殼聚糖協(xié)同乳酸鏈球菌素抗輕腌大黃魚源特定腐敗菌抑制效應(yīng)研究

張小敏，郭全友，周國燕，楊 絮，黃海潮，王曉陽

（1 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 上海 200090 2 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院 上海 200093）

輕腌大黃魚（Larimichthys crocea）因營養(yǎng)豐富極易受環(huán)境因素的影響而發(fā)生腐敗，微生物生長繁殖是魚肉品質(zhì)下降的主要誘因。有部分微生物在特定條件下產(chǎn)生腐敗代謝產(chǎn)物，成為水產(chǎn)品質(zhì)變的優(yōu)勢(shì)菌群，主要原因是此類特定腐敗菌（Special spoilage organism，SSOs）降解蛋白質(zhì)產(chǎn)生生物胺、三甲胺等小分子具有刺激性氣味的代謝物，導(dǎo)致水產(chǎn)品達(dá)到感官拒絕點(diǎn)[1]。普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌是常見的腸道致病菌，均屬于革蘭氏陰性桿菌，容易引起腸胃感染，出現(xiàn)腹瀉、嘔吐等癥狀，嚴(yán)重時(shí)可能引發(fā)腦膜炎、敗血癥等疾病[2-3]。兩菌可引起高營養(yǎng)物腐敗變質(zhì)，降低食用價(jià)值，水產(chǎn)品、肉類產(chǎn)品質(zhì)量惡化與之密切相關(guān)。微生物細(xì)菌間通訊交流機(jī)制是通過信號(hào)分子調(diào)控產(chǎn)生群體感應(yīng)，引導(dǎo)生物被膜產(chǎn)生、胞外酶產(chǎn)物活性改變等群體行為[4]。生物被膜被一些富含多糖、多肽和磷脂的大分子包裹，使其不受外界侵害，附著于物體表面，具有黏附性，難以清除，污染性大[5]。腐敗菌生物被膜的形成和泳動(dòng)性受到群體感應(yīng)系統(tǒng)的調(diào)控[6]。抑菌劑可對(duì)群體行為產(chǎn)生阻礙作用，通過抑制群體感應(yīng)有效控制特定腐敗菌的腐敗能力。如使用天然抗菌劑、防腐劑、基因敲除等多種方法延長水產(chǎn)品的貨架期并減少由特定腐敗菌引起的食源性疾病的發(fā)生。二烯丙基二硫醚能夠抑制蜂房哈夫尼菌的群體感應(yīng)活性、生物被膜等，從而發(fā)揮防腐功效[7]。天然的香苦草提取物可調(diào)控普通變形桿菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，降低生物被膜、毒力因子等產(chǎn)生[8]。

抗菌劑殼聚糖、乳酸鏈球菌素具有不同的抑菌特征，已應(yīng)用于食品添加劑和生物醫(yī)用等眾多領(lǐng)域。殼聚糖為天然多糖甲殼素脫除部分乙酰基的產(chǎn)物，具有生物降解性、無毒性、降脂、廣譜抑菌性等多種生理功能，在酸性條件下帶正電荷，可與細(xì)菌細(xì)胞膜上帶負(fù)電荷的物質(zhì)結(jié)合，發(fā)生吸附作用，破壞細(xì)胞膜以致胞內(nèi)物質(zhì)滲漏出來 ，使細(xì)菌形態(tài)、細(xì)胞內(nèi)部均發(fā)生明顯變化，從而殺死細(xì)菌達(dá)到抑菌效果[9]。研究表明其抗菌活性隨脫乙?；鹊纳叨鰪?qiáng)，能進(jìn)入大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)部使菌體凹陷變形并伴有自溶現(xiàn)象[10]。乳酸鏈球菌素是由乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的多肽類天然生物抗菌劑，能夠抑制或殺死其它細(xì)菌，通常乳酸鏈球菌素對(duì)革蘭氏陽性菌（G+） 產(chǎn)生抑制作用，對(duì)革蘭氏陰性菌（G-）不存在抑菌效應(yīng)[11]。乳酸鏈球菌素對(duì)普通變形桿菌（G-）抑菌率極低，幾乎沒有明顯作用[12]。然而，據(jù)報(bào)道乳酸鏈球菌素結(jié)合殼聚糖復(fù)合作用可對(duì)大多數(shù)魚源腐敗菌（G-）產(chǎn)生協(xié)同抑菌效果。He 等[13]研究發(fā)現(xiàn)：0.6% 乳酸鏈球菌素協(xié)同1%殼聚糖對(duì)細(xì)菌生長和生物被膜形成均具有顯著的抑制作用。殼聚糖聯(lián)合乳酸鈉（SL）、乳酸鏈球菌素對(duì)魚類腐敗菌群均有協(xié)同抑制效應(yīng)，對(duì)大黃魚的保鮮具有一定的積極作用[14]。Schelegueda 等[15]證明殼聚糖、乳酸鏈球菌素和乳酸鈉聯(lián)合抑制魚類腐敗相關(guān)微生物時(shí)會(huì)產(chǎn)生協(xié)同作用，并對(duì)抗菌劑聯(lián)合應(yīng)用于魚類保鮮的可能性進(jìn)行評(píng)價(jià)。

為闡明殼聚糖、乳酸鏈球菌素對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌群體感應(yīng)的抑制作用，本文探究大黃魚魚汁在5 ℃冷藏條件下，殼聚糖和乳酸鏈球菌素對(duì)特定腐敗菌生長的影響?；跉ぞ厶堑淖钚喴志鷿舛龋仓苽? 種處理組的魚汁，探究單一及復(fù)合抑菌劑對(duì)兩菌生長特性及代謝產(chǎn)物的影響。此外，對(duì)胞外蛋白酶活性、生物被膜及生物胺等代謝產(chǎn)物定量檢測(cè)，比對(duì)單一和復(fù)合抑菌劑對(duì)兩菌的抑制效應(yīng)，旨在評(píng)估乳酸鏈球菌素復(fù)合殼聚糖是否抑制兩菌細(xì)胞生長或發(fā)生物理損傷，為輕腌大黃魚靶向抑菌提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

原料魚：冰鮮大黃魚，寧德某水產(chǎn)有限公司。

菌種來源：普通變形桿菌（Proteus vulgaris，序列號(hào)：KY684257）、蜂房哈夫尼菌（Hafnia alvei，序列號(hào)：KY684258） 均分離于5 ℃貯藏的輕腌大黃魚貨架期終點(diǎn)。

1.2 試劑與儀器

氧化三甲胺，阿拉丁生化科技有限公司；殼聚糖，coolaber 公司；乳酸鏈球菌素，浙江新銀象生物工程有限公司；色胺鹽酸鹽（純度>99%）、組胺鹽酸鹽（純度>99%）、腐胺鹽酸鹽（純度>98%）、尸胺鹽酸鹽（純度>98%）、乙酸銨、正己烷、丹黃酰氯，偶氮酪蛋白，Micklin 公司；三氯乙酸、正丁醇、三氯甲烷、丙酮、乙醚、谷氨酸鈉、碳酸氫鈉、氯化鈉、氫氧化鈉，國藥集團(tuán)；1 mol/L 鹽酸，北京天恩澤基因科技有限公司。

SW-CJ-1FB 超凈臺(tái)，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；DDSJ-308A 電導(dǎo)率儀，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；MIR-153 型高精密度低溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；Spark10M 多功能酶標(biāo)儀，瑞士帝肯公司；PHS-3C pH 計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；BIOSCREEN C 微生物生長測(cè)定儀，芬蘭Oy growth curve 公司；Avanti J-301 高速冷凍離心機(jī)，美國貝克曼庫爾特公司；NITROGEN EVAPORATOR 氮吹儀，上海安譜科學(xué)儀器有限公司；Agilent 1260 高效液相色譜，美國安捷倫科技公司；ZHWY-200H 恒溫震蕩培養(yǎng)器，上海智城分析儀器制造有限公司；紫外分光光度計(jì)，萊伯泰科有限公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海智城分析儀器制造有限公司；HY-4A 調(diào)速多用振蕩器，常州崢嶸儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 魚汁制備 參照Dalgaard 等[16]的方法略作修改，將大黃魚從真空包裝袋中取出，取肉剪成細(xì)條，組織攪拌機(jī)打碎，魚水比1∶2 煮沸15 min，過濾棄去魚渣，濾液備用。將上述濾液于4 200 r/min，離心30 min 取上清液，再次過濾。向?yàn)V液中加入0.1 mol/L 的磷酸緩沖液，用NaOH/HCl 調(diào)節(jié)pH 值為6.6±0.1。向魚汁中加入1.6 g/L 氧化三甲胺（TMAO）、40 mg/L 半胱氨酸和40 mg/L L-甲硫氨酸，分裝至試管121 ℃滅菌15 min。

1.3.2 接種液制備

1.3.2.1 最小抑菌濃度（MIC）測(cè)定 將0.01 g 殼聚糖添加至裝有20 mL 滅菌魚汁的離心管中，混勻充分溶解后，取10 mL，采用二倍梯度稀釋法稀釋至質(zhì)量濃度為500，250，125，62.5，31.25 μg/mL的接種液，以魚汁和營養(yǎng)肉湯作陰性對(duì)照。參考文獻(xiàn)[15]，特定腐敗菌5 ℃培養(yǎng)48 h，以O(shè)D600nm增長不超過0.1 為生長和不生長界限。

1.3.2.2 復(fù)合抑菌劑制備 將已經(jīng)梯度稀釋好的10 mL 殼聚糖亞抑菌濃度滅菌魚汁分別添加0.0025，0.005，0.01 g 乳酸鏈球菌素至最終復(fù)合質(zhì)量濃度組F1：62.5 μg/mL 殼聚糖；F2：62.5 μg/mL殼聚糖+250 μg/mL 乳酸鏈球菌素；F3：62.5 μg/mL殼聚糖+500 μg/mL 乳酸鏈球菌素；F4：62.5 μg/mL 殼聚糖+1 000 μg/mL 乳酸鏈球菌素。

1.3.3 菌懸液接種

1.3.3.1 菌株活化 分別挑取一環(huán)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌斜面接種至LB 肉湯培養(yǎng)基中，在30 ℃、150 r/min 搖床振蕩培養(yǎng)18 h，平板劃線法得到單菌落，挑取直徑大約為3 mm 單菌落放大培養(yǎng)，25 ℃過夜培養(yǎng)達(dá)到109CFU/mL，4 ℃存放備用，用時(shí)用生理鹽水稀釋。

1.3.3.2 菌懸液接種

1）最小抑菌濃度測(cè)定 檢測(cè)最小抑菌濃度采用微孔板法，取180 μL 不同濃度接種液至微孔板，將20 μL 約108CFU/mL 普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌菌懸液分別接種于微孔板使得最終濃度為107CFU/mL，蓋好孔板蓋置于BIOSCREEN 中速震蕩檢測(cè)OD600nm吸光度值。5 ℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)試驗(yàn)組3 個(gè)平行。

2）代謝產(chǎn)物的檢測(cè) 將100 μL 約108CFU/mL 菌懸液接種至裝有不同復(fù)合抑菌劑濃度的10 mL 魚汁中，5 ℃恒溫中速振蕩貯藏6 d，適時(shí)檢測(cè)生物被膜、胞外蛋白酶活性、生物胺等指標(biāo)，以不添加保鮮劑為空白對(duì)照組，每個(gè)指標(biāo)每個(gè)試驗(yàn)做2 個(gè)平行。

1.3.4 化學(xué)指標(biāo)

1.3.4.1 pH 值和電導(dǎo)率 取適量魚汁，分別用將pH 計(jì)和電導(dǎo)率儀探頭置于樣品液中測(cè)定，數(shù)值穩(wěn)定為結(jié)果值。

1.3.4.2 胞外蛋白酶活力 參照文獻(xiàn)[17]略作修改，將樣品在10 000×g、10 min 條件下離心，取上清液與等體積（800 μL）偶氮酪蛋白（20 g/L）混合，在30 ℃下反應(yīng)30 min；用800 μL 0.5 mol/L 三氯乙酸終止反應(yīng)。在室溫下靜止30 min 后離心（10 000×g、10 min）；取上清液與等體積1 mol/L NaOH 混合，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定波長366 nm處的吸光度值，超純水作陰性對(duì)照。

蛋白酶活性（U/mL）=（樣品吸光度值-陰性對(duì)照的吸光度值）/0.01

1.3.4.3 生物被膜 參照文獻(xiàn)[18]略作修改，分別取不同質(zhì)量濃度抑菌劑處理組魚汁180 μL 加入96 孔板中，每個(gè)菌株重復(fù)4 孔，5 ℃培養(yǎng)至合適時(shí)間后取出96 孔板，0.1 g/L 結(jié)晶紫染色15 min，棄去，超凈水洗掉多余染料后烘干，加入33%冰乙酸，每孔200 μL，放置5 min，將孔壁上結(jié)晶紫洗脫。檢測(cè)前用酶標(biāo)儀高速振蕩20 min 后，測(cè)量OD600nm。

1.3.4.4 生物胺 參考國標(biāo)GB 5009.208-2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中生物胺的測(cè)定》 的方法，使用5%三氯乙酸提取2 次，凈化2 次，正己烷除脂2 次，正丁醇/三氯甲烷（體積比1∶1）混合溶液萃取2 次，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈桑? mL 0.1 mol/L HCL 漩渦振蕩溶解。加入1 mL 飽和碳酸氫鈉溶液、100 μL 1 mol/L NaOH 溶液，1 mL 衍生試劑混勻后60 ℃恒溫水浴衍生15 min 取出加入100 μL谷氨酸鈉混勻，60 ℃恒溫水浴15 min。取出，冷卻至室溫，加入1 mL 水，漩渦混合1 min，40 ℃水浴氮?dú)獯等ゼs1 mL 丙酮。加入0.5 g 氯化鈉漩渦振蕩至完全溶解后加入5 mL 乙醚，漩渦振蕩2 min，靜置分層，取上層有機(jī)相，萃取2 次，合并萃取液氮?dú)獯蹈伞＜尤? mL 乙腈漩渦振蕩使殘留物完全溶解，0.22 μm 過濾。

色譜條件：C18 柱子，紫外檢測(cè)波長254 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫35 ℃，流動(dòng)相A 為90%乙腈/10%乙酸銨溶液，流動(dòng)相B 為10%乙腈/90%乙酸銨溶液，流速0.8 mL/min 梯度洗脫。

1.3.5 微生物生長一級(jí)模型構(gòu)建及擬合優(yōu)度

1.3.5.1 一級(jí)模型構(gòu)建 參考朱彥祺等[19]的方法利用修正Gompertz 模型擬合普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌生長情況，公式如（1）所示：

式中，y——t 時(shí)OD 值；x——時(shí)間，h；a——最小OD 值；b——最大OD 值；c——最大比生長速率，h-1；d——延滯期，h。

1.3.5.2 模型可靠性評(píng)價(jià) 通過判定系數(shù)R2，均方根誤差（Root mean square error，RMSE），偏差因子（Bias factor，Bf），準(zhǔn)確因子（Accuracy factor，Af）和殘差平方和（Sum of squared residuals，RSS）來進(jìn)行驗(yàn)證。其中R2、Af和Bf值越接近于1，RSS、RMSE 越接近于0，表明預(yù)測(cè)效果越好，評(píng)價(jià)方程如下。

式中，Xcal——預(yù)測(cè)OD 值；Xobs——實(shí)測(cè)OD值；n——實(shí)測(cè)值個(gè)數(shù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用軟件EXCEL 和SPSS 進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，SPSS 的ANOVA 進(jìn)行方差分析。P<0.05 表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，P<0.01 表示顯著性極大；采用軟件Oringin2018 擬合作圖，試驗(yàn)取值為均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 殼聚糖最小抑菌濃度

本研究在5 ℃條件下進(jìn)行試驗(yàn)，腐敗菌敏感度較低，培養(yǎng)48 h 后OD600nm值變化不大于0.1 認(rèn)為不生長，被判定為殼聚糖對(duì)細(xì)菌的最小抑菌濃度。由表1可知，殼聚糖質(zhì)量濃度大于等于125 μg/mL 對(duì)兩菌作用均為不生長。表明殼聚糖對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌的最小抑菌濃度均為125 μg/mL。

表1 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對(duì)腐敗菌生長的影響Table 1 Effects of different mass concentrations of chitosan on the growth of putrefactive bacteria

2.2 殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)腐敗菌生長情況和動(dòng)力學(xué)參數(shù)影響

0.995，均>0.95，擬合優(yōu)度良好。其生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)如表2所示，普通變形桿菌接種至空白魚汁最大比生長速率為0.0089 h-1，肉湯為0.0065 h-1，魚汁生長速率快，延滯期較肉湯短，更接近特定腐敗菌生長所需營養(yǎng)條件；此外，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的升高，最大比生長速率先升高后降低，延滯期逐漸增加。殼聚糖質(zhì)量濃度為125 μg/mL 時(shí)，最大生長比率雖較高，但其延滯期相對(duì)較長。

表2 不同質(zhì)量濃度殼聚糖對(duì)兩菌生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響Table 2 Effects of different mass concentrations of chitosan on the growth kinetic parameters of two bacteria

接種在幾種基質(zhì)上的蜂房哈夫尼菌的判定系數(shù)R2依次為0.998，0.997，0.997，0.995，0.983，均>0.98，擬合優(yōu)度良好。蜂房哈夫尼菌接種至空白魚汁最大比生長速率為0.0091 h-1，肉湯為0.0055 h-1，延滯期差異不顯著，魚汁生長速率快。此外，隨著殼聚糖添加量增加，最大生長比率先減小后升高，延滯期差異不顯著（P>0.5）。同普通變形桿菌相似，殼聚糖質(zhì)量濃度為125 μg/mL，延滯期最長。

圖1為添加不同質(zhì)量濃度殼聚糖對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌生長的影響，通過Gompertz模型擬合，得到各組數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)生長曲線。普通變形桿菌分別接種于空白肉湯、空白魚汁、添加殼聚糖質(zhì)量濃度62.5，125，250 μg/mL 的魚汁等幾種基質(zhì)中，判定系數(shù)R2依次為0.995，0.957，0.995，0.998，

圖1 不同殼聚糖質(zhì)量濃度對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌生長的影響Fig.1 Effects of different mass concentrations of chitosan on the growth of Proteus vulgaris and Hafnia alvei

綜上，普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌在各個(gè)底物條件下，魚汁生長情況比肉湯好，殼聚糖質(zhì)量濃度越高，生長越緩慢；相比蜂房哈夫尼菌而言，殼聚糖對(duì)普通變形桿菌的影響更大。相比肉湯培養(yǎng)基而言，魚汁更適和兩菌的生長，更還原兩菌的實(shí)際生長環(huán)境。

2.3 復(fù)合抑菌劑對(duì)腐敗菌生長情況及生長動(dòng)力學(xué)的影響

殼聚糖質(zhì)量濃度選擇2.1 節(jié)中的亞抑菌濃度，加入不同質(zhì)量濃度乳酸鏈球菌素，之后接種普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌。PF1-PF4 分別為F1-F4 組接種普通變形桿菌處理組，PC 為魚汁接種普通變形桿菌的空白組；FF1-FF4 分別為F1-F4 組接種蜂房哈夫尼菌處理組，F(xiàn)C 為魚汁接種蜂房哈夫尼菌的空白組。通過修正Gompertz 模型擬合不同抑菌條件下腐敗菌的生長趨勢(shì)。圖2和圖3分別為不同保鮮劑組合對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌生長情況及生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)的影響。接種普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌處理組模型評(píng)價(jià)中R2均大于0.998，普通變形桿菌Af在0.999～1.000 之間，Bf在1.013～1.024 之間，RMSE 在0.005～0.010 之間；蜂房哈夫尼菌菌Af在0.999～1.000 之間，Bf在1.014～1.025 之間，RMSE 在0.004～0.008之間，表明兩菌利用該生長模型擬合優(yōu)度良好。

圖2 復(fù)合抑菌劑對(duì)普通變形桿菌生長情況及生長動(dòng)力學(xué)的影響Fig.2 The effect of compound bacteriostatic agent on the growth and growth dynamics of Proteus vulgaris

由圖2可知，添加殼聚糖及其復(fù)合乳酸鏈球菌素對(duì)普通變形桿菌的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)最大生長比率（μmax）和延滯期（Lag）存在影響。得到如下規(guī)律，空白組μmax最大，所有處理組Lag 沒有顯著差異，隨著復(fù)合抑菌劑中乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度的增大，Lag 變化不顯著，μmax逐漸減小，然而PF3 組μmax較大，生長速度較單一接菌組快，沒有明顯的效果，其中抑制效果最好的是PF4 組。乳酸鏈球菌素本身對(duì)G-菌沒有抑制效果，然而復(fù)合殼聚糖具有一定的抑菌性能。He 等[13]研究發(fā)現(xiàn)在0.6%乳酸鏈球菌素協(xié)同1%殼聚糖對(duì)大黃魚特定腐敗菌的生長有抑制作用。

由圖3可知，添加殼聚糖及其復(fù)合乳酸鏈球菌素對(duì)蜂房哈夫尼菌的生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)μmax和Lag 存在影響。得到如下規(guī)律，空白組μmax最大，添加抑菌劑組合μmax均有所下降，其中FF1 μmax大于其余添加乳酸鏈球菌素復(fù)合抑菌組，復(fù)合抑菌組FF2 和FF3 最大生長比率（μmax）一樣，F(xiàn)F2 延滯期（Lag）略高于FF3，顯著性差異不大（P<0.05）；FF4 Lag（52.03177 h）略大于FF3（51.80112 h），μmax（0.00776 h-1）略大于FF3（0.00766 h-1），復(fù)合抑菌組合μmax、Lag 均沒有顯著性差異（P<0.05）。

圖3 不同抑菌組對(duì)蜂房哈夫尼菌生長情況及生長動(dòng)力學(xué)的影響Fig.3 The effect of compound bacteriostatic agent on the growth and growth dynamics of Hafnia alvei

綜上，復(fù)合抑菌劑對(duì)普通變形桿菌較單一抑菌劑效果好且復(fù)合抑菌劑添加1 000 μg/mL 乳酸鏈球菌素抑菌效果最佳；復(fù)合抑菌劑對(duì)蜂房哈夫尼菌較單一抑菌劑效果好，乳酸鏈球菌素添加劑量對(duì)蜂房哈夫尼菌各組生長動(dòng)力學(xué)參數(shù)無顯著性差異（P<0.05）。

2.4 pH 值變化

不同抑菌組對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌pH 值的影響如圖4所示，隨著時(shí)間延長，F(xiàn)F1、FF3組pH 值呈直接上升趨勢(shì)，可能是由于微生物生長降解魚汁營養(yǎng)生成胺類物質(zhì)，導(dǎo)致溶液中pH值上升；PF1～PF4、FF2、FF4 組pH 值先下降，貯藏3 d 之后逐漸上升，可能的原因是初期pH 值下降的原因是魚汁中營養(yǎng)成分發(fā)生糖降解產(chǎn)生乳酸等使得樣品酸度下降，隨后由于腐敗菌進(jìn)入對(duì)數(shù)期產(chǎn)生大量含氮代謝化合物，使其pH 值上升。殼聚糖是天然含氮有機(jī)化合物，溶解后生成陽離子影響pH 值[20]，使其變化規(guī)律發(fā)生紊亂。綜上，單一抑菌劑組和復(fù)合抑菌劑組對(duì)兩菌pH 值的影響不顯著（P<0.05），然而pH 值受微生物產(chǎn)生代謝產(chǎn)物影響。

圖4 不同抑菌組對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌pH 值的影響Fig.4 Effects of different antibacterial groups on pH value of Proteus vulgaris and Hafnia alvei

2.5 電導(dǎo)率變化

電導(dǎo)率表示細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)成分透過細(xì)胞膜釋放物質(zhì)的多少，可表征抑菌劑對(duì)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性和細(xì)胞活性變化的影響[23]。由圖5可知，貯藏0 ～6 d 時(shí)，接種普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌組電導(dǎo)率在一定范圍內(nèi)穩(wěn)定波動(dòng)。處理組電導(dǎo)率初始值高，因?yàn)閹д姾蓺ぞ厶欠肿佑绊慬22]。1 d 時(shí)略微下降隨后電導(dǎo)率呈上升趨勢(shì)，說明內(nèi)容物質(zhì)開始向外滲透，復(fù)合抑菌劑處理組在第5～6 天穩(wěn)定，PF1 組繼續(xù)上升。接種普通變形桿菌所有組1～3 d電導(dǎo)率上升斜率從大到小依次為PF4、PF3 和PF2、PF1 （P<0.05），PF4、PF3 內(nèi)容物滲出較多，抑制效果強(qiáng)；3～5 d 依次是PF1、PF3、PF2 和PF4（P<0.05），PF1、PF3 內(nèi)容物滲出較多，抑制效果強(qiáng)；接種蜂房哈夫尼菌所有組1～3 d 電導(dǎo)率上升斜率從大到小依次為FF1、FF3、FF2、FF4 （P<0.05），F(xiàn)F1、FF3 抑制效果強(qiáng)；3～5 d 依次是FF1、FF2、FF3 和FF4，但差異不顯著（P>0.05），由此說明添加殼聚糖和乳酸鏈球菌素可以破環(huán)細(xì)胞細(xì)胞膜，使得內(nèi)容物溢出，導(dǎo)致溶液電解質(zhì)增多，引起電導(dǎo)率改變。

圖5 不同抑菌組對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌電導(dǎo)率的影響Fig.5 Effects of different antibacterial groups on electrical conductivity of Proteus vulgaris and Hafnia alvei

2.6 胞外蛋白酶活性變化

腐敗菌通過信號(hào)分子調(diào)控菌體間的群體感應(yīng)行為，產(chǎn)生一些胞外產(chǎn)物，外界環(huán)境刺激細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的流出，影響蛋白酶活性。圖6為不同抑菌組對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌胞外蛋白酶的影響。由圖可知，不同貯藏時(shí)間段蛋白酶活性具有顯著差異（P<0.05），隨著貯藏時(shí)間的延長，各處理組胞外蛋白酶活性均呈先增強(qiáng)后減弱的變化趨勢(shì)，貯藏至第3 天胞外蛋白酶活性顯著提高，可能由于腐敗菌處于生長對(duì)數(shù)期，活性較高。貯藏至第6天時(shí)，胞外蛋白酶活略微降低，可能是微生物進(jìn)入衰亡期，活性低。由圖6a可知，貯藏至3 d 時(shí)，PF1組添加單一殼聚糖胞外蛋白酶活性最高，復(fù)合抑菌組均有所降低，其中PF2 和PF4 活性最低，推測(cè)是添加乳酸鏈球菌素后腐敗菌生長受到一定的抑制作用，導(dǎo)致胞外蛋白酶活性降低。由圖6b可知，貯藏至第3 天接種蜂房哈夫尼菌所有處理組胞外蛋白酶活性顯著上升，其中FF1 組添加活性最強(qiáng)，F(xiàn)F2 組和FF3 組酶活受到抑制較強(qiáng)，活性低，F(xiàn)F4組也受到一定的抑制作用。綜上，所有處理組在第3 天菌胞外蛋白酶活性處于最強(qiáng)，原因是腐敗菌進(jìn)入生長對(duì)數(shù)期，胞外產(chǎn)物較多，產(chǎn)酶量較高；復(fù)合抑菌組較單一抑菌組對(duì)胞外蛋白酶活性抑菌性強(qiáng)。

圖6 不同抑菌組對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌胞外蛋白酶的影響Fig.6 Effects of different antibacterial groups on extracellular protease activity of Proteus vulgaris and Hafnia alvei

2.7 生物被膜變化

圖7為接種普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌添加不同抑菌劑組合第3 天和第6 天生物被膜的生長變化情況。由圖可知，所有處理組3 d 和6 d 時(shí)生物被膜生長量沒有顯著差異（P>0.05）；貯藏至3 d 時(shí)，和單一抑菌劑處理組F1 對(duì)比，接種兩菌的復(fù)合處理組F2、F3、F4 生物被膜均形成受到一定程度的抑制，且乳酸鏈球菌素含量越高，受到的抑制作用越強(qiáng)，兩菌結(jié)果類似；貯藏至6 d 時(shí)，處理組F1、F2 生物被膜的形成量有顯著上升趨勢(shì)（P<0.05），F(xiàn)3、F4 組發(fā)生略微變化，和3 d 沒有顯著差異 （P>0.05），處理組FF3 和FF4 產(chǎn)量較FF1 和FF2 低，抑制效果更明顯。普通變形桿菌比蜂房哈夫尼菌產(chǎn)生物被膜量多。結(jié)果表明兩菌產(chǎn)膜能力受生長環(huán)境影響，添加抑菌劑抑制兩菌形成生物被膜。蜂房哈夫尼菌生物被膜形成能力受環(huán)境因素的調(diào)節(jié)，生物被膜的黏附特性可能會(huì)導(dǎo)致其致病性[23]。酰基化高絲氨酸提取物（AHL-CCE）影響銅綠假單胞菌的生長和生物膜的形成[4]。防止生物被膜的產(chǎn)生具有很重要的意義，清除微生物生物被膜可改善食品衛(wèi)生和安全性。

圖7 不同抑菌組對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌生物被膜的影響Fig.7 Effects of different antibacterial groups on biofilm of Proteus vulgaris and Hafnia alvei

2.8 生物胺變化

生物胺是微生物生長代謝產(chǎn)生的一類具有生物活性的小分子含氮化合物，是由魚體內(nèi)游離氨基酸脫羧和轉(zhuǎn)氨生成。生物胺可反映水產(chǎn)品的新鮮度，大部分水產(chǎn)品及肉禽等都含有生物胺，微生物在肉類組織中生長代謝產(chǎn)生尸胺、腐胺、組胺、色胺、酪胺等，其中腐胺和尸胺的產(chǎn)生極大的影響水產(chǎn)品品質(zhì)，是水產(chǎn)品的優(yōu)勢(shì)生物胺，通常作為魚類安全性和質(zhì)量的指標(biāo)。組胺具有較強(qiáng)的毒副性，當(dāng)腐胺和尸胺與組胺共存能夠增強(qiáng)組胺的毒性，因此要重視腐胺、尸胺和組胺等生物胺對(duì)水產(chǎn)品帶來的危害。通過國標(biāo)執(zhí)行，得到腐胺標(biāo)曲y=916.13x-367.14，判定系數(shù)R2=0.9695，尸胺標(biāo)曲y=846.69x-328.62，判定系數(shù)R2=0.9681，色胺標(biāo)曲y=71.276x+937.22，判定系數(shù)R2=0.9524；組胺y=249.36x-91.379，判定系數(shù)R2=0.9481。

圖8為不同抑菌組對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌生物胺（腐胺、尸胺、組胺）的影響，試驗(yàn)過程中幾乎不產(chǎn)色胺（圖中未展示）。由圖可知，隨著時(shí)間的延長，兩菌接種腐胺和尸胺含量逐漸增加，尸胺比腐胺產(chǎn)量高，組胺含量變化沒有顯著差異且含量高。普通變形桿菌PF3、PF4 組第1 天和第3 天未檢出腐胺，第3 天PF2、PF3、PF4 組尸胺含量小于PF1，PF4 組胺含量低；第6 天微生物處于衰亡生物胺含量不變或有所下降；幾乎所有組組胺含量具有先上升后下降的波動(dòng)趨勢(shì)；蜂房哈夫尼菌第1 天只有FF1 組檢出腐胺，第3 天尸胺含量從高到低依次是FF4、FF3、FF2、FF1，第6 天尸胺FF4 組含量最低，組胺第3 天FF1 組高于FF2、FF3、FF4 組，第6 天FF4 含量最低。綜上，兩菌尸胺產(chǎn)量高于腐胺產(chǎn)量，組胺變化沒有顯著性差異。普通變形桿菌復(fù)合保鮮劑抑菌性好于單一保鮮劑；蜂房哈夫尼菌單一和復(fù)合保鮮劑沒有顯著性差異，復(fù)合保鮮劑可抑制組胺產(chǎn)生。

圖8 不同抑菌組對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌生物胺的影響Fig.8 Effects of different antibacterial groups on bioamine contents of Proteus vulgaris and Hafnia alvei

2.9 菌落總數(shù)變化

菌落總數(shù)的變化反映了微生物的生長代謝快慢，與大黃魚安全性和貨架期直接相關(guān)，通過菌落總數(shù)的變化可以評(píng)價(jià)不同處理組對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌生長代謝的影響。由圖9可知，魚汁在5 ℃貯藏過程中不同處理情況對(duì)普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌菌落總數(shù)變化的影響，隨著時(shí)間的延長微生物菌落總數(shù)逐漸升高，當(dāng)貯藏至第6 天時(shí)，所有組均達(dá)到9 lg（CFU/mL），是微生物生長穩(wěn)定期。由圖9a所示，貯藏至第6 天時(shí)，PF4 組菌落總數(shù)相對(duì)其它組較少；由圖9b所示，貯藏至第3 天和第6 天時(shí)，F(xiàn)F4 組菌落總數(shù)較其它組少，表明PF4、FF4 組效果較好。綜上，添加乳酸鏈球菌素含量越高，對(duì)細(xì)菌生長抑制作用越大。

圖9 魚汁在5 ℃貯藏過程中不同菌株菌落總數(shù)的變化Fig.9 Changes of the total viable count in fish juice during storage at 5 ℃

3 結(jié)論

以源自輕腌大黃魚特定腐敗菌普通變形桿菌和蜂房哈夫尼菌為研究對(duì)象，評(píng)價(jià)殼聚糖協(xié)同乳酸鏈球菌素對(duì)兩菌生長及細(xì)胞代謝的影響。結(jié)果表明，兩菌在魚汁中生長較肉湯好，殼聚糖對(duì)兩菌最小抑菌濃度均為125 μg/mL，乳酸鏈球菌素沒有抑制作用，單一殼聚糖對(duì)普通變形桿菌的影響更大；復(fù)合抑菌劑對(duì)普通變形桿菌較單一抑菌劑效果好，且隨著乳酸鏈球菌素質(zhì)量濃度的升高，抑制效果增強(qiáng)；單一抑菌和復(fù)合抑菌條件對(duì)蜂房哈夫尼菌生長速率的影響無顯著性差異 （P>0.05）；單一抑菌和復(fù)合抑菌條件對(duì)兩菌pH 值的影響不顯著（P<0.05），添加抑菌劑可破環(huán)細(xì)菌細(xì)胞膜，PF1、PF3、FF1、FF3 組電導(dǎo)率大，內(nèi)容物滲出較多，抑制效果顯著（P<0.01）；所有組在第3 天（生長對(duì)數(shù)期）胞外蛋白酶活性最強(qiáng)，殼聚糖和乳酸鏈球菌素對(duì)兩菌生物被膜的形成產(chǎn)生協(xié)同作用，且乳酸鏈球菌素含量越高，受到的抑制作用越強(qiáng)；殼聚糖和乳酸鏈球菌素復(fù)合雖對(duì)普通變形桿菌產(chǎn)生生物胺產(chǎn)生協(xié)同效果，對(duì)蜂房哈夫尼菌均無顯著性差異（P>0.05），但復(fù)合保鮮劑可抑制兩菌產(chǎn)組胺；PF4、FF4 組菌落總數(shù)最小，說明添加乳酸鏈球菌素含量最高，抑菌效果較好。綜上，復(fù)合抑菌劑相對(duì)單一殼聚糖效果顯著（P<0.05），殼聚糖和乳酸鏈球菌素復(fù)合發(fā)生協(xié)同抑菌效果。