3種芩柏制劑體外經(jīng)皮滲透特性及其抗銀屑病作用

曾祖平， 張 璐， 王天園， 付 京， 韓旭陽(yáng)， 王 宏

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院，北京市中醫(yī)藥研究所，銀屑病中醫(yī)臨床基礎(chǔ)研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100010)

芩柏軟膏收載于《北京市醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑規(guī)程》[1]，來(lái)源于皮膚外科名老中醫(yī)趙炳南先生的臨床經(jīng)驗(yàn)方，全方由黃芩、關(guān)黃柏組成，具有清熱解毒、利濕消腫之功效，主治熱毒瘡癤、蜂窩織炎等[2], 臨床上用于治療銀屑病、毛囊炎、皮炎、濕疹等[3-4]。為了減少皮膚刺激性，提高依從性和療效，課題組前期通過提取工藝、制劑成型工藝研究結(jié)合成熟的乳膏配方[5]，將芩柏軟膏制成凝膠、乳膏劑型[6-7]，并評(píng)價(jià)三者體外釋藥[8]。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步考察芩柏軟膏、芩柏凝膠、芩柏乳膏中黃芩苷、鹽酸小檗堿體外經(jīng)皮滲透特性，以期為篩選相關(guān)制劑的適宜劑型提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100型高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent公司，配置G1312A二元泵、G1313A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1365B多波長(zhǎng)紫外檢測(cè)器、Agilent Chemstation色譜工作站)；RYJ-B型藥物透皮擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)儀(上海黃海藥物儀器有限公司)；SK7210HP型KUDOS超聲波清洗機(jī)(上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司)；超聲波細(xì)胞破碎儀(德國(guó)Bandelin公司)；全自動(dòng)染色機(jī)、輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；XS205型電子天平(十萬(wàn)分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；純水機(jī)(美國(guó)Millipore公司)。

1.2 試劑與藥物 芩柏凝膠(自制，批號(hào)20170828，黃芩苷含量1.20%，鹽酸小檗堿含量0.15%)；芩柏乳膏(自制，批號(hào)20170726，黃芩苷含量1.28%，鹽酸小檗堿含量0.13%)；芩柏軟膏(自制，批號(hào)20170315，黃芩苷含量1.22%，鹽酸小檗堿含量0.16%)；咪喹莫特乳膏(四川明欣藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)16110239)；戊巴比妥鈉(美國(guó)Sigma公司，批號(hào)01810754)。乙腈、磷酸為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水(自制)。

1.3 動(dòng)物 BALB/c雄性小鼠，體質(zhì)量20～22 g，由北京華阜康生物科技股份有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(京)2014-0004。實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京市中醫(yī)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

2 方法與結(jié)果

2.1 體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)

2.1.1 正常皮膚制備 小鼠斷頸處死，背部去毛(約2 cm×2 cm)后剪下皮膚，去除皮下脂肪組織和結(jié)締組織，生理鹽水沖洗干凈，拭干表面水分，即得，立即使用。

2.1.2 模型皮膚制備 參考Van der Fits等[9]報(bào)道的方法。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥鈉(80 mg/kg)麻醉，背部去毛(約2 cm×2 cm)，單籠飼養(yǎng)。次日取背部光滑、無(wú)傷口的小鼠，每天背部涂抹咪喹莫特乳膏50 mg，第5天斷頸處死，剪下背部銀屑病樣皮損皮膚，去除皮下脂肪組織和結(jié)締組織，生理鹽水沖洗干凈，拭干表面水分，即得，立即使用。

2.1.3 實(shí)驗(yàn)操作 采用改良的Franz擴(kuò)散池[9]。將新鮮小鼠皮膚固定于擴(kuò)散池上下兩部分之間，構(gòu)成擴(kuò)散室和接收室，表皮面向擴(kuò)散室，擴(kuò)散室底面積2.009 6 cm2，接收室容積6.6 mL。精密稱取芩柏軟膏、芩柏凝膠、芩柏乳膏各3份，每份0.5 g，涂滿整個(gè)表皮，在接收室中注入生理鹽水作為接收液，排出氣泡，使液面完全與真皮接觸，在恒速(150 r/min)、恒溫(37 ℃)下于1、2、4、6、8、10、12 h吸取接收液各3 mL，濾過，補(bǔ)加等體積的生理鹽水，測(cè)定濾液中黃芩苷、鹽酸小檗堿含量，計(jì)算累積滲透量Q，擬合體外經(jīng)皮滲透方程[8]，結(jié)果見表1～2，再以Q對(duì)時(shí)間t作圖，得體外經(jīng)皮滲透曲線，見圖1～2。

表1 3種芩柏制劑經(jīng)小鼠正常皮膚的滲透參數(shù)(n=3)Tab.1 Permeation parameters for three Qinbai preparations through normal mouse skins(n=3)

圖1 3種芩柏制劑12 h內(nèi)經(jīng)小鼠正常皮膚滲透曲線Fig.1 Permeation curves for three Qinbai preparations through normal mouse skins within 12 h

注：鹽酸小檗堿僅在芩柏凝膠8、10、12 h滲透液及芩柏軟膏10、12 h滲透液中檢出，而在芩柏乳膏中未檢出，故僅繪制黃芩苷經(jīng)皮滲透曲線。圖2 3種芩柏制劑12 h內(nèi)經(jīng)小鼠模型皮膚滲透曲線Fig.2 Permeation curves for three Qinbai preparations through model mouse skins within 12 h

表1顯示，3種芩柏制劑經(jīng)小鼠正常皮膚的體外經(jīng)皮滲透過程均符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，黃芩苷、鹽酸小檗堿滲透速率依次為芩柏凝膠>芩柏乳膏>芩柏軟膏，兩者12 h內(nèi)累積滲透量依次為芩柏凝膠>芩柏乳膏>芩柏軟膏。表2顯示，3種芩柏制劑中黃芩苷經(jīng)小鼠模型皮膚的體外經(jīng)皮滲透過程均符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程，黃芩苷12 h內(nèi)累積滲透量依次為芩柏凝膠>芩柏乳膏>芩柏軟膏。另外，小鼠正常皮膚中黃芩苷、鹽酸小檗堿滲透速率、12 h累積滲透量高于小鼠模型皮膚中。

表2 3種芩柏制劑經(jīng)小鼠模型皮膚的滲透參數(shù)(n=3)Tab.2 Permeation parameters for three Qinbai preparations through model mouse skins(n=3)

圖1顯示，3種芩柏制劑中黃芩苷、鹽酸小檗堿在不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)小鼠正常皮膚的累積滲透量依次為芩柏凝膠>芩柏乳膏>芩柏軟膏。圖2顯示，3種芩柏制劑的黃芩苷在不同時(shí)間點(diǎn)經(jīng)小鼠模型皮膚的累積滲透量依次為芩柏凝膠>芩柏乳膏>芩柏軟膏。

2.1.4 皮膚儲(chǔ)藥量測(cè)定 體外經(jīng)皮滲透實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，沿?cái)U(kuò)散池邊緣剪下有效滲透面積的小鼠皮膚(約2.009 6 cm2)，用棉簽蘸取生理鹽水，將皮膚表面殘留藥物擦拭干凈，剪碎，置于玻璃勻漿管中，加入1 mL甲醇研磨5 min至勻漿狀，轉(zhuǎn)移至離心管中，9 mL甲醇分次洗滌勻漿器，洗液并入離心管中，超聲處理10 min后4 000 r/min離心10 min，吸取上清液至EP管中，氮吹至干，2 mL甲醇溶解，濾過，測(cè)定濾液中黃芩苷、鹽酸小檗堿含量，結(jié)果見表1～2。

由此可知，小鼠正常皮膚中黃芩苷、鹽酸小檗堿12 h皮膚儲(chǔ)藥量高于小鼠模型皮膚中；與芩柏軟膏比較，芩柏凝膠中上述2種成分在小鼠正常皮膚中的儲(chǔ)藥量明顯升高，并且黃芩苷在小鼠模型皮膚中的儲(chǔ)藥量也明顯升高。另外，黃芩苷12 h皮膚儲(chǔ)藥量依次為凝膠劑>乳膏劑>軟膏劑；鹽酸小檗堿12 h皮膚儲(chǔ)藥量在小鼠正常皮膚中依次為凝膠劑>乳膏劑>軟膏劑，在小鼠模型皮膚中依次為凝膠劑>軟膏劑>乳膏劑。

2.2 3種芩柏制劑對(duì)咪喹莫特誘導(dǎo)銀屑病樣小鼠模型皮損的影響

2.2.1 造模、分組與給藥 按“2.1.2”項(xiàng)下方法造模。小鼠去毛后，采用隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、丁酸氫化可的松乳膏(尤卓爾)組、芩柏凝膠組、芩柏乳膏組、芩柏軟膏組，每組8只。除空白組外，其余各組小鼠背部每天下午涂抹5%咪喹莫特乳膏約50 mg，連續(xù)5 d，每天上午9點(diǎn)再涂抹50 mg相應(yīng)藥物，連續(xù)6 d。

2.2.2 銀屑病皮損面積和疾病嚴(yán)重程度指數(shù)(PASI)評(píng)分計(jì)算 每天上午給藥前，采用數(shù)碼照相機(jī)拍照記錄小鼠皮損情況，并依據(jù)PASI評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[10]計(jì)算紅斑、鱗屑、浸潤(rùn)程度評(píng)分，無(wú)及輕、中、重、極重度分別計(jì)0、1、2、3、4 分，以三者評(píng)分總和為總評(píng)分。

圖3顯示，空白組小鼠皮膚光滑，無(wú)鱗屑、紅斑和浸潤(rùn)現(xiàn)象；模型組小鼠于第2～3天開始出現(xiàn)輕微的背部皮膚鱗屑、紅斑、浸潤(rùn)，隨造模時(shí)間延長(zhǎng)皮損不斷加重，鱗屑多而厚，紅斑由點(diǎn)狀變?yōu)榘邏K狀，皮膚變硬變厚浸潤(rùn)明顯，提示模型建立成功；與模型組比較，3種芩柏制劑組小鼠銀屑病樣皮損癥狀有所緩解。

圖3 各組小鼠皮損Fig.3 Mouse skin lesions in various groups

圖4顯示，與模型組比較，尤卓爾組小鼠皮損PASI評(píng)分降低(P<0.05)，而3種芩柏制劑組小鼠皮損PASI評(píng)分無(wú)明顯變化(P>0.05)。

注：與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 各組小鼠皮損PASI評(píng)分Fig.4 PASI scores for mouse skin lesions in various groups

2.2.3 小鼠皮損組織形態(tài)學(xué)觀察 第6天小鼠注射過量戊巴比妥鈉后處死，剪取背部相同部位皮膚(約0.8 cm×0.8 cm)，展平，10%甲醛固定，脫水，石蠟包埋，切片，HE染色后在400倍光鏡下拍片，采用IPP 6.0圖像分析軟件，每個(gè)標(biāo)本選取5張切片進(jìn)行觀察，每張隨機(jī)測(cè)量5處從表皮角質(zhì)層到基底層的垂直厚度，分析表皮層變化情況。

圖5顯示，空白組小鼠皮膚表皮層較薄；模型組小鼠表皮突延長(zhǎng)，表皮棘細(xì)胞層明顯增厚，基底細(xì)胞核分裂像較多，并可見明顯的角化不全及角化過度，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重；與模型組比較，3種芩柏制劑組、尤卓爾組小鼠表皮層變薄，角化不全、角化過度改善，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度減輕。

表3顯示，與模型組比較，3種芩柏制劑組、尤卓爾組小鼠表皮厚度減少(P<0.01)。

表3 各組小鼠表皮厚度Tab.3 Mouse epidermal thicknesses in various

3 討論與結(jié)論

藥物體外經(jīng)皮滲透特性受藥物理化性質(zhì)、經(jīng)皮給藥系統(tǒng)、皮膚生理病理的影響[11]。芩柏軟膏、芩柏凝膠、芩柏乳膏組方藥材相同，區(qū)別在于劑型及皮膚狀態(tài)，其中芩柏凝膠主要基質(zhì)為水性凝膠基質(zhì)，生物相容性好，延長(zhǎng)了制劑在用藥部位的停留時(shí)間，而且其黏度小，有利于藥物釋放與滲透；芩柏軟膏基質(zhì)為凡士林，屬于油脂性軟膏基質(zhì)，疏水性大，釋藥性能差；芩柏乳膏基質(zhì)為O/W型乳劑，理論上藥物釋放、透皮吸收速度更快，但本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)該制劑中黃芩苷、鹽酸小檗堿體外經(jīng)皮滲透速度和程度小于芩柏凝膠，其原因可能是藥物與乳膏基質(zhì)結(jié)合緊密，不利于其釋放和滲透[5]。正常皮膚中黃芩苷、鹽酸小檗堿12 h儲(chǔ)藥量大于模型皮膚中，這是因?yàn)殂y屑病樣小鼠皮損表皮較正常皮膚明顯增厚，角質(zhì)形成細(xì)胞異常增生，而角質(zhì)層為體外經(jīng)皮滲透的主要屏障，從而阻礙了藥物的被動(dòng)擴(kuò)散。另外，鹽酸小檗堿屬季胺鹽型離子型藥物，透皮性較差，在模型皮膚滲透液中幾乎未檢出。

注：A～F分別為空白組、模型組、芩柏乳膏組、芩柏凝膠組、芩柏軟膏組、尤卓爾組。圖5 各組小鼠皮損組織形態(tài)學(xué)Fig.5 Histomorphologies for mouse skin lesions in various groups

作為芩柏制劑藥效成分，黃芩苷能改善咪喹莫誘導(dǎo)的小鼠銀屑病樣炎癥[12]，局部應(yīng)用小檗堿油酸復(fù)合物的液晶納米儲(chǔ)庫(kù)水凝膠可明顯減輕銀屑病癥狀及銀屑病炎性細(xì)胞因子水平[13]。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，3種芩柏制劑的PASI評(píng)分均不理想，推測(cè)可能與中藥在皮膚上有殘留而影響觀察有關(guān)，但不影響小鼠皮損組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果。該成分透皮特性表現(xiàn)為芩柏凝膠滲透速率、累積滲透量、皮膚儲(chǔ)藥量高于芩柏乳膏、芩柏軟膏，但三者藥效無(wú)顯著差異，其原因可能為一方面在本實(shí)驗(yàn)條件下量效關(guān)系不明顯，另一方面外用制劑基質(zhì)對(duì)藥效有影響。

綜上所述，芩柏凝膠滲透速率、累積滲透量、不同皮膚儲(chǔ)藥量高于芩柏乳膏、芩柏軟膏，并且3種芩柏制劑均有抗銀屑病作用，但最終劑型還需通過臨床試驗(yàn)來(lái)確定。