig.5 HDHZ vs.HJHZ group down-regulated differential expression gene KEGG enrichment distribution map

圖6 YYHZ vs.HJHZ 組上調(diào)差異表達基因KEGG 富集散點圖Fig.6 YYHZ vs.HJHZ group upregulated differential expression gene KEGG enrichment distribution map

圖7 YYHZ vs.HJHZ 組下調(diào)差異表達基因KEGG 富集散點圖Fig.7 YYHZ vs.HJHZ group down-regulated differential expression gene KEGG enrichment distribution map

2.7 實時熒光定量驗證

為了驗證轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的可靠性，隨機選取與猴樟耐鹽堿脅迫相關(guān)的精氨酸和脯氨酸代謝通路中6 個相關(guān)基因Cluster?10916.3837（脯氨酸脫氫酶，ProDH）、Cluster?10916.26309（δ?1?吡咯啉?5?羧酸合成酶，P5CS）、Cluster?10916.42256（天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶，GOT1）、Cluster?10916.29904（NAD+）醛脫氫酶，ALDH）、Cluster?10916.33165（多胺氧化酶，PAO4）、Cluster?10916.8872（S?腺苷甲硫氨酸脫氫酶，AMD1），以Actin1 為內(nèi)參基因，進行實時熒光定量PCR 驗證。將qRT?PCR數(shù)據(jù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行比較，結(jié)果如圖8 所示，通過pearson 相關(guān)性分析表明，qRT?PCR 結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果在 0.05 水平下相關(guān)性顯著，所選擇的基因的表達趨勢基本一致，從而說明本研究RNA 測序結(jié)果較為可靠，同時也表明精氨酸和脯氨酸代謝與猴樟耐鹽堿脅迫有關(guān)。

圖8 猴樟葉片轉(zhuǎn)錄組qPCR 驗證結(jié)果Fig.8 The qPCR verification results of the transcriptome of C.bodinieri leaves

3 結(jié)論與討論

葉片是植物與環(huán)境因子信息交換的媒介，直觀反映植物與環(huán)境因子的關(guān)系，能從信號傳導(dǎo)、滲透調(diào)節(jié)、離子區(qū)化、活性氧清除、次生代謝、光合作用、呼吸作用等多個方面應(yīng)對鹽堿脅迫[18?19]。本研究利用Illumina HiseqTM測序平臺對3 個不同表型猴樟葉片在鹽堿栽培環(huán)境條件下的轉(zhuǎn)錄本信息進行分析，根據(jù)差異基因（DEGs）Pvalue≤ 0.01，| log2Fold Changes | ≥ 1 的條件，在HDHZ vs.HJHZ 組中共篩選出5 415 個DEGs，包含3 204 個上調(diào)基因和2 211 個下調(diào)基因，在 YYHZ vs.HJHZ 組中共篩選出4 665 個DEGs，包含2 546 個上調(diào)基因和2 119 個下調(diào)基因。HDHZ vs.HJHZ 組中上調(diào)基因最多，HDHZ 對鹽堿環(huán)境條件更為敏感，與課題組前期研究結(jié)論一致[10]。通過GO 功能分析來看，HDHZ vs.HJHZ 組的上調(diào)基因中共有3 834 個DEGs 得到注釋，下調(diào)基因中僅有169 個DEGs 得到GO 注釋，主要富集于能量代謝、氧化還原能力、鎂離子結(jié)合能力和磷素代謝等方面。鹽堿脅迫會引起植物葉綠素含量下降[20]，抗氧化酶系統(tǒng)先升后降[21?22]，呼吸作用改變[23]，氧化還原能力受到影響[24]；鹽堿脅迫還會引起根際土壤缺磷，從而誘導(dǎo)有機酸的產(chǎn)生[23]，土壤供磷能有效提高植物的鹽堿適應(yīng)能力[25]，磷素代謝與猴樟響應(yīng)鹽堿脅迫密切相關(guān)，與多田琦[26]在柳枝稷（Panicum virgatum）上、李慧姬[18]在辣椒（Capsicum annuum）上的研究結(jié)論基本一致。YYHZ 和HJHZ 對鹽堿脅迫耐受能力均高于HDHZ，YYHZ vs.HJHZ 組的上調(diào)基因中僅有188 個DEGs 得到GO 注釋，主要富集于糖基化作用，而植物體內(nèi)的糖基化作用與激素合成、黃酮類物質(zhì)合成、非生物防御密切相關(guān)[27]，與多田琦[26]在柳枝稷上的研究結(jié)果類似。YYHZ vs.HJHZ 組的下調(diào)基因中僅有143 個DEGs 得到GO 注釋，主要富集于色素代謝和氧化還原能力方面，與He 等[24]的結(jié)論類似。由此可見，由于遺傳背景和脅迫程度的差異，植物鹽堿脅迫響應(yīng)受多基因表達的調(diào)控。

植物體內(nèi)存在多條通路響應(yīng)鹽堿脅迫，如堿脅迫下番茄（Lycopersicon esculentum）中SAM 合成酶基因SISAM1 可以通過多胺代謝調(diào)控提高耐堿性[27]，星星草（Puccinellia tenuiflora）中很多與H+轉(zhuǎn)運及檸檬酸合成相關(guān)的基因上調(diào)表達[28]，生長素及茉莉酸途徑在柑橘適應(yīng)堿脅迫中發(fā)揮重要作用[29]，野生大豆（Glycine max）通過改變光合途徑使其保持鹽堿脅迫下較高的光合作用和根系活力[30]。本實驗中對DEGs 注釋的KEGG 通路分析結(jié)果表明，HDHZ vs.HJHZ 組中的上調(diào)基因多富集于生物堿類代謝和氨基酸代謝通路，在YYHZ vs.HJHZ 組中上調(diào)差異表達基因主要富集于倍半萜和三萜的生物合成和類黃酮生物合成通路，而下調(diào)控基因主要富集于色素代謝、酚類物質(zhì)代謝相關(guān)通路。因而，不同植物響應(yīng)鹽堿脅迫的代謝通路不盡相同，HDHZ 的耐鹽堿能力較弱，結(jié)合研究中選取的6 個差異表達基因的qRT?PCR 結(jié)果來看，生物堿類、精氨酸和脯氨酸代謝可能在猴樟響應(yīng)堿脅迫過程中起主要作用，與賈旭梅等[31]在海棠（Malus spectabilis）上、曹盈[32]在遼寧堿蓬（Suaeda liaotungensis）上的研究結(jié)論一致。而HJHZ 和YYHZ 的耐鹽堿能力均優(yōu)于HDHZ，但兩者參與鹽堿脅迫響應(yīng)的代謝通路不盡相同，其原因還有待于進一步研究。