黃芪與川芎有效成分配伍對(duì)乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞缺氧缺糖損傷的保護(hù)作用

萬浩宇， 杜成昊， 何 昱， 楊潔紅， 丁志山， 周惠芬

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州 310053)

缺血性中風(fēng)已成為危害我國中老年人身體健康和生命的主要疾病[1-2]，到2030年我國每年新發(fā)患者將由現(xiàn)在的180萬例上升至540萬例。黃芪、川芎已成為益氣活血類中醫(yī)方劑(如補(bǔ)陽還五湯、腦心通膠囊等)的核心配伍和常用藥對(duì)，在中醫(yī)臨床上常用于治療腦血管病氣虛血瘀證，臨床療效確切[3-6]。目前，關(guān)于黃芪與川芎配伍及其中藥復(fù)方的臨床、組分、作用機(jī)理等方面已有較多研究[7-8]，但較少涉及其有效成分配伍組合。本實(shí)驗(yàn)選擇黃芪、川芎有效成分黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、川芎嗪、阿魏酸作為研究對(duì)象，通過原代培養(yǎng)乳鼠海馬神經(jīng)元構(gòu)建缺氧缺糖模型，從細(xì)胞分子水平探討其配伍對(duì)缺氧缺糖致乳鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料

1.1 試劑與藥物 黃芪甲苷(批號(hào)SZ20170301HQJG, 純度≥98%)、阿魏酸(批號(hào)SZ20170305AWS, 純度≥98%)、川芎嗪(批號(hào)SZ20170402GXQ, 純度≥98%)、藁本內(nèi)酯(批號(hào)SZ20170318GBNZ, 純度≥98%)對(duì)照品均購自南京植萃生物科技有限公司。尼莫地平片(批號(hào)170103)購自德國拜耳公司。DMEM/F12培養(yǎng)基(杭州基諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司)；Neurobasal-A培養(yǎng)基、B27補(bǔ)充液(美國Gibco公司)；L-多聚賴氨酸(美國Sigma公司)；新生胎牛血清(杭州四季青生物工程材料有限公司)；四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)、D-Hanks液、0.25%胰酶(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)；PBS緩沖液(武漢博士德生物工程有限公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)；超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法檢測(cè)試劑盒、微量丙二醛(MDA)檢測(cè)試劑盒、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；FITC AnnexinV Apotosis Detection Kit(美國BD公司)；caspase-3活性檢測(cè)試劑盒(南京碧波生物科技有限公司)。

1.2 動(dòng)物 出生24 h內(nèi)新生SD乳鼠，購自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(滬)2008-0016，飼養(yǎng)于浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心。

1.3 儀器 倒置相差熒光顯微鏡(日本Nikon公司)；超凈工作臺(tái)(上海博訊設(shè)備有限公司)；3111 CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)；SX-500高壓滅菌鍋(日本Tommy公司)；LD25-2低速自動(dòng)平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)廠)；Millipore Simplicity 純水儀(美國Millipore公司)；電熱鼓風(fēng)干燥箱VBLC310(德國Heraeus公司)；Molecular Devices Spectra-MAX Plus 384酶標(biāo)儀(美國MD公司)；BD FAC-Sculibar流式細(xì)胞儀(美國BD公司)；6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(美國Corning公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將乳鼠按壓椎體處死，在75%乙醇中浸泡3 min，剪開顱骨，分離大腦半球，移入裝有冰浴D-Hanks液的培養(yǎng)皿中，剝離雙側(cè)海馬體，將其剪碎成大小約1 mm3的組織塊，加入含EDTA的0.25%胰蛋白酶，在37 ℃培養(yǎng)箱中消化20 min，每5 min振蕩搖勻使其完全消化，20 min后終止消化，200目篩網(wǎng)過篩，收集過篩后的細(xì)胞懸液至離心管中，1 000 r/min離心10 min，傾去上清液，用培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以1×105/mL的細(xì)胞密度接種于預(yù)先以多聚賴氨酸包被過的6孔板中，接種6 h后更換成飼養(yǎng)培養(yǎng)基(97% Neurobasal-A、2% B27、1%L-谷氨酰)，每3.5 d換液1次，第7天細(xì)胞成熟后，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞純度鑒定 多聚賴氨酸包被蓋玻片置于培養(yǎng)板中，接種海馬神經(jīng)元，制作細(xì)胞爬片，7 d后待海馬神經(jīng)元成熟后取出，滴加預(yù)冷PBS洗滌3次，預(yù)冷4%丙酮固定細(xì)胞30 min，PBS洗滌3次，滴加3%雙氧水室溫下封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，滴加PBS洗滌3次，使用0.3% Triton透化15 min，滴加PBS洗滌3次，加入10%山羊血清工作液，室溫封閉10 min，棄去山羊血清，滴加兔抗大鼠NSE多克隆抗體，置于濕盒中4 ℃過夜，次日將濕盒放于37 ℃恒溫箱中復(fù)溫30 min，滴加PBS洗滌3次，加入生物素化山羊抗兔IgG二抗(1∶100)，放入恒溫箱再次孵育30 min，PBS洗滌5次，每次5 min，SABC顯色，脫水，透明，中性樹膠封片，在倒置熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核被染成淡紫色，胞漿及突起被染成棕褐色者為海馬神經(jīng)元細(xì)胞，其它細(xì)胞則不染色。隨機(jī)觀察4個(gè)視野中細(xì)胞情況，統(tǒng)計(jì)并計(jì)算其純度。

2.3 細(xì)胞毒性測(cè)定 將原代海馬神經(jīng)元細(xì)胞密度調(diào)至1×105/mL后培養(yǎng)于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中， 待其生長成熟后加入用飼養(yǎng)培養(yǎng)基配置成的不同劑量單體有效成分，24 h后加入MTT溶液20 μL，4 h后吸棄培養(yǎng)基，加入150 μL DMSO，檢測(cè)各孔光密度(OD)，確定各單體有效成分細(xì)胞毒性劑量，以細(xì)胞存活率90%以上為安全給藥劑量，計(jì)算細(xì)胞存活率，確定其高、中、低劑量，并按照正交設(shè)計(jì)4因素3水平原則分成9組。

2.4 缺氧缺糖模型建立 取含有形態(tài)成熟的乳鼠海馬神經(jīng)元的6孔培養(yǎng)板，將其分成12組，分別為正常組、模型組、陽性對(duì)照(尼莫地平)組(200 μg/mL)、配伍組(9組)，吸棄培養(yǎng)板中原培養(yǎng)基，使用無糖Earle’s培養(yǎng)液清洗3次，除正常組、模型組加不含藥物的無糖Earle’s培養(yǎng)液1 mL外，其余各組加入含有相應(yīng)藥物的無糖Earl’s培養(yǎng)液1 mL，放入造模盒中(除正常組外)，充滿混合氣(95% N2、4% CO2、1% O2)，將造模盒移入37 ℃恒溫箱中放置3 h，取出各組培養(yǎng)板，在倒置顯微鏡下觀察拍照。

2.5 海馬神經(jīng)元凋亡情況檢測(cè) 多聚賴氨酸包被蓋玻片放于12孔培養(yǎng)板，將海馬神經(jīng)元接種于其上制作細(xì)胞爬片，7 d后細(xì)胞爬片上海馬神經(jīng)元成熟時(shí)，按“2.4”項(xiàng)下方法分組，吸棄原培養(yǎng)基，PBS清洗2次，除正常組、模型組加入不含藥物的無糖Earle’ s培養(yǎng)液1 mL外，其余各組加入含相應(yīng)藥物的無糖Earle’s培養(yǎng)液1 mL，除正常組外均進(jìn)行缺氧缺糖處理，處理完畢后棄去培養(yǎng)板中液體，PBS清洗，預(yù)冷的4%多聚甲醛固定15 min，棄去多聚甲醛，滴加PBS清洗1次，加入Hoechst 33342熒光染料10 mg/L，恒溫培養(yǎng)箱中孵育30 min，在熒光倒置顯微鏡下觀察，以紫外光激發(fā)查看細(xì)胞染色結(jié)果。

2.6 SOD、LDH、GSH-Px活性與NO水平檢測(cè) 取細(xì)胞上清液，檢測(cè)各組LDH活性。按照試劑盒說明書，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)SOD、GSH-Px活性及NO水平。

2.7 早期凋亡率檢測(cè) 取海馬神經(jīng)元適量，按“2.4”項(xiàng)下方法分組，消化收集細(xì)胞，1×Binding buffer緩沖液重懸細(xì)胞，調(diào)整為3×105/mL的細(xì)胞懸液，取100 μL加到Falcon試管中，加AnnexinV- FTTC/ PI 500 μL，室溫置于暗處避光15 min，滴加1×Binding buffer緩沖液400 μL，流式細(xì)胞儀檢測(cè)海馬神經(jīng)元早期凋亡，計(jì)算海馬神經(jīng)元早期凋亡率。

2.8 海馬神經(jīng)元caspase-3活性檢測(cè) 取海馬神經(jīng)元適量，按“2.4”項(xiàng)下方法分組，按照說明書操作步驟檢測(cè)caspase-3活性。

3 結(jié)果

3.1 海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)及NSE純度 接種12 h后，細(xì)胞形狀不規(guī)則，有細(xì)小突觸，部分已貼壁生長,見圖1A。培養(yǎng)至第7天時(shí)，胞體飽滿清晰，立體感明顯，折光性變強(qiáng)，突起分支增多，互相交織形成明顯網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，見圖1B。經(jīng)檢測(cè)，細(xì)胞純度大于90%，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見圖2。

圖1 海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)(×100)

3.2 細(xì)胞安全劑量與配伍分組 采用MTT法，測(cè)得尼莫地平、黃芪甲苷、藁本內(nèi)酯、阿魏酸、川芎嗪非細(xì)胞毒性劑量分別為200、10、10、40、400 μg/mL，再按照表1中的正交設(shè)計(jì)進(jìn)行配伍分組。另外，選擇細(xì)胞存活率最高的200 μg/mL尼莫地平作為陽性對(duì)照組。

表1 正交設(shè)計(jì)配伍分組(μg/mL)

3.3 缺氧缺糖下海馬神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài) 如圖3所示，與正常組比較，模型組胞質(zhì)腫大，折光性下降，胞體內(nèi)出現(xiàn)空泡與凋亡小體，突起縮短斷裂，細(xì)胞脫壁現(xiàn)象明顯；與模型組比較，4個(gè)配伍組胞質(zhì)腫脹變大現(xiàn)象減輕，折光性較為明顯，突起斷裂現(xiàn)象減輕，胞體中空泡及散在凋亡小體減少。

圖3 缺氧缺糖下各組海馬神經(jīng)元形態(tài)

3.4 海馬神經(jīng)元細(xì)胞Hoechst 33342染色形態(tài) 如圖4所示，正常組細(xì)胞形態(tài)完整，染色均勻，胞體發(fā)出均勻的淡藍(lán)色熒光；與正常組比較，模型組細(xì)胞熒光光度增強(qiáng)，胞體內(nèi)可見大量亮藍(lán)色點(diǎn)狀或碎片狀熒光，細(xì)胞核染色較為致密，提示細(xì)胞損傷凋亡較嚴(yán)重；與模型組比較，配伍組細(xì)胞染色均勻，熒光亮度有不同程度的降低，少部分發(fā)出亮藍(lán)色熒光，胞體內(nèi)亮藍(lán)色點(diǎn)狀或碎片狀熒光數(shù)量較少。

3.5 配伍對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞SOD、LDH、GSH-Px活性及NO水平的影響 如表2所示，與正常組比較，模型組NO水平、LDH活性升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px活性降低(P<0.01)；與模型組比較，配伍組、陽性對(duì)照組均能提高SOD、GSH-Px活性，降低NO水平，抑制LDH活性(P<0.05，P<0.01)。

表2 配伍對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞SOD、GSH-Px活性、NO水平及LDH漏出量的影響

3.6 配伍對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞早期凋亡率及caspase-3活性的影響 如表3所示，與正常組比較，模型組細(xì)胞早期凋亡率、caspase-3活性升高(P<0.01)；與模型組比較，配伍組和陽性對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡率、caspase-3活性降低(P<0.05，P<0.01)。

表3 配伍對(duì)海馬神經(jīng)元細(xì)胞早期凋亡率及caspase-3活性的影響

3.7 直觀分析 如表4～5所示，有效成分對(duì)SOD活性的影響程度依次為黃芪甲苷>藁本內(nèi)酯>川芎嗪、阿魏酸，較優(yōu)組合為A3B1C3D2；對(duì)GSH-Px活性的影響程度依次為黃芪甲苷>川芎嗪>藁本內(nèi)酯>阿魏酸，較優(yōu)組合為A2B2C3D1；對(duì)NO水平的影響程度依次為川芎嗪>黃芪甲苷>阿魏酸>藁本內(nèi)酯，較優(yōu)組合為A1B1C1D1；對(duì)LDH活性的影響程度依次為黃芪甲苷>阿魏酸>川芎嗪>藁本內(nèi)酯，較優(yōu)組合為A3B3C2D1；對(duì)caspase-3活性的影響程度依次為川芎嗪>阿魏酸>黃芪甲苷>藁本內(nèi)酯，較優(yōu)組合為A2B1C2D3；對(duì)細(xì)胞早期凋亡率的影響程度依次為川芎嗪>黃芪甲苷>阿魏酸>藁本內(nèi)酯，較優(yōu)組合為A2B1C2D3。

3.8 綜合平衡法

3.8.1 川芎嗪 川芎嗪對(duì)NO水平、caspase-3活性及海馬神經(jīng)元細(xì)胞早期凋亡率都是影響最顯著的因素。對(duì)caspase-3活性、細(xì)胞早期凋亡率，取A2水平為宜；對(duì)其他指標(biāo)而言，川芎嗪極差并非最大，選擇A2水平即可。綜合考慮，選擇A2水平。

3.8.2 黃芪甲苷 黃芪甲苷對(duì)SOD、LDH、GSH-Px活性都是影響最顯著的因素，而對(duì)NO水平、細(xì)胞早期凋亡率的影響程度僅次于川芎嗪。對(duì)GSH-Px、LDH、caspase-3活性及細(xì)胞早期凋亡率，取B2水平為宜；對(duì)于SOD活性、NO水平，取B1水平為宜，B2則次之。綜合考慮，選擇B2水平。

3.8.3 阿魏酸 阿魏酸對(duì)SOD、GSH-Px活性及NO水平的影響程度最小，對(duì)LDH、caspase-3活性及細(xì)胞凋亡率，取C2水平為宜；對(duì)GSH-Px活性、NO水平，取C1水平為宜；對(duì)SOD活性，取C3水平較好。綜合考慮，選擇C2水平。

3.8.4 藁本內(nèi)酯 對(duì)SOD活性、NO水平、細(xì)胞早期凋亡率、caspase-3活性，取D2水平為宜；對(duì)GSH-Px、LDH活性，藁本內(nèi)酯影響程度不明顯，取D2水平即可。綜合考慮，選擇D2水平。

3.8.5 最優(yōu)配伍 最優(yōu)配伍方案為A2B2C2D2，即川芎嗪200 μg/mL，黃芪甲苷5 μg/mL，阿魏酸20 μg/mL，藁本內(nèi)酯5 μg/mL。

4 討論

缺血缺氧性腦病的病理損傷機(jī)理極其復(fù)雜，其中氧自由基連鎖反應(yīng)損傷是其重要的核心機(jī)制之一[9-10]。通過對(duì)細(xì)胞中SOD、GSH-Px活性與NO水平進(jìn)行檢測(cè)，能夠反映出機(jī)體缺氧狀態(tài)下的損傷程度，同時(shí)評(píng)估藥物治療效果，預(yù)估預(yù)后狀況[11]。當(dāng)機(jī)體缺氧，腦細(xì)胞損傷時(shí)，LDH開始溢出細(xì)胞外，LDH溢出越多，細(xì)胞損傷越重。因此LDH活性能夠靈敏反映機(jī)體缺氧損傷程度的，是反映細(xì)胞損傷的重要指標(biāo)。

細(xì)胞凋亡是導(dǎo)致腦缺血缺氧損傷的核心機(jī)制之一[12-13]，caspase-3活性檢測(cè)、形態(tài)學(xué)檢測(cè)及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡率是常用的重要手段[14]。腦缺血缺氧發(fā)生后，細(xì)胞線粒體膜受到損傷，通透性破壞，水分子內(nèi)流使線粒體毒性腫脹，細(xì)胞色素C分泌釋放增多，caspase-3被大量激活，使細(xì)胞走向凋亡[15]。Hoechst 33342熒光染色將凋亡細(xì)胞中的細(xì)胞核濃染、胞漿濃縮及細(xì)胞出泡現(xiàn)象，是一種理想的檢測(cè)方法。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡能夠多個(gè)角度分析細(xì)胞凋亡。AnnexinV/PI雙染色法依據(jù)細(xì)胞凋亡時(shí)會(huì)出現(xiàn)磷脂酰絲氨酸外翻現(xiàn)象與AnnexinV對(duì)PS高親和性、PI對(duì)早期細(xì)胞拒染性等特性對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。

本研究表明，與正常組比較，缺氧缺糖模型組能夠?qū)ｑR神經(jīng)元細(xì)胞造成嚴(yán)重的損傷，能夠抑制SOD、GSH-Px活性，提高NO水平與LDH活性，激發(fā)細(xì)胞內(nèi)部caspase-3活性，加重海馬神經(jīng)元早期凋亡。與模型組比較，黃芪、川芎四種有效成分正交設(shè)計(jì)配伍組能夠不同程度地提高SOD、GSH-Px活性，減少NO水平與LDH活性，抑制caspase-3活性與細(xì)胞早期凋亡，其中黃芪甲苷能夠顯著增強(qiáng)機(jī)體抗氧化能力，而川芎嗪則抑制細(xì)胞早期凋亡率。通過極差分析法，較好配伍組合為A2B2C2D2。本研究對(duì)黃芪、川芎2味中藥重要有效成分的組分配伍對(duì)于缺氧缺糖狀態(tài)下的乳鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及機(jī)制進(jìn)行初步探討，并找出優(yōu)勢(shì)配伍比例，為黃芪川芎的臨床配伍應(yīng)用提供思路。