二味杜仲湯對(duì)D-半乳糖誘導(dǎo)骨質(zhì)疏松大鼠的影響

楊 帆， 張秀艷,2， 董 馨， 馬飛祥， 陸景坤， 薛培鳳*

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110；2.呼和浩特市蒙醫(yī)中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

骨質(zhì)疏松癥是以骨強(qiáng)度下降、骨骼和骨量減少、骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加為特征的一種全身性骨代謝疾病，多發(fā)生于絕經(jīng)期婦女和老年人[1]，分為退行性骨質(zhì)疏松癥和特發(fā)性骨質(zhì)疏松癥，前者分為Ⅰ型絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥和Ⅱ型老年性骨質(zhì)疏松癥[2]。蒙藥二味杜仲湯又稱塔布森-2，由杜仲、藍(lán)刺頭2味藥配伍組成，記載于經(jīng)典蒙醫(yī)著作《蒙醫(yī)金匱》中，是蒙醫(yī)治療骨病的基礎(chǔ)方及常用方劑之一，有學(xué)者應(yīng)用該方治療60例絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者，發(fā)現(xiàn)療效明顯，總有效率達(dá)90%[3]。此外，相關(guān)研究表明該方可通過調(diào)節(jié)去卵巢大鼠子宮雌激素受體、骨密度、骨生物力學(xué)及骨代謝無機(jī)元素等發(fā)揮改善骨質(zhì)疏松作用[4-5]。盡管對(duì)二味杜仲湯治療絕經(jīng)性骨質(zhì)疏松療效及機(jī)制研究有不少報(bào)道，但該方對(duì)Ⅱ型老年性骨質(zhì)疏松癥的治療效果鮮有研究。

本實(shí)驗(yàn)通過D-半乳糖誘導(dǎo)大鼠以模擬老年性骨質(zhì)疏松模型，給予不同劑量的二味杜仲湯驗(yàn)證該方對(duì)Ⅱ型老年性骨質(zhì)疏松的療效，為進(jìn)一步提高和拓展其臨床應(yīng)用價(jià)值及深層次開發(fā)利用提供研究基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 藍(lán)刺頭于2019年8月采自內(nèi)蒙古呼和浩特市武川縣，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院薛培鳳教授鑒定為菊科植物驢欺口EchinopslatifoliusTausch的干燥花序；杜仲購(gòu)自安徽亳州市大禹藥業(yè)有限公司，經(jīng)內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院薛培鳳教授鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，均為2015年版《中國(guó)藥典》一部收載的正品。骨疏康顆粒(批號(hào)180108073)購(gòu)自遼寧康辰藥業(yè)有限公司。D-半乳糖(批號(hào)CG29133740)購(gòu)自北京酷來搏科技有限公司；水合氯醛(批號(hào)RH122661)購(gòu)自南京羅恩試劑有限公司；骨鈣素(OCN)(批號(hào)20200119)、堿性磷酸酶(ALP)(批號(hào)2019005)、無機(jī)磷(P)(批號(hào)20200115)試劑盒均購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.2 儀器 SkyScan1176型高分辨率X射線斷層掃描儀(德國(guó)布魯克公司)；N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海愛朗儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(北京普朗新技術(shù)有限公司)；移液槍(德國(guó)Eppendorf公司)；離心機(jī)(德國(guó)Christ公司)；BCD-290W型電冰箱(青島海爾股份有限公司)。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)Wistar雄性大鼠，12周齡，體質(zhì)量250～270 g，購(gòu)自內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(蒙)2015-0001。

2 方法

2.1 藥液制備 根據(jù)本課題組前期實(shí)驗(yàn)確定的二味杜仲湯最佳提取工藝進(jìn)行藥液制備。取藍(lán)刺頭、杜仲各250 g，加10倍量蒸餾水加熱回流提取2次，每次30 min，合并濾液，減壓濃縮，冷凍干燥，粉末放入4 ℃冰箱中保存，使用時(shí)加適量蒸餾水溶解，即得，平均得粉率為25%。

2.2 分組與造模 大鼠自由進(jìn)食飲水，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為空白組、模型組、骨疏康組(陽性對(duì)照)及二味杜仲湯高、中、低劑量組，每組6只，空白組腹腔注射5 mL/kg生理鹽水，其余各組每天腹腔注射120 mg/kgD-半乳糖，持續(xù)8周。

2.3 給藥 各給藥組大鼠均灌胃給藥，低劑量組給予237.5 mg/kg二味杜仲湯凍干粉(相當(dāng)于生藥量0.95 g/kg，為臨床等效劑量)，中劑量組給予475 mg/kg二味杜仲湯凍干粉(相當(dāng)于生藥量1.9 g/kg，為臨床等效劑量的2倍)，高劑量組給予950 mg/kg二味杜仲湯凍干粉(相當(dāng)于生藥量3.8 g/kg，為臨床等效劑量的4倍)，骨疏康組給予骨疏康顆粒(105.1 mg/kg)，空白組、模型組給予相同體積的生理鹽水，每天1次，持續(xù)8周。灌胃期間，大鼠每周稱定體質(zhì)量1次，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。

2.4 標(biāo)本采集 大鼠末次給藥后禁食12 h，10%水合氯醛麻醉，心臟取血，靜置后4 ℃、3 500 r/min離心15 min，取上清液，分裝后-80 ℃冰箱冷凍保存，用于血清骨代謝指標(biāo)的檢測(cè)。大鼠取血后處死，取左側(cè)脛骨，剔除肌肉，浸泡在裝滿福爾馬林的尿杯中，密封標(biāo)記，室溫下避光保存，用于骨微結(jié)構(gòu)的檢測(cè)。

2.5 指標(biāo)檢測(cè)

2.5.1 大鼠血清骨代謝指標(biāo) 酶聯(lián)免疫法(ELISA)法檢測(cè)大鼠血清OCN、P水平和ALP活性，嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2.5.2 大鼠脛骨骨微結(jié)構(gòu) 采用高分辨率X射線斷層掃描儀對(duì)大鼠左側(cè)脛骨進(jìn)行三維重建成像并對(duì)骨參數(shù)進(jìn)行定量分析，積分時(shí)間250 ms，在360°旋轉(zhuǎn)過程中進(jìn)行500次投影。骨小梁體積分?jǐn)?shù)(骨體積/總體積)、骨小梁厚度生成三維重建，平滑度設(shè)置為3；環(huán)偽影減少設(shè)置為5；束硬化校正設(shè)置為30%，在脛骨生長(zhǎng)板上為每個(gè)樣本設(shè)置相同的坐標(biāo)來測(cè)定骨密度。

3 結(jié)果

3.1 二味杜仲湯對(duì)大鼠血清骨代謝指標(biāo)的影響 如表1所示，與空白組比較，模型組大鼠血清P、OCN水平降低(P<0.05，P<0.01)，ALP活性升高(P<0.01)；與模型組比較，骨疏康組大鼠血清P、OCN水平升高(P<0.05)，ALP活性降低(P<0.01)，二味杜仲湯各劑量組血清P、OCN水平升高(P<0.01)，ALP活性降低(P<0.01)。二味杜仲湯各劑量組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，骨疏康組與二味杜仲湯各劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 各組大鼠血清骨代謝指標(biāo)

3.2 二味杜仲湯對(duì)大鼠骨微結(jié)構(gòu)的影響 如表2所示，與空白組比較，模型組大鼠骨小梁體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨密度均降低(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，骨疏康組大鼠骨小梁體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨密度均升高(P<0.01)，二味杜仲湯各劑量組大鼠骨密度、骨小梁厚度升高(P<0.05，P<0.01)，二味杜仲湯高劑量組骨小梁體積分?jǐn)?shù)升高(P<0.05)。二味杜仲湯各劑量組之間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，骨疏康組與二味杜仲湯各劑量組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠骨微結(jié)構(gòu)

如圖1所示，空白組大鼠脛骨內(nèi)的骨小梁數(shù)目正常，排列緊密、整齊，骨結(jié)構(gòu)比較完整；模型組大鼠骨小梁數(shù)量減少，骨小梁間隙大，形成了因斷裂導(dǎo)致的明顯空洞；骨疏康組大鼠骨構(gòu)造得到了明顯的改善，呈現(xiàn)出骨小梁結(jié)構(gòu)密實(shí)、分布均勻的特點(diǎn)；二味杜仲湯的各劑量組大鼠骨結(jié)構(gòu)同樣得到了較好的修復(fù)，骨小梁連接性較完整，無骨連接的空洞得到了顯著的改善，并隨著劑量增加更明顯。

圖1 各組大鼠骨微觀結(jié)構(gòu)的X-CT影像(×5.5)

4 討論

骨質(zhì)疏松癥嚴(yán)重影響人們的身體健康和生活質(zhì)量[6]。唑來膦酸鈉、阿侖膦酸鈉等藥物雖能在短時(shí)間內(nèi)改善老年性骨質(zhì)疏松癥患者臨床癥狀，但這些藥物易打破患者骨重塑過程的動(dòng)態(tài)平衡，且具有一定不良反應(yīng)，因此尋找安全可靠的抗老年性骨質(zhì)疏松藥物意義重大。

動(dòng)物衰老模型包括D-半乳糖致亞急性衰老模型[7]、β-淀粉樣蛋白(β-AP)致衰老模型[8]、去胸腺致衰老模型[9]、快速老化模型[10]、自然衰老模型[11]等。近年來有關(guān)D-半乳糖所致衰老大鼠模型的研究趨于完善，該模型操作簡(jiǎn)單、成本低、模型成功率高，且可誘導(dǎo)多個(gè)組織出現(xiàn)退行性改變，如自然衰老情況下的骨丟失[12]，故本研究選用D-半乳糖誘導(dǎo)的老年性骨質(zhì)疏松模型。在破骨細(xì)胞骨吸收和成骨細(xì)胞骨形成的耦聯(lián)過程中，分泌和釋放的各種代謝產(chǎn)物分別成為骨吸收指標(biāo)和骨形成指標(biāo)，也通稱為骨代謝指標(biāo)[13]。ALP是參與骨代謝的重要蛋白質(zhì)，是臨床上常見的評(píng)價(jià)骨形成和骨轉(zhuǎn)換的指標(biāo)之一[14]，本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠ALP活性較空白組升高，可能與骨代謝程度加深有關(guān)；經(jīng)過二味杜仲湯治療后，大鼠血清ALP活性降低(P<0.05)，提示該方有改善骨代謝作用。OCN主要是由成骨細(xì)胞特異合成和分泌的一種非膠原蛋白，是構(gòu)成骨基質(zhì)的成分之一，既往研究表明OCN可維持骨正常礦化速率，與骨形成關(guān)系密切[15]，本研究結(jié)果顯示，模型組OCN水平低于空白組，提示模型組骨形成減少；二味杜仲湯對(duì)OCN水平有上調(diào)作用，說明該方可通過OCN影響骨形成。P可以維持骨機(jī)械強(qiáng)度，此外，無機(jī)磷可以維持骨骼細(xì)胞內(nèi)磷的穩(wěn)定[16]。血清P與骨骼中P保持動(dòng)態(tài)平衡，模型組大鼠血清P水平較低；經(jīng)二味杜仲湯治療后，血清P水平升高，提示該方劑可以通過提高血清P水平，進(jìn)而增加骨骼機(jī)械強(qiáng)度。骨組織形態(tài)計(jì)量學(xué)是對(duì)骨組織形態(tài)結(jié)構(gòu)行定量分析的最佳方式，骨密度是診斷骨質(zhì)疏松的“金標(biāo)準(zhǔn)”。但骨微結(jié)構(gòu)的信息不僅與骨密度有關(guān)，還取決于骨小梁的微結(jié)構(gòu)[17]，本實(shí)驗(yàn)選定了骨小梁厚度和骨小梁體積分?jǐn)?shù)作為評(píng)價(jià)骨小梁微結(jié)構(gòu)的指標(biāo)。本研究結(jié)果表明，各劑量二味杜仲湯均可使D-半乳糖大鼠脛骨骨體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨密度增加。骨小梁體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度和骨密度與骨質(zhì)疏松狀況成反比，即值越低，骨質(zhì)疏松程度越深[18]，與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果一致。

綜上所述，二味杜仲湯能夠上調(diào)血清P、OCN水平，下調(diào)ALP活性，同時(shí)可以通過上調(diào)骨小梁體積分?jǐn)?shù)、骨小梁厚度、骨密度來改善D-半乳糖誘導(dǎo)的老年性骨質(zhì)疏松，提示該方在老年性骨質(zhì)疏松治療中具有一定效果。