不同核酸提取方法SARS-CoV-2核酸檢測(cè)性能比較

【摘要】目的：研究不同核酸提取方法在SARS-CoV-2核酸檢測(cè)中的應(yīng)用性能。方法：選取3種經(jīng)過預(yù)處理的核酸提取試劑作為觀察對(duì)象，分別使用磁珠吸附法、樣本釋放劑A、樣本釋放劑B其進(jìn)行提取，獲取陰性樣本、陽性樣本，通過RNA技術(shù)獲得20%～28%稀釋度的SARS-CoV-2標(biāo)準(zhǔn)品，并使用熒光逆轉(zhuǎn)錄聚合酶反應(yīng)（RT-PCR）對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，由此獲得Ct值，隨后評(píng)估不同提取方法下SARS-CoV-2核酸的檢測(cè)性能。結(jié)果：不同核酸提取方法下，SARS-CoV-2試劑的陰性樣本、陽性樣本的檢測(cè)符合率均是100%，使用磁珠吸附法獲得的核酸樣本變異系數(shù)（CV）與樣本稀釋法（A、B）比較降低，樣本稀釋劑A的CV值最大，稀釋劑B的CV值次之。使用磁珠吸附法與樣本釋放劑B獲得的核酸檢出限為156mg/ml，低于樣本釋放劑A的檢出限625.0mg/ml。結(jié)論：在SARS-CoV-2核酸試劑檢測(cè)中，使用磁珠吸附法對(duì)試劑的提取效率更高，并且重復(fù)性好，在大批量SARS-CoV-2試劑樣本檢測(cè)中，可推廣該提取方法。

【關(guān)鍵詞】核酸檢測(cè)方法;不同提取方法;SARS-CoV-2;檢測(cè)性能

新冠病毒肺炎（COVID-19）的致病原為SARS-CoV-2，根據(jù)我國衛(wèi)生健康委員會(huì)《新型冠狀病毒肺炎診療方案》（試行第7版）規(guī)定，通過RT-PCR檢測(cè)SARS-CoV-2陽性即為新冠病毒感染患者。在具體檢測(cè)中，相關(guān)人員按照試劑檢測(cè)說明書，在磁珠吸附法的作用下，將采集的鼻咽拭子存放在保存液中，使用56℃的滅活疫苗，培養(yǎng)30min后，提取自動(dòng)化設(shè)備，以聚合酶反應(yīng)，對(duì)PCR模板進(jìn)行擴(kuò)增，以獲取陽性樣本。該方法的檢測(cè)效率較高，并且操作便利、檢測(cè)時(shí)間較短，具有推廣價(jià)值。

1資料及方法

1.1一般資料

10例陽性樣本資料為廣州邦德盛公司提供的SARS-CoV-2RNA標(biāo)準(zhǔn)品，其濃度為2.0*106mg/ml，病毒核酸編號(hào)分別為GBW（B）092244、GBW（B）092243，10例陰性樣本來源于健康體檢者咽拭子。

使用的樣本釋放劑A為國盛醫(yī)學(xué)科技有限公司提供。樣本釋放劑B阿、磁珠吸附法所用核酸提取試劑均來源于達(dá)安基因有限公司。檢測(cè)所用的熒光定量PCR儀來源于瑞士羅氏公司。

1.2方法

根據(jù)核酸提取說明書，以樣本釋放劑A、樣本釋放劑B提取樣本，將樣本置入到采樣管中滅活、對(duì)其進(jìn)行震蕩離心、選取上層清液作為PCR模板，并對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增。

參考磁珠吸附法、核酸提取試劑說明書，使用核酸提取儀器完成對(duì)CoV-2 RNA的自動(dòng)提取，選取200μL的樣本與核酸洗脫液體100μL，按照吸附法一般流程，對(duì)其進(jìn)行吸附操作，并完成對(duì)樣本的制備。

在具體操作中，使用RT-PCR實(shí)時(shí)熒光法與試劑盒，對(duì)制備后的SARS-CoV-2核酸進(jìn)行檢測(cè)，為實(shí)現(xiàn)理想的檢驗(yàn)結(jié)果，需要對(duì)熒光RT-PCR的條件進(jìn)行規(guī)定，第一次溫度控制在50℃、時(shí)間為15min、第二次溫度為90℃，時(shí)間為15min;第三次溫度為55℃，吸附時(shí)間為45s。

1.3觀察指標(biāo)

觀察檢測(cè)結(jié)果符合率、判定檢測(cè)結(jié)果為陽性、陰性的例數(shù)。其中陽性標(biāo)準(zhǔn)為FAM通道有明顯擴(kuò)增曲線，且循環(huán)閾值Ct≤40;陰性標(biāo)準(zhǔn)為FAM通道無擴(kuò)增曲線，且Ct值>40。

2結(jié)果

2.1陽性與陰性符合率比較結(jié)果

采樣人員使用不同方式采集了10例健康人群的咽拭子樣本，其檢測(cè)結(jié)果為陰性，陰性符合率為100%;對(duì)陽性樣本進(jìn)行檢測(cè)分析，分別使用釋放劑A、B與磁珠吸附法，對(duì)陽性樣本進(jìn)行復(fù)檢，其中結(jié)果為陽性的樣本為10例，符合率為100%。

2.2有關(guān)重復(fù)性指標(biāo)的對(duì)比分析

對(duì)低值品與中值品進(jìn)行核酸提取與擴(kuò)增，利用磁珠吸附法和樣本釋放劑進(jìn)行重復(fù)性檢查，結(jié)果見表1：

2.3不同提取方法下的檢出率比較

以磁珠吸附法提取核酸后，對(duì)N基因的檢出率為100%，ORFlab基因的檢出率為96.85%，采用樣本釋放劑A提取核酸后，N基因檢出率為83.18%，ORFlab基因的檢出率為76.82%，使用樣本緩放劑B進(jìn)行核酸提取后，N基因的檢出率為100%，ORFlab基因的檢出率為96.28%。

3討論

COVID-19成為公共突發(fā)衛(wèi)生事件，具有傳播廣泛的特點(diǎn)，對(duì)人民群眾的健康構(gòu)成威脅，目前，對(duì)COVID-19的檢測(cè)方式為實(shí)時(shí)熒光RT-PCR標(biāo)記，其樣本的提取方式主要是磁珠吸附法。磁珠吸附法是通過蛋白變性劑使得樣本中的蛋白質(zhì)達(dá)到溶解狀態(tài)，使得核酸被解離出來，并在磁場(chǎng)和重力的作用下，將雜質(zhì)去除掉，最后獲取較為純凈的核酸樣本。樣本試劑的主要成分為核酸釋放液與保存液，在試劑作用下能夠促使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變性。

采樣完成后，操作人員需要嚴(yán)格按照試劑采樣說明書，對(duì)樣本進(jìn)行震蕩、靜置與離心，吸取上層清液作為本次檢測(cè)樣本，將其置于PCR體系中，進(jìn)行擴(kuò)增。理論上分析，病毒載量越大，則提取的病毒核酸量越多，這一現(xiàn)象在檢測(cè)結(jié)果的Ct值上有所體現(xiàn)。牛衛(wèi)東、段江洋、蔣詩苑以咽拭子和鼻試子為主要方式對(duì)患者痰液中的SARS-CoV-2核酸進(jìn)行了檢測(cè)，通過PCR獲取Ct值，其檢測(cè)結(jié)果一致性（符合率）與檢出率與本文研究結(jié)果高度相似。

綜上所述，使用磁珠吸附法檢測(cè)SARS-CoV-2核酸效果良好，與樣本釋放劑A、B比較，其符合率更高、重復(fù)性好，可對(duì)磁珠吸附法進(jìn)行推廣。

參考文獻(xiàn)

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作者簡(jiǎn)介：李俊平（1979.10-）女， 漢族，山東省聊城市高唐縣人，本科學(xué)歷，主管檢驗(yàn)師，研究方向：醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。