痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平與患兒哮喘嚴(yán)重程度及氣道重塑的相關(guān)性分析

何國慶，李斌

兒童哮喘已被證實為一種慢性氣道炎癥性疾?。?］。該病可導(dǎo)致患兒氣道反應(yīng)性增加，臨床主要表現(xiàn)為長時間反復(fù)出現(xiàn)的咳嗽、喘息、氣促以及胸悶等癥狀，且在夜間或清晨癥狀有加劇現(xiàn)象［2］。近幾年兒童哮喘發(fā)病率持續(xù)上升。據(jù)相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，2000 年以前我國兒童哮喘患病率約為0.91%，2000年以后已上升為1.60%，該病已嚴(yán)重影響患兒成長階段的身心健康［3］?；純合钪匾? 個病理改變?yōu)闅獾姥装Y、氣道重塑和平滑肌功能紊亂，其中氣道炎癥是患兒哮喘最基本的病理改變，也是氣道高反應(yīng)和病情反復(fù)發(fā)生的重要因素之一［4］。這種氣道內(nèi)炎癥會導(dǎo)致機體分泌大量的白細(xì)胞介素-8（IL-8）、白細(xì)胞介素-25（IL-25）、腫瘤壞死因子（TNF-α）等炎癥因子，直接損傷肺組織。這些炎癥因子可作為患兒哮喘的檢測指標(biāo)［5］。人中性粒細(xì)胞防御素（HNP1-3）主要分布于人多形核中性粒細(xì)胞（PMN）中。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，患兒哮喘時多種細(xì)胞都能夠表達(dá)HNP1-3；人軟骨糖蛋白-39（YKL-40）作為由多種細(xì)胞分泌的一種與炎癥相關(guān)的糖蛋白，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為其在免疫炎癥反應(yīng)、刺激血管生成以及抗細(xì)胞凋亡等方面起到重要作用［6］。然而臨床上關(guān)于IL-25、HNP-13、YKL-40 表達(dá)水平與患兒哮喘嚴(yán)重程度的研究并不多見。本研究對比分析哮喘患兒痰中IL-25、HNP-13、YKL-40 表達(dá)水平與哮喘嚴(yán)重程度的關(guān)系以及與氣道重塑的相關(guān)性。報告如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2019 年1 月至2020 年6 月在海安市人民醫(yī)院就診的214 例急性哮喘患兒作為研究對象，根據(jù)《2014 年全球哮喘防治創(chuàng)議委員會兒童支氣管哮喘最新修訂指南》［7］，將所有患兒分為輕度組、中度組、重度組3 組。其中，輕度組58例，男37 例，女21 例，平均6～13 歲［（8.46±4.44）歲］；中度組91 例，男58 例，女33 例，年齡7～14 歲［（9.39 ± 5.62）歲］；重度組65 例，男38 例，女27例，年齡7～12 歲［（8.17 ± 4.12）歲］。同期選擇50例健康幼兒作為對照組，其中，男28 例，女22 例，年齡6～14 歲［（9.76±4.57）歲］。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 患兒納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合兒童支氣管哮喘診斷標(biāo)準(zhǔn)；（2）近1 個月無糖皮質(zhì)激素治療史；（3）無其他過敏性疾病；（4）年齡≤14 歲；（5）患兒及其家長簽署本研究知情協(xié)議書。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）入院前2 周出現(xiàn)急性呼吸道感染；（2）合并支氣管擴張、肺間質(zhì)性疾病等肺部其他疾??；（3）合并肝硬化、糖尿病以及嚴(yán)重臟器疾病；（4）無法配合研究者。對照組健康幼兒納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）監(jiān)護(hù)人均知情同意；（2）身體健康。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）有支氣管疾病家族史；（2）研究期間退出試驗者。各組幼兒一般資料經(jīng)檢驗差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審定批準(zhǔn)。

1.3 治療方法 全部患兒入院后均進(jìn)行規(guī)范治療，給予孟魯司特鈉等常規(guī)治療，治療期間根據(jù)患兒具體病情給予β2受體激動劑治療，合并感染患兒給予對應(yīng)抗生素治療，1 周/療程，共4 個療程。

1.4 觀察指標(biāo) （1）肺功能指標(biāo)檢測。采用德國耶格MasterScreen PFT System 型肺功能儀（德國耶格公司）檢測并比較患兒及受試者肺功能第1秒用力呼氣量（FEV1）、用力肺活量（FVC）及最大呼氣峰流速（PEF）。（2）痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 表達(dá)水平檢測。按照肖偉等［8］提供的誘導(dǎo)痰步驟，總誘導(dǎo)痰時間不超過30 min，于1 h 內(nèi)將痰液稱重并加入5 倍0.1% 的二硫蘇糖醇，然后根據(jù)使用習(xí)慣反復(fù)吹打并置于搖床搖蕩5 min，隨后置于37℃恒溫箱培育15 min，培育完成后用無菌紗布過濾掉多余的黏液并置于離心管內(nèi)，以3 000 r/min 離心10 min，取上層清液，-80℃下儲存待檢。采用酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）法測定痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 表達(dá)水平，所用試劑由美國R＆D 公司提供，試劑均在有效期內(nèi)，首先將特異性抗體與固相載體結(jié)合成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體及雜質(zhì)，加受檢標(biāo)本，保溫反應(yīng)，形成固相抗原抗體復(fù)合物，再洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)，加酶標(biāo)抗體，保溫反應(yīng)，使固相免疫復(fù)合物上的抗原與酶標(biāo)抗體結(jié)合，再次徹底洗滌未結(jié)合的酶標(biāo)抗體；最后加底物顯色，固相上的酶催化底物成為有色產(chǎn)物，利用酶標(biāo)儀檢測其450 nm的波長，根據(jù)5 點定標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其濃度，線性范圍為0.1～800.0 ng/ml，檢測下限為0.1 ng/ml。（3）氣道重塑情況評估。采用高分辨CT 評估氣道重塑情況，于主動脈弓上緣掃至肺尖，以右上葉尖段支氣管為觀察點，檢測支氣管管壁厚度（T）、管壁面積（WA）、支氣管管壁厚度與氣管外徑之比（WT%）、支氣管管壁橫截面積占支氣道總橫截面積的百分比（WA%）等指標(biāo)，并分析與氣道重塑的相關(guān)性，數(shù)值越大代表氣道重塑越嚴(yán)重。本研究以WA%值作為氣道重塑程度指標(biāo)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析所得數(shù)據(jù)，全部數(shù)據(jù)均符合正態(tài)分布，計數(shù)資料組間構(gòu)成比、率的比較采用卡方檢驗；計量資料2 組間均數(shù)比較采用t檢驗，2 組以上均數(shù)比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，對2 組計量資料間的相關(guān)性進(jìn)行Pearson 檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組肺功能指標(biāo)和基底膜厚度比較 輕度組、中度組、重度組的FEV1、FVC、PEF 水平顯著低于對照組，而基底膜厚度大于對照組（P＜0.05），隨著病情加重輕度組、中度組、重度組的FEV1、FVC、PEF 水平顯著降低，基底膜厚度顯著增加（P＜0.05）。見表1。

表1 輕度組、中度組、重度組與對照組肺功能指標(biāo)和基底膜厚度比較（±s）

表1 輕度組、中度組、重度組與對照組肺功能指標(biāo)和基底膜厚度比較（±s）

注：與對照組比較aP＜0.05，與輕度組比較bP＜0.05，與中度組比較cP＜0.05。FEV1 為第1秒用力呼氣量，F(xiàn)VC 為用力肺活量，PEF 為最大呼氣峰流速

組別對照組輕度組中度組重度組F 值P 值例數(shù)50 58 91 65--FEV1（%）92.39±16.87 80.47±10.15a 70.22±11.40ab 59.99±8.93abc 32.990＜0.001 FVC（%）95.87±17.71 81.84±12.76a 72.19±10.07ab 61.87±9.62abc 38.793＜0.001 PEF（%）113.85±21.26 89.03±11.68a 82.00±11.31ab 70.56±8.41abc 45.872＜0.001基底膜厚度（μm）2.49±0.71 4.23±0.91a 5.30±1.23ab 6.49±1.42abc 36.856＜0.001

2.2 各組痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平比較輕度組、中度組、重度組的IL-25、HNP1-3、YKL-40水平顯著高于對照組（P＜0.05），隨著病情加重輕度組、中度組、重度組的IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平顯著增高（P＜0.05）。見表2。

表2 輕度組、中度組、重度組與對照組痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平比較（±s）

表2 輕度組、中度組、重度組與對照組痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平比較（±s）

注：與對照組比較aP＜0.05，與輕度組比較bP＜0.05，與中度組比較cP＜0.05。IL-25 為白細(xì)胞介素-25，HNP1-3 為人中性粒細(xì)胞防御素，YKL-40 為人軟骨糖蛋白-39

組別對照組輕度組中度組重度組F 值P 值例數(shù)50 58 91 65--IL-25（pg/ml）162.57±21.46 285.63±25.72a 366.23±33.03ab 453.75±40.63abc 53.862＜0.001 HNP1-3（ng/ml）216.59±15.84 420.07±21.43a 498.98±37.92ab 579.03±41.26abc 44.839＜0.001 YKL-40（ng/ml）38.52±4.17 45.93±7.73a 54.06±9.94ab 68.99±11.01abc 48.694＜0.001

2.3 痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平與患兒哮喘嚴(yán)重程度及氣道重塑程度相關(guān)性分析 分別以PEF%值、WA%值代表哮喘嚴(yán)重程度及氣道重塑程度，經(jīng)Pearson 檢驗，痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平與患兒哮喘嚴(yán)重程度及氣道重塑呈正相關(guān)。見表3。

表3 痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平與哮喘嚴(yán)重程度及氣道重塑相關(guān)性分析

3 討論

哮喘3 個主要病理改變?yōu)闅獾姥装Y、氣道重塑和平滑肌功能紊亂，其中氣道炎癥是哮喘病理生理的基礎(chǔ)，可進(jìn)一步導(dǎo)致氣道重塑和平滑肌功能障礙。在患兒氣道炎癥反應(yīng)中，主要通過釋放一些顆粒蛋白及白三烯和血小板活化因子等細(xì)胞因子使支氣管收縮，從而導(dǎo)致氣道損傷、氣道反應(yīng)性增加?；純合呐R床表現(xiàn)與氣道上皮結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，受損的上皮細(xì)胞不僅在氣道重塑過程中起到重要作用，還在修復(fù)狀態(tài)時分泌出多種細(xì)胞因子，如IL-25、白細(xì)胞介素-33（IL-33）等促進(jìn)炎癥反應(yīng)的進(jìn)展。本研究中發(fā)現(xiàn)，患兒痰中IL-25 水平顯著高于健康對照組，并且隨著病情的加重其水平顯著增高。經(jīng)Pearson 檢驗顯示，其與患兒哮喘嚴(yán)重程度和基底膜厚度呈正相關(guān)。而上皮基底膜增厚是患兒早期氣道重塑特征性病理變化，亦是氣道重塑的重要內(nèi)容。分析原因可能為IL-25 通過誘導(dǎo)輔助型T 細(xì)胞2（Th2 細(xì)胞）產(chǎn)生白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-5（IL-5）以及白細(xì)胞介素-13（IL-13）等因子。由此可見，通過對不同細(xì)胞產(chǎn)生不同的生物學(xué)效應(yīng)促進(jìn)了哮喘患兒的氣道炎癥反應(yīng)。

有研究發(fā)現(xiàn)，部分患者在治療時盡管全身應(yīng)用激素或白三烯調(diào)節(jié)，但哮喘炎癥細(xì)胞仍然繼續(xù)存在，其中以多形核白細(xì)胞（PMN）為多見，而HNP1-3主要分布在PMN 中，因此患兒哮喘時多種炎癥細(xì)胞均可表達(dá)HNP1-3［9］。本研究通過檢測對比各組之間HMP-13 水平，發(fā)現(xiàn)患兒痰中HMP-13 水平顯著高于健康對照組，并且隨著病情加重其水平顯著增高。經(jīng)Pearson 檢驗顯示，其與患兒哮喘嚴(yán)重程度和基底膜厚度呈正相關(guān)。目前HNP1-3 在患兒哮喘中的具體病理機制尚不清楚。羅槑等［10］在研究中指出，HNP1-3 具有廣譜抗菌活性，但當(dāng)其濃度過高時會有細(xì)胞毒作用，釋放到細(xì)胞外會引起組織損傷。趙勁波等［11］也在研究中指出，HNP1-3 可以介導(dǎo)上皮細(xì)胞釋放炎癥因子從而參與炎癥反應(yīng)。因此，在患兒哮喘過程中，HNP1-3 可能介導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞釋放出大量趨化因子，從而參與氣道炎癥反應(yīng)，并形成惡性循環(huán)。

隨著對患兒哮喘的深入研究，炎癥因子YKL-40 被發(fā)現(xiàn)。YKL-40 可由多種細(xì)胞分泌，目前其生物學(xué)功能尚未完全闡明，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為YKL-40在免疫炎癥反應(yīng)、刺激血管生成以及抗細(xì)胞凋亡方面等起到重要作用［12］。本研究通過檢測對比各組之間YKL-40 水平，發(fā)現(xiàn)患兒痰中YKL-40 水平顯著高于健康對照組，并且隨著病情加重其水平顯著增高。經(jīng)Pearson 檢驗顯示，其與患兒哮喘嚴(yán)重程度和基底膜厚度呈正相關(guān)，與王聰慧［13］的研究結(jié)果基本一致。YKL-40 在患兒哮喘中的具體病理機制尚不清楚，但I(xiàn)lmarinen 等［14］在研究中指出，YKL-40 在炎癥反應(yīng)中扮演了“哨兵”角色，其可以將嗜酸性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞募集到感染部位，從而導(dǎo)致組織發(fā)生炎癥、免疫、重塑。因此，在患兒哮喘過程中，YKL-40 可能通過介導(dǎo)炎癥因子的表達(dá)分泌，參與患兒的免疫反應(yīng)，調(diào)控微血管生成相關(guān)信號通路，促進(jìn)了氣道炎癥反應(yīng)的發(fā)生、發(fā)展。本研究中PEF%值、WA%值代表哮喘嚴(yán)重程度及氣道重塑程度，經(jīng)Pearson 檢驗，痰中IL-25、HNP1-3、YKL-40 水平與患兒哮喘嚴(yán)重程度及氣道重塑呈正相關(guān)。這可能是哮喘發(fā)作期間氣道內(nèi)炎癥會分泌大量的IL-25，引起機體免疫反應(yīng)，造成多形核白細(xì)胞分泌大量的HNP1-3；此外，哮喘發(fā)病期間機體會進(jìn)一步分泌YKL-40 來刺激血管生成、抗細(xì)胞凋亡，達(dá)到緩解哮喘的目的。然而，劉保華［15］在哮喘的研究中未見YKL-40 水平與患者病情有相關(guān)性，與本研究結(jié)果不符，可能與劉保華等人在研究時給予患者糖皮質(zhì)激素治療，從而影響了YKL-40 水平的表達(dá)有關(guān)。

本研究尚存在一定不足之處：（1）未能進(jìn)一步對各指標(biāo)基因、分子進(jìn)行深入研究；（2）未能對各指標(biāo)相關(guān)因子進(jìn)行研究，如IL-4、IL-8；（3）未同時分析IL-25、HNP1-3、YKL-40 三者聯(lián)合檢測在診斷患兒哮喘嚴(yán)重程度及氣道重塑中的意義等。后續(xù)仍需更多的基礎(chǔ)研究進(jìn)行驗證。