牦牛乳干酪苦味肽ACE抑制活性表征的分子機制

楊保軍，梁 琪，宋雪梅

（甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 甘肅省功能乳品工程實驗室 蘭州 730070）

干酪成熟過程中酪蛋白降解程度的增加或降解過程中形成的中間產(chǎn)物沒有被充分降解時，將會產(chǎn)生苦味肽[1]，從干酪中鑒定出的苦味肽主要源自αs1-酪蛋白（αs1-Casein，αs1-CN）和β-酪蛋白（β-Casein，β-CN）的降解[2]。肽序列中含有的疏水性氨基酸如精氨酸、亮氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸和脯氨酸等是肽的苦味來源，也是苦味受體的結(jié)合位點[3]。干酪中苦味肽分子質(zhì)量在100～6 000 u。Topcu 等[4]分離出分子質(zhì)量500～4 000 u 和200～700 u 的苦味肽 （分別來源于Turkish White 干酪和Kasar 干酪），Turkish White 干酪中的疏水性片段是苦味最強的部分，色氨酸和苯丙氨酸是Kasar干酪苦味肽的共有氨基酸。Toelstede 等[5-6]從Gouda 干酪水溶性提取物中鑒定出16 種苦味肽，其中12 個肽具有較強的苦味。

肽是一類由氨基酸通過肽鍵連接而成的化合物，具有溶解性高、黏度低、易消化、易吸收等優(yōu)點[7]。蛋白質(zhì)降解肽具有一定的生理功能活性，如ACE 抑制活性和抗氧化、抗菌及降膽固醇活性等[8-9]。本課題組前期研究不同成熟溫度（5，10 ℃和15 ℃）、成熟時間（0～6 個月）牦牛乳硬質(zhì)干酪中醇溶性粗提苦味肽的ACE 抑制活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)5℃成熟6 個月牦牛乳硬質(zhì)干酪中醇溶性粗提苦味肽的ACE 最大抑制活性達(dá)（72.33±2.32）%。本實驗室宋雪梅等[1]使用葡聚糖凝膠（Sephadex G-25）色譜和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）從牦牛乳硬質(zhì)干酪中鑒定出14 種苦味肽，主要為氨基酸殘基數(shù)目7～17、分子質(zhì)量小于2 000 u 的肽，苦味肽序列中存在的疏水性氨基酸主要有脯氨酸、纈氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和異亮氨酸。Pripp 等[10]和Upadhyaya 等[11]的研究表明食源性二肽或三肽可以競爭性抑制ACE，從而具有降血壓的作用。肽的結(jié)構(gòu)特征，如肽鏈長度、氨基酸組成、肽的物化特征（如氨基酸殘基的疏水性、分子電荷和側(cè)鏈）等都會影響其生物活性[12]。BIOPEP 數(shù)據(jù)庫是目前最全面的生物活性肽數(shù)據(jù)庫[13]，分子對接是基于受體結(jié)構(gòu)，受體和配體分子之間的靜電匹配，化學(xué)環(huán)境互補和空間互補等原則模擬并尋找兩者的最佳結(jié)合模式，評價其結(jié)合構(gòu)象穩(wěn)定程度的技術(shù)，被用于尋找能與靶蛋白相互作用的多肽并說明其生物學(xué)機制[14-15]。管驍?shù)萚16]研究二肽（GF、GY、VF 和IY）與ACE 的相互作用模式與分子機制，結(jié)果表明氫鍵、疏水、靜電等作用力對二肽與ACE 的結(jié)合有影響，且氫鍵作用為主要影響因素，ACE 分子中Arg522、Glu384 和Ala354 為二肽與ACE 結(jié)合的重要活性位點，ACE 抑制二肽中N 端氨基的作用對其抑制活性影響顯著[17]。

PDB 數(shù)據(jù)庫、BIOPEP 數(shù)據(jù)庫等有效縮短了肽結(jié)構(gòu)和功能表征的研究周期，分子對接等生物信息學(xué)技術(shù)為分子水平解釋ACE 抑制肽和ACE 相互作用提供了理論依據(jù)。此外，本試驗用3 種苦味肽都不在BIOPEP 的ACE 抑制肽數(shù)據(jù)庫中。本試驗對牦牛乳硬質(zhì)干酪中鑒定出的3 種苦味肽進行理化分析，借助分子對接工具和BIOPEP 數(shù)據(jù)庫評估和表征苦味肽的ACE 抑制活性及其與ACE相互作用的分子機制。為從理論水平分析和分子水平解釋干酪苦味肽的ACE 抑制活性提供了數(shù)據(jù)支撐，對進一步完善肽數(shù)據(jù)庫奠定了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗工具和材料

1.1.1 試驗工具 Discovery Studio Client v16.1.0（DS），蛋白結(jié)構(gòu)分析軟件，用于蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究和藥物設(shè)計[18]。

1.1.2 試驗材料 以苦味肽RPKHPIK（RK7）、VYPFPGPIPN（VN10）和SLVYPFPGPIPN（SN12）為研究對象，這3 種肽均來源于牦牛乳硬質(zhì)干酪，由項目組前期工作所得，基本信息見表1。

表1 3 種牦牛乳硬質(zhì)干酪苦味肽的基本信息Table 1 Basic information on three yak milk hard cheese bitter peptides

1.2 試驗方法

1.2.1 苦味肽理化特性計算和預(yù)測 參考Soleymanzadeh 等[19]的方法使用生物信息學(xué)網(wǎng)址和數(shù)據(jù)庫提供的軟件計算和預(yù)測3 種苦味肽的理化特性。肽特性計算器（https：// pepcalc.com /）用于確定肽的分子質(zhì)量、等電點（pI）和凈電荷；ExPASy ProtParam 工具（https：//web.expasy.org/cgi-bin/protparam /protparam） 用于預(yù)測肽的不穩(wěn)定性指數(shù)；使用https：//www.peptide2.com 確定肽的疏水性氨基酸比例[12]。

1.2.2 肽結(jié)構(gòu)優(yōu)化 RK7、VN10 和SN12 的分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示，具體結(jié)構(gòu)優(yōu)化過程參考文獻[20]1.2.2 節(jié)所述。

圖1 具有ACE 抑制活性的苦味肽的分子結(jié)構(gòu)Fig.1 Molecular structure of bitter peptide with ACE inhibitory activity

1.2.3 準(zhǔn)備受體蛋白 參考Natesh 等[21]的方法，從Protein Data Bank 數(shù)據(jù)庫（www.rcsb.org）中下載ACE（PDB ID：1O86）蛋白晶體的X 射線衍射三維結(jié)構(gòu)，并用DS 軟件處理該蛋白質(zhì)，具體處理方法參考文獻[16]1.2.3 節(jié)所述。

1.2.4 分子對接 基于結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計工具Lib-Dock 能快速、精確、虛擬篩選大規(guī)模數(shù)據(jù)庫[18]，本試驗使用DS 軟件中的LibDock 程序確定苦味肽在ACE 活性部位的最佳對接位姿和相互作用關(guān)系，詳細(xì)步驟參考文獻[20]1.2.4 節(jié)所述。

1.2.5 肽數(shù)據(jù)庫比對 BIOPEP 數(shù)據(jù)庫包含多種功能活性已知的肽序列[22]，將理化分析和虛擬篩選（分子對接）后能與ACE 形成穩(wěn)定肽-ACE 復(fù)合物構(gòu)象的苦味肽與BIOPEP 數(shù)據(jù)庫中已知的ACE抑制肽作序列相似性比對，根據(jù)比對結(jié)果表征苦味肽的ACE 抑制活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦味肽理化性質(zhì)分析

通過生物信息學(xué)網(wǎng)址和數(shù)據(jù)庫提供的軟件計算和預(yù)測3 種苦味肽的理化特性，結(jié)果見表2。不穩(wěn)定性指數(shù)用于預(yù)測肽的不穩(wěn)定性，RK7 所帶凈電荷為3.1，不穩(wěn)定性指數(shù)為19.84，不穩(wěn)定性指數(shù)小于40，說明RK7 是穩(wěn)定的且較高凈電荷不影響其穩(wěn)定性，VN10 和SN12 的不穩(wěn)定性指數(shù)分別為49.44 和42.87，不穩(wěn)定性指數(shù)大于40，說明VN10和SN12 可能是不穩(wěn)定的。RK7、VN10 和SN12 分別含有3，7 和8 個疏水性氨基酸，疏水性分別為42.86%，70.00%和66.67%，顯示出適度的疏水性，由于肽與ACE 活性位點的結(jié)合與疏水性氨基酸有著本質(zhì)關(guān)系[23]，所以初步推測RK7、VN10 和SN12具有ACE 抑制活性。

表2 苦味肽理化參數(shù)表Table 2 Physical and chemical parameters of bitter peptides

2.2 分子對接

2.2.1 尋找受體結(jié)合區(qū) 借助DS 軟件中的Define and Edit Binding Site 工具尋找受體（ACE）中的空腔，以此來尋找受體中可能的結(jié)合部位，結(jié)果如圖2所示，經(jīng)過處理后系統(tǒng)視圖中自動添加10 個結(jié)合位點（Site 1～10），即找到了10 個可能的結(jié)合區(qū)域。

2.2.2 RK7 與ACE 的相互作用分析 RK7 與ACE 對接后得到52 個對接構(gòu)象，其中Site 1 區(qū)域包含50 個對接構(gòu)象，Site 3 區(qū)域包含2 個對接構(gòu)象，最佳對接構(gòu)象位于Site 1 區(qū)域（X：35.46，Y：43.15，Z：55.47，R：9 ?），對接得分為240.04，結(jié)合能為28 413.71 kJ/mol，最佳對接構(gòu)象如圖2所示。

圖2 受體中可能的結(jié)合部位Fig.2 Possible binding sites in the receptor

由圖3可知，RK7 中Arg 的胍基與ACE 的Ala356 殘基形成兩個氫鍵，鍵長分別為4.44 ? 和3.50 ?；Pro 的羧基與ACE 的Tyr360 和Ala356 殘基各形成一個氫鍵，鍵長分別為6.03 ? 和5.00 ?；Lys 的ε 位氨基與ACE 的Arg402 殘基形成一個氫鍵，鍵長為3.12 ?；RK7 尾部Lys 的α 位和ε 位氨基與ACE 的Met223 殘基各形成一個氫鍵，鍵長分別為5.07 ? 和4.68 ?。RK7 與ACE 的Arg402（5.10 ?）、Gly404（3.64 ?）、Glu411（5.39 ?）殘基形成范德華力或碳?xì)滏I，與ACE 的Lys118（5.42 ?）、Trp357 （4.44 ?）、Asp358 （4.25 ?）、Glu403（5.98 ?）和Lpr702（7.65 ?）殘基形成鹽橋、靜電或Pi-Cation 相互作用，與ACE 的His387（5.78 ?） 殘基形成Pi-Pi T-shaped 相互作用，與ACE 的Ala63 （3.36 ?）、Met223 （6.43 ?）、Ala356（5.66 ?）、Trp357（4.86 ?）、Tyr360（5.36 ?）、Pro407（3.61 ?）、His410（4.52 ?）、Pro519（4.8 ?/5.40 ?）殘基形成Alkyl 或Pi-Alkyl 相互作用。從以上信息可知，RK7 與Ala356 和Arg402 形成2 個相對較強的氫鍵，與Tyr360 和Met223 形成2 個相對較弱的氫鍵。Ala356 與ACE 形成了3 個氫鍵，因此RK7 和ACE 的相互作用受Ala356 的影響較大。其它相互作用力包括鹽橋、碳?xì)滏I和靜電相互作用等也參與了肽與ACE 的相互作用，詳細(xì)信息如圖3c所示，氫鍵屬于分子間較強相互作用力，使得肽與ACE 以較高親和力結(jié)合，從而使構(gòu)象得以穩(wěn)定。

圖3 RK7 與ACE 的對接構(gòu)象圖Fig.3 Docking conformation between RK7 and ACE

2.2.3 VN10 與ACE 的相互作用分析 VN10 與ACE 對接后得到1 個較好的對接構(gòu)象，該構(gòu)象位于Site 1 區(qū)域（X：35.46，Y：43.15，Z：55.47，R：9 ?），對接得分為222.34，結(jié)合能為604.71 kJ/mol，最佳對接構(gòu)象如圖4所示。

圖4 VN10 與ACE 的對接構(gòu)象圖Fig.4 Docking conformation between VN10 and ACE

由圖4可知，VN10 中Val 的氨基與ACE 的Asp358 殘基形成一個強氫鍵，鍵長為2.80 ?，Tyr的羥基與ACE 的Glu411 殘基形成一個氫鍵，鍵長為4.88 ?，Phe 和Pro 的羧基各與ACE 的Asn66殘基形成一個氫鍵，鍵長分別為5.32 ? 和5.21 ?，Asn 的氨基和胍基分別與ACE 的Glu123 和Ser517 殘基形成一個氫鍵，鍵長為5.20 ? 和4.32 ?；VN10 與ACE 的Tyr62 （6.07 ?）、Asn66（6.24 ?）、Asn85（4.00 ?）、Glu123（5.41 ?）殘基形成范德華力或碳?xì)滏I，與ACE 的Trp220 （5.26 ?）、Asp358（2.97 ?）、Tyr360（3.39 ?）殘基形成靜電相互作用，與ACE 的Tyr360（6.88 ?）、His387（5.47 ?）、Lpr702（9.41 ?）殘基形成Pi-Pi Stacked 或Pi-Pi T-shaped 相互作用，與ACE 的Trp59（5.00 ?）、Tyr62（5.48 ?）、Ala63（5.71 ?）、Ile88（5.09 ?/5.46 ?）、Tyr360（4.46 ?）、Phe391（5.11 ?）、Tyr394（6.55 ?）、Arg402（5.13 ?）、His410（6.81 ?）、Val518（6.57 ?）、Lpr702 （11.99 ?） 殘基形成Alkyl 或Pi-Alkyl相互作用。VN10 與ACE 間相互作用的詳細(xì)信息如圖4c所示，這些相互作用使VN10 和ACE 形成穩(wěn)定的復(fù)合物構(gòu)象。

2.2.4 SN12 與ACE 的相互作用分析 SN12 與ACE 對接后得到9 個對接構(gòu)象，這些構(gòu)象均位于Site 1 區(qū)域 （X：35.46，Y：43.15，Z：55.47，R：9 ?），其中最佳對接構(gòu)象的對接得分為-6.32，結(jié)合能為2 554.88 kJ/mol，最佳對接構(gòu)象如圖5所示。

由圖5可知，SN12 中Ser 的羧基與Tyr360 形成一個氫鍵，鍵長為5.78 ?，Tyr 的羥基與Asn66形成一個氫鍵，鍵長為3.74 ?，Pro 的羧基與Arg124 形成一個氫鍵，鍵長為5.12 ?，Asn 的胍基與Lys118 和Glu123 各形成一個氫鍵，鍵長為4.50 ? 和5.45 ?；SN12 與ACE 的Asn66（5.89 ?）、Tyr394（5.76 ?）、Arg402（5.10 ?）殘基形成范德華力、碳?xì)滏I或Pi-Donor hydrogen Bond 相互作用，與ACE 的Lys118 （6.08 ?） 殘基形成靜電相互作用，與ACE 的Tyr62（5.87 ?）、Trp357（3.24 ?/4.16 ?）、Lpr702（9.53 ?）殘基形成Pi-Alkyl 相互作用。SN12 與ACE 間相互作用的詳細(xì)信息如圖5c所示，造成SN12 和ACE 對接得分低的主要原因是對接過程中存在不支持兩者結(jié)合的氨基酸殘基。

圖5 SN12 與ACE 的對接構(gòu)象圖Fig.5 Docking conformation between SN12 and ACE

2.3 苦味肽功能活性表征

截止2020年12月，BIOPEP 數(shù)據(jù)庫的4 132種功能活性已知肽段當(dāng)中包含1 012 種ACE 抑制肽，將RK7、VN10 和SN12 與BIOPEP 數(shù)據(jù)庫中的ACE 抑制肽比對后發(fā)現(xiàn)RK7、VN10 和SN12 的最高相似度分別為57.14%，90.00%和75.00%，當(dāng)然RK7、VN10 和SN12 當(dāng)中也含有其它一些具有ACE 抑制活性的小肽片段，它們均處于RK7、VN10 和SN12 的不同位置，這為后續(xù)研究RK7、VN10 和SN12 經(jīng)消化酶酶切后繼續(xù)發(fā)揮ACE 抑制活性提供了可能，但前提是要充分考慮消化酶的酶切位點。

表3 RK7、VN10 和SN12 與BIOPEP 數(shù)據(jù)庫中ACE 抑制肽的相似性比對Table 3 Similarity comparison of RK7，VN10 and SN12 with ACE inhibitor peptides in the BIOPEP database

3 討論

由于親水性氨基酸殘基會干擾肽進入ACE的活性位點，因此肽序列中親水性和疏水性氨基酸比例會影響肽的ACE 抑制活性[24-25]。當(dāng)ACE 抑制肽C 端含有3 個疏水性氨基酸時，該肽具有較高的ACE 抑制活性[26-27]。另外，當(dāng)ACE 抑制肽C 端為疏水性氨基酸（如Trp、Tyr、Pro 和Phe）或芳香族氨基酸、中間為帶正電荷的氨基酸、N 端為疏水性氨基酸（Val 和Leu）時，其ACE 抑制能力較強[28-29]。此外，還有研究表明只要ACE 抑制肽的C端含有一個疏水性氨基酸，或者C 端含Arg 其側(cè)鏈胍基和Lys 的ε-氨基上帶有正電荷，均可提高肽的ACE 抑制活性[24，30]。本試驗選取的3 個肽段RK7、VN10 和SN12，其C 端均含有Pro 和Ile，N端則含有不同的疏水性氨基酸 （如Pro、Val 和Leu），將其與BIOPEP 數(shù)據(jù)庫比對后發(fā)現(xiàn)3 個肽段均含有不同數(shù)量具有ACE 抑制活性的小肽片段，這是RK7、VN10 和SN12 具有ACE 抑制活性的基礎(chǔ)。

分子對接是研究配體與靶向受體之間相互作用模式、親和性及相互作用位點的技術(shù)[31]，涉及的主要作用力有范德華力、靜電相互作用和氫鍵相互作用等。Pan 等[32]從乳清蛋白中純化出具有ACE抑制活性的2 肽LL 并將其與ACE 進行分子對接，結(jié)果表明LL 與ACE 分子中的His353、Ala354、Ser355、Glu384、Arg522 和Tyr523 通過氫鍵形成穩(wěn)定復(fù)合物。Tu 等[33]鑒定了來自酪蛋白的新型混合型高效ACE 抑制肽，該肽與ACE 的氨基酸殘基形成15 個氫鍵，多個氫鍵的相互作用顯著地增加了ACE 和肽復(fù)合物的穩(wěn)定性。ACE 活性位點的氨基酸是ACE 與具有ACE 抑制活性的肽相互作用的關(guān)鍵氨基酸，通過已經(jīng)解析的ACE 晶體結(jié)構(gòu)（PDB ID：1O86）可知，ACE 活性位點的氨基酸殘基包括：Tyr523、Arg522、Tyr520、Pro519、Val518、Ser517、Ser516、His513、Phe512、Lys511、Glu411、His410、Pro407、Phe391、His387、Glu384、His383、Val380、Ala356、Ser355、Ala354、His353、Gln281、Alu162[16，34-35]。分析RK7、VN10 和SN12 與ACE 的對接結(jié)果可知，Ala356、His387、Phe391、Pro407、His410、Glu411、Ser517、Val518、Pro519 是RK7 和VN10 與ACE 結(jié)合的重要活性位點，ACE與RK7 和VN10 的分子機制相似，均在ACE 的活性空腔內(nèi)結(jié)合，多為N 端氨基和C 端羧基參與肽段中氫鍵的形成。本試驗RK7 與ACE 形成7 個氫鍵（與ACE 活性位點形成3 個氫鍵），VN10 與ACE 形成6 個氫鍵（與ACE 活性位點形成2 個氫鍵），SN12 與ACE 形成5 個氫鍵（與ACE 活性位點不存在氫鍵），氫鍵是分子間的較強作用力，是肽與ACE 形成穩(wěn)定復(fù)合物構(gòu)象并產(chǎn)生高ACE 抑制活性的內(nèi)在因素。

4 結(jié)論

本試驗運用生物信息學(xué)方法對牦牛乳硬質(zhì)干酪中3 種苦味肽RK7、VN10 和SN12 進行理化計算和分析，將這3 種肽分別與ACE 做分子對接，結(jié)果表明ACE 分 子 中Ala356、His387、Phe391、Pro407、His410、Glu411、Ser517、Val518、Pro519 殘基是ACE 與RK7 和VN10 結(jié)合時起重要作用的殘基，肽分子中參與氫鍵形成的多為N 端氨基和C 端羧基。RK7、VN10 和SN12 與ACE 的結(jié)合表現(xiàn)出相似的作用機制，均結(jié)合于ACE 的活性空腔內(nèi)，結(jié)合區(qū)域為X：35.46，Y：43.15，Z：55.47，R：9 ?。RK7、VN10 和SN12 與BIOPEP 數(shù)據(jù)庫中的ACE抑制肽比對后發(fā)現(xiàn)其最高相似度分別為57.14%，90.00%和75.00%。綜合RK7、VN10 和SN12 與ACE 活性位點氨基酸殘基相互作用的情況和BIOPEP 數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果預(yù)測出這3 種肽段的ACE 抑制活性：VN10>RK7>SN12。3 種肽段單體的ACE 抑制活性有待通過體外試驗做進一步驗證，并通過模擬酶切研究酶切片段的ACE 抑制活性。本研究有效揭示了牦牛乳硬質(zhì)干酪中具有ACE 抑制活性的苦味肽與ACE 間相互作用的分子機制，目前RK7、VN10 和SN12 并不在具有ACE 抑制活性的BIOPEP 數(shù)據(jù)庫中，有可能作為ACE 抑制肽數(shù)據(jù)庫的擴充序列。