銀藍(lán)調(diào)脂膠囊調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝物質(zhì)基礎(chǔ)的篩選

鄭柳怡， 黃丹娥， 許華珍， 陳玉興*

(1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第五臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510275；2.廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院，廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 廣東 廣州 510095)

計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)(Computer-aided drug design，CADD)指基于分子模擬的分子設(shè)計(jì)技術(shù)[1]，根據(jù)靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)性質(zhì)選擇合適的方法對中藥化合物進(jìn)行篩選，得到潛在活性成分。作為計(jì)算機(jī)技術(shù)、分子藥理學(xué)和分子生物學(xué)等多學(xué)科交叉發(fā)展的基礎(chǔ)上形成的藥物研發(fā)新技術(shù)，該技術(shù)在先導(dǎo)化合物發(fā)現(xiàn)和優(yōu)化中有重要作用，可大大減少新藥創(chuàng)制的盲目性和偶然性[2]，已廣泛運(yùn)用于中藥及其復(fù)方藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機(jī)制的研究。

高脂血癥(Hyperlipidemia，HLP)是由脂質(zhì)代謝紊亂引起的某一種或多種血脂水平升高的病癥[3]，嚴(yán)重危害人類健康，已成為多種心血管疾病發(fā)生的高危因素[4]，臨床上以總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)升高作為確診標(biāo)準(zhǔn)[5]。HMG-COA、SQS是TC合成過程的2種酶，抑制兩者表達(dá)可有效抑制TC合成[6]；PPARα是TG合成的重要調(diào)控因子，可通過激動(dòng)PPARα靶標(biāo)有效抑制TG合成[7]。

銀藍(lán)調(diào)脂膠囊由銀杏葉、絞股藍(lán)、化橘紅、酒制蜂膠組成，能降低小鼠、大鼠、新西蘭兔等多種實(shí)驗(yàn)性高脂血癥動(dòng)物模型血清中TC、TG水平[8-10]，但其有效成分及作用靶點(diǎn)尚未清楚。因此，本研究將采用CADD技術(shù)，通過分子對接、相似度檢索從銀藍(lán)調(diào)脂膠囊中篩選有效降脂成分，旨在從分子水平闡釋該制劑治療高脂血癥作用的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，為其治療高脂血癥的臨床應(yīng)用及藥物開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊成分化學(xué)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫建立 以“銀杏葉”“絞股藍(lán)”“化橘紅”“蜂膠”為關(guān)鍵詞，在Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform(TCMSP) 數(shù)據(jù)庫中搜索得到403個(gè)天然小分子的化學(xué)結(jié)構(gòu)，其中銀杏葉110個(gè)，蜂膠139個(gè)，絞股藍(lán)104個(gè)，化橘紅81個(gè)。采用ChemBioDraw繪圖軟件繪制結(jié)構(gòu)式，并將結(jié)構(gòu)式、藥材來源、分子量等信息保存于ISISDatabase數(shù)據(jù)庫中。

1.2 靶蛋白選擇及可靠性認(rèn)證 選擇HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶蛋白晶體結(jié)構(gòu)作為靶標(biāo)，建立活性小分子化合物查詢庫，以銀藍(lán)調(diào)脂膠囊化合物庫為檢索庫(403個(gè)化合物)進(jìn)行檢索，設(shè)定相似度閾值為70%。采用gacf_vs相似度檢索軟件，計(jì)算檢索庫和查詢庫中化合物相似度，相似度越高，靶標(biāo)可靠性越強(qiáng)。

1.3 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊與HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶作用靶標(biāo)結(jié)合模式分析 選擇HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶蛋白晶體作為虛擬篩選靶點(diǎn)結(jié)構(gòu)，從Protein Data Bank(PDB) 數(shù)據(jù)庫中獲取分辨率<3 ?(1 ?=1×10-10m)，并且含有活性小分子配體的靶標(biāo)晶體結(jié)構(gòu)HMG-COA 13個(gè)(PDB代碼1HW9、1HWJ、1HWK、1HWL、2Q1L、2Q6C、2R4F、3BGL、3CCT、3CCZ、3CD0, 3CD7, 3CDA)，PPARα 11個(gè)(PDB代碼1I7G、1KKQ、2P54、2REW、2ZNN、3ET1、3FEI、3G8I、3KDT、3R5M、3VI8)，角鯊烯合成酶7個(gè)(1EZF、3ASX、3LEE、3Q2Z、3Q30、3V66、3VJC)。通過將靶標(biāo)所有的蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)導(dǎo)入MOE中，設(shè)定參數(shù)將蛋白質(zhì)進(jìn)行疊合，使蛋白質(zhì)按照同樣的骨架和氨基酸進(jìn)行疊合，小分子配體會(huì)隨著蛋白質(zhì)骨架的疊合而疊合在同一位置。采用MOE The Protein Ligand Interaction Fingerprints(PLIF)受體-配體相互作用指紋圖譜分析程序，分別對HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶靶標(biāo)進(jìn)行結(jié)合模式分析，即按照指紋圖譜運(yùn)算程序設(shè)定參數(shù)，得到所有晶體結(jié)構(gòu)及其配體的結(jié)合模式指紋圖譜。

1.4 對接軟件認(rèn)證 不同蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)因其所處環(huán)境(如水、離子、小分子配體等)的差異，導(dǎo)致整個(gè)蛋白質(zhì)晶體體系不同，加之不同軟件算法差異，更使得軟件對蛋白體系的適應(yīng)性有所差別，故在進(jìn)行分子對接前，應(yīng)先考慮對接軟件對目標(biāo)蛋白體系的適應(yīng)性。本研究使用Cdocker程序?qū)MG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶靶標(biāo)系統(tǒng)適用性進(jìn)行考察。

1.5 分子對接計(jì)算及結(jié)果分析 將HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶晶體結(jié)構(gòu)文件3CDA分別導(dǎo)入對接軟件，加CHARMM力場，定義受體和結(jié)合位點(diǎn)，選用Cdocker程序?qū)?，參?shù)設(shè)置為默認(rèn)值。以銀藍(lán)化合物“-Cdocker_energy”及與靶標(biāo)結(jié)合情況(以晶體靶標(biāo)蛋白的結(jié)合模式為標(biāo)準(zhǔn)，化合物與靶標(biāo)結(jié)合應(yīng)跟結(jié)合模式熱點(diǎn)殘基氨基酸全部或部分結(jié)合)為標(biāo)準(zhǔn)選出潛在活性化合物，將其與靶標(biāo)相似度進(jìn)行綜合評價(jià)，采用consensus score(CSi)方法計(jì)算同時(shí)滿足對接篩選條件和相似度>70%的化合物的CSi值，其數(shù)值越大，表明化合物活性越強(qiáng)，公式為CSi=Xi×Yi，Xi=[xi-min(x)]/[max(x)-min(x)]，其中X是化合物與靶標(biāo)對接得到的標(biāo)準(zhǔn)對接值，xi是該化合物與靶標(biāo)蛋白對接得到的歸一化數(shù)值，Yi是該化合物與已知晶體靶標(biāo)活性化合物相似度。

2 結(jié)果

2.1 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊作用靶標(biāo)及其可靠性 將HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶靶標(biāo)納入相似度搜索，采用相似度軟件計(jì)算銀藍(lán)調(diào)脂膠囊化合物庫與上述靶標(biāo)活性小分子化合物的相似性，結(jié)果以>70%相似度化合物數(shù)、平均相似度、命中比例為評判標(biāo)準(zhǔn)，大于70%化合物的數(shù)量越多，靶標(biāo)越可靠。結(jié)果，銀藍(lán)調(diào)脂膠囊化合物與已知活性化合物的相似度均大于70%，見表1。

表1 銀藍(lán)調(diào)脂膠囊化學(xué)成分與靶標(biāo)活性小分子化合物的相似度

2.2 晶體靶標(biāo)結(jié)合模式 結(jié)合模式指紋圖譜體現(xiàn)的是該蛋白與活性小分子配體結(jié)合的氨基酸的種類和個(gè)數(shù)及出現(xiàn)的頻數(shù)，出現(xiàn)頻數(shù)高的氨基酸即為熱點(diǎn)殘基。熱點(diǎn)殘基可作為判斷虛擬篩選化合物潛在活性的標(biāo)準(zhǔn)，若虛擬篩選的化合物與熱點(diǎn)殘基有結(jié)合，表明該化合物具有潛在的活性。因此，指紋圖譜結(jié)合氨基酸是后續(xù)虛擬篩選結(jié)果評判的標(biāo)準(zhǔn)之一。

2.2.1 HMG-COA 通過PLIF軟件對HMG-COA的13個(gè)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算分析，結(jié)合模式指紋圖譜(圖1)，有10個(gè)氨基酸與HMG-COA靶標(biāo)晶體結(jié)合，其中Arg590、Ser654、Asp690、Lys691、Lys692、GluB559、LysB735、AsnB755氨基酸結(jié)合率為100%，即所有晶體都與它們相結(jié)合，SerB565出現(xiàn)頻率為76.92%，Cys561出現(xiàn)頻率為23.08%。因此，Arg590、Ser654、Asp690、Lys691、Lys692、GluB559、LysB735、AsnB755是虛擬篩選化合物結(jié)合氨基酸參考標(biāo)準(zhǔn)。

圖1 HMG-COA結(jié)合模式指紋圖譜

2.2.2 PPARα 通過PLIF軟件對PPARα的11個(gè)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算分析，結(jié)合模式指紋圖譜(圖2)，結(jié)合頻率最高的氨基酸為Cys276、Ser280、Yyr314、His440、Tyr464, 結(jié)合率為90.9%；其次是Cys275、Val332，結(jié)合率為72.73；Thr279為36.36%；Leu321為27.27%；結(jié)合1次的是Glu268、Phe273、Val306、Gly313、Ile354、Met355、Leu436、Val444。因此，Cys276、Ser280、Yyr314、His440、Tyr464、Thr279、 Leu321是虛擬篩選化合物結(jié)合氨基酸參考的標(biāo)準(zhǔn)。

圖2 PPARα結(jié)合模式指紋圖譜

2.2.3 角鯊烯合成酶 通過PLIF軟件對角鯊烯合成酶的7個(gè)晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行計(jì)算分析，結(jié)合模式指紋圖譜(圖3)，其中結(jié)合率最高的氨基酸是Tyr73，為85.7%；其次是Phe54、Leu211，為71.43%；Arg77為42.86%；Arg52、Sre53、Asp80、Gln212、Asn215結(jié)合頻數(shù)為2次；Thr50、Ser51、Lys117、Try171、Arg218結(jié)合頻數(shù)為1次。因此，Tyr73、Phe54、Leu211、Arg77為熱點(diǎn)殘基氨基酸。

圖3 角鯊烯合成酶結(jié)合模式指紋圖譜

2.3 分子對接軟件適用性 將晶體結(jié)構(gòu)自身配體對接到原空間位置上，選取10個(gè)最優(yōu)構(gòu)象，將其與晶體結(jié)構(gòu)原來構(gòu)象進(jìn)行比較，要求RMSD值<1或在1個(gè)固定值范圍內(nèi)波動(dòng)，用于HMG-COA、PPARα、角鯊烯合成酶對接的晶體PDB代碼分別為3CDA、3VI8、3V66，發(fā)現(xiàn)三者自身配體對接產(chǎn)生的10個(gè)構(gòu)象與原來配體的構(gòu)象疊合，對接前后構(gòu)象變化不大，符合對接軟件適用性要求，見表2、圖4。因此，選擇Cdocker對接軟件對這3個(gè)靶標(biāo)進(jìn)行虛擬篩選。

表2 3CDA、3VI8、3Q30自身配體對接RMSD結(jié)果

注：棍棒模型表示的化合物為配體原本的構(gòu)象，線性模型表示的是對接后產(chǎn)生的構(gòu)象。圖4 3CDA、3VI8、3Q30自身配體的化學(xué)結(jié)構(gòu)及對接構(gòu)象疊合

2.4 分子對接

2.4.1 作用于HMG-CoA靶標(biāo) 使用Cdocker軟件對接并計(jì)算得到CSi值，結(jié)合相似度大于70%篩選出13個(gè)潛在的活性化合物，均來源于蜂膠，表明該藥材通過抑制HMG-COA靶點(diǎn)來抑制膽固醇合成，從而降低膽固醇水平，見表3、圖5。

表3 潛在HMG-COA抑制活性CSi值(1 kcal/mol=4.18 kJ/mol)

圖5 HMG-COA靶標(biāo)潛在活性化合物分子結(jié)構(gòu)式

2.4.2 作用于PPARα靶標(biāo) 根據(jù)CSi值，結(jié)合相似度大于70%篩選出26個(gè)潛在的活性化合物，來源于蜂膠、化橘紅，表明這2種藥材通過激活PPARα靶標(biāo)來促進(jìn)脂肪酸的分解代謝并降低體內(nèi)甘油三酯水平，見表4、圖6。

表4 潛在PPARα激動(dòng)活性CSi值(1 kcal/mol=4.18 kJ/mol)

圖6 PPARα靶標(biāo)潛在活性化合物

2.4.3 作用于角鯊烯合成酶靶標(biāo) 使用Cdocker軟件對接并計(jì)算得到CSi值，結(jié)合相似度大于70%篩選出19個(gè)潛在的活性化合物，來源于蜂膠、絞股藍(lán)、銀杏葉、化橘紅，表明銀藍(lán)調(diào)脂膠囊可通過抑制角鯊烯合成酶靶標(biāo)，使膽固醇合成通路受到抑制，從而降低體內(nèi)膽固醇水平，見表5、圖7。

圖7 角鯊烯合成酶靶標(biāo)潛在活性化合物

表5 潛在角鯊烯合成酶抑制活性CSi值(1 kcal/mol=4.18 kJ/mol)

3 討論

高脂血癥是以血液中甘油三酯以及總膽固醇異常升高為主要特征的引起脂質(zhì)水平紊亂的代謝性疾病[11]。在脂質(zhì)代謝中，PPARα是關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子之一，促進(jìn)脂肪酸合成途徑相關(guān)酶的表達(dá)，加速脂肪酸的分解代謝，降低體內(nèi)甘油三酯的水平[12]。HMG-COA還原酶是體內(nèi)生物合成膽固醇過程中的限速酶，體內(nèi)膽固醇水平的升高與該蛋白的過度表達(dá)密切相關(guān)[13]。SQS是膽固醇合成途徑中的關(guān)鍵酶，抑制SQS可以有效降低TC、TG水平[14]。前期研究發(fā)現(xiàn)銀藍(lán)調(diào)脂膠囊降低高脂血癥新西蘭兔以及高血脂癥大鼠血清TC、TG水平[8-10]。

本研究采用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)，使用gacf_vs相似度檢索軟件以及Cdocker程序?qū)︺y藍(lán)調(diào)脂膠囊化合物與HMG-COA、PPARα以及SQS靶標(biāo)蛋白的相互作用進(jìn)行了對接計(jì)算研究，發(fā)現(xiàn)蜂膠作用于HMG-COA、PPARα以及SQS靶點(diǎn)，具有多靶點(diǎn)效應(yīng)。銀藍(lán)調(diào)脂膠囊發(fā)揮調(diào)節(jié)膽固醇合成與代謝作用的主要藥物為蜂膠?；偌t作用于PPARα，發(fā)揮促進(jìn)脂肪酸代謝以降低體內(nèi)甘油三酯水平的作用，而銀杏葉與絞股藍(lán)作用于SQS靶標(biāo)，抑制膽固醇的合成。人參皂苷Rb1具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、降脂等多種藥理活性，絞股藍(lán)皂苷A具有抗炎、防治動(dòng)脈粥樣硬化的作用[15-16]。本研究發(fā)現(xiàn)，單個(gè)化合物能作用于多個(gè)靶標(biāo)，如山柰酚之于HMG和PPARα靶標(biāo)，再選擇HMG-COA、PPARα以及SQS靶標(biāo)，采用計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)聯(lián)合靶點(diǎn)反向預(yù)測的研究方法，初步闡明了銀藍(lán)調(diào)脂膠囊調(diào)節(jié)高脂血癥的物質(zhì)基礎(chǔ)及分子機(jī)制。