清熱潤(rùn)燥口服液對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥及氣道黏液高分泌的影響

胡旭紅， 伍林澤， 魏義杰， 傅榕冰， 黃 豐， 童曉云， 趙 茜， 李嘉瑩，虎春艷， 吳向農(nóng)， 聶 堅(jiān)， 魏丹霞*

(1.云南中醫(yī)藥大學(xué)，云南 昆明 650500；2.騰沖市中醫(yī)醫(yī)院，云南 騰沖 679100；3.云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，云南 昆明 650021；4.云南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，云南 昆明 650500)

支氣管哮喘(簡(jiǎn)稱哮喘)是一種常見多發(fā)病，已成為全球性的社會(huì)衛(wèi)生問題。哮喘癥狀包括氣喘、呼吸困難、胸悶和咳嗽，都是由于氣流受阻引發(fā)的炎癥及氣道平滑肌收縮和粘液纖毛清除受損所共同引起的[1]，因此，病理黏液的形成是哮喘發(fā)病率和死亡率的一個(gè)重要因素[2]，氣道黏液的主體成分是黏蛋白，是由氣道上皮杯狀細(xì)胞和黏膜下層黏液細(xì)胞分泌的糖蛋白，通過肺活檢及誘導(dǎo)痰檢測(cè)證實(shí)了哮喘患者氣道中增多的主要黏蛋白為MUC5AC[3]。在正常生理情況下，黏蛋白參與了呼吸道黏液的組成，可以保護(hù)和潤(rùn)滑氣道上皮，而在病理情況下，一些炎癥介質(zhì)參與了氣道重塑的發(fā)展，包括Th2型細(xì)胞因子。Th17細(xì)胞是近年來新發(fā)現(xiàn)的CD4+T細(xì)胞的一個(gè)亞型，可以通過分泌IL-17發(fā)揮強(qiáng)大的促炎作用誘發(fā)炎性介質(zhì)的釋放，引起組織損傷等一系列炎癥反應(yīng)，其次，CD4+CD25+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)也參與了哮喘的發(fā)生過程，它能避免免疫反應(yīng)過度，減輕對(duì)機(jī)體的損傷[4]。

清熱潤(rùn)燥口服液為云南省名老中醫(yī)陸家龍30年的經(jīng)驗(yàn)方基礎(chǔ)上經(jīng)現(xiàn)代工藝加工而成，由桑葉、杏仁、沙參、麥冬等13味中藥組成，全方取《溫病條辨》“桑杏湯”“沙參麥冬湯”之辛涼甘潤(rùn)以生津液、養(yǎng)肺胃達(dá)“潤(rùn)養(yǎng)”之力，取《備急千金要方》“葦莖湯”以清肺脾郁熱使燥化之痰熱從肺、腸“通利”而出，養(yǎng)潤(rùn)與通利并行，共奏清熱養(yǎng)陰，潤(rùn)燥止咳，運(yùn)脾化痰利濁之效。在前期昆明市科技計(jì)劃項(xiàng)目中(2013-04-02-A-S-02-2142)，經(jīng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有祛痰、止咳、平喘、免疫及抗炎作用[5-7]。因此，推測(cè)清熱潤(rùn)燥口服液可能通過降低Th2型細(xì)胞因子的水平以抑制MUC5AC的生成，以及維持Treg/Th17細(xì)胞之間的平衡，抑制趨化因子和炎癥因子的水平從而在卵清蛋白(OVA)致敏的哮喘小鼠模型中發(fā)揮改善氣道慢性炎癥的作用。

1 材料

1.1 動(dòng)物 40只清潔級(jí)BALB/c小鼠，雌性，6～8周齡，體質(zhì)量(20±2)g，購(gòu)自遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK(遼)2015-0001。

1.2 試劑與儀器 地塞米松(批號(hào)BCBV3214)、Ⅴ級(jí)卵清蛋白(批號(hào)9006-59-1)均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；納米級(jí)氫氧化鋁粉末(上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號(hào)38701)；MCP-1(批號(hào)A28781123)、IL-17A(批號(hào)A21780741)、IL-10(批號(hào)A21080946)、IL-9(批號(hào)A20980513)、IL-13(批號(hào)A21381132)、IgE(批號(hào)A27581115) ELISA試劑盒均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；IL-8 ELISA試劑盒(深圳欣博盛生物科技有限公司，批號(hào)M181106-104a)；OVA-IgE ELISA試劑盒(美國(guó)Cayman公司，批號(hào)500840)；MUC5AC ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司，批號(hào)ZKVBMELGV3)。超聲霧化儀(德國(guó)百瑞公司，型號(hào)INQUA NEB plus)；多功能酶標(biāo)儀(倍捷科技有限公司，型號(hào)AR224CN)；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(湖南赫西儀器裝備有限公司，型號(hào)HR/T16 M)；脫水機(jī)(型號(hào)JJ-12J)、包埋機(jī)(型號(hào)JB-P5)均購(gòu)自武漢俊杰電子有限公司；病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)RM2016)；成像系統(tǒng)(日本尼康公司，型號(hào)NIKON DS-U3)。

2 方法

2.1 分組 將40只小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、地塞米松組(1 mg/kg)、清熱潤(rùn)燥口服液低劑量組(4.32 g/kg)、清熱潤(rùn)燥口服液高劑量組(8.64 g/kg)，每組8只，分籠飼養(yǎng)，均在相同環(huán)境(12 h/12 h明暗交替，相對(duì)濕度20%～30%及自由飲食飲水)下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2.2 藥液制備 組方藥材桑葉200 g、蘆根300 g、苦杏仁120 g、南沙參240 g、麥冬200 g、浙貝母200 g、薏苡仁300 g、冬瓜仁300 g、陳皮60 g、茯苓200 g、京半夏200 g、炒谷芽300 g、炒麥芽300 g，均購(gòu)自云南中醫(yī)藥大學(xué)校醫(yī)院，并委托制劑室制成生藥量3.94 g/mL的原液，保存于4～8 ℃冰箱中備用，使用前用超純水配制為不同劑量藥液。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果[5-7]，將高、低劑量分別設(shè)定為8.64、4.32 g/kg，方中原藥材選擇均按2020年版《中國(guó)藥典》相關(guān)規(guī)定加工炮制成合格飲片，對(duì)主要有效成分進(jìn)行質(zhì)量控制，采用薄層監(jiān)控各中藥的TLC斑點(diǎn)，HPLC法測(cè)定主要成分含量[8-11]。

2.3 建模及給藥 按照文獻(xiàn)[12]方法并進(jìn)行了改進(jìn)，于實(shí)驗(yàn)第1、8、15天，正常組小鼠腹腔注射生理鹽水(10 mL/kg)，其余各組腹腔注射OVA混懸液(1 mg/mL OVA+5 mg/mL氫氧化鋁)致敏，劑量均為0.25 mL。于實(shí)驗(yàn)第21～27天，稱取并記錄各組小鼠體質(zhì)量，在霧化激發(fā)前1 h，正常組、模型組給予生理鹽水(10 mL/kg)灌胃，其余各組分別給予對(duì)應(yīng)藥物；除正常組用生理鹽水外，其他各組均用2% OVA霧化激發(fā)，每天1次，每次30 min，持續(xù)1周。

2.4 體征及行為學(xué)變化觀察 當(dāng)小鼠體質(zhì)量減輕，出現(xiàn)煩躁不安、持續(xù)撓腮抓耳、全身節(jié)律性收腹樣喘促時(shí)，表示支氣管哮喘模型建立成功。

2.5 引喘潛伏期記錄 在霧化激發(fā)后3 d，每天從霧化開始計(jì)時(shí)，發(fā)現(xiàn)小鼠躁動(dòng)不安、抓耳撓腮、呼吸急促、在通風(fēng)小孔處堆積的情況，此時(shí)即為引喘潛伏期。觀察時(shí)間為前8 min，以秒為單位計(jì)算，并以3 d記錄時(shí)間的平均值為結(jié)果。

2.6 血清收集 于實(shí)驗(yàn)第28天，每只小鼠摘眼球取血，血液室溫靜置1 h后，4 ℃、3 000 r/min離心15 min，上清液分裝并保存在-80 ℃低溫冰箱中。

2.7 肺泡灌洗液采集 將取血后的小鼠用乙醇擦拭腹部，打開胸腔，將右支氣管夾閉，于主支氣管上開一V型口，將帶有毛細(xì)管的注射器插入左支氣管后結(jié)扎以防止脫離，注入0.3 mL PBS緩沖液，緩慢平穩(wěn)抽吸3次，反復(fù)進(jìn)行2次灌洗，以總回收率70%以上為合格。肺泡灌洗液4 ℃、2 000 r/min離心5 min，上清液分裝后，保存在-80 ℃冰箱中。

平面幾何負(fù)擔(dān)著培養(yǎng)和發(fā)展學(xué)生空間想象能力的基本任務(wù)，以平面幾何為契機(jī)，逐步深入學(xué)習(xí)研究解析幾何、代數(shù)、三角數(shù)形結(jié)合（例如：數(shù)軸、坐標(biāo)、函數(shù)圖象等），立體幾何等，無論哪一部分?jǐn)?shù)學(xué)知識(shí)都必須由教師有效控制課堂活動(dòng)。新課程需要新方法，采用先學(xué)后教，讓學(xué)生“從書中學(xué)”、“從做中學(xué)”，教師重視講授學(xué)生學(xué)不會(huì)的，又重視練習(xí)、既重基礎(chǔ)又重能力、有明確的知識(shí)技能掌握和練習(xí)目標(biāo)的開放的教學(xué)方法。

2.8 小鼠血清及BALF中細(xì)胞因子水平檢測(cè) 采用ELISA法檢測(cè)BALF中IL-13、IL-9、MUC5AC、IL-17A、IL-10、IL-8、MCP-1水平，以及血清中IgE、OVA-IgE水平，嚴(yán)格按照ELISA檢測(cè)試劑盒說明書中的操作步驟進(jìn)行。

2.9 小鼠BALF中白細(xì)胞數(shù)目檢測(cè) 取10 μL BALF下層細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板在倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞懸液中細(xì)胞總數(shù)。取20 μL細(xì)胞懸液，于玻片上制成細(xì)胞涂片，按照快速瑞氏-吉姆薩染色說明書的操作進(jìn)行白細(xì)胞、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量的計(jì)算，所得比例乘以細(xì)胞總數(shù)即為各類細(xì)胞的數(shù)目。

2.10 小鼠肺組織黏蛋白分泌檢測(cè) 取小鼠右肺中葉組織，生理鹽水清洗后用濾紙吸干(注意不能破壞組織)，置于4%組織固定液中固定24 h，石蠟包埋，PAS染色，觀察小鼠氣管周圍黏液分泌情況。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠引喘潛伏期的比較 與正常組比較，模型組小鼠引喘潛伏期縮短(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組和清熱潤(rùn)燥口服液各劑量組小鼠引喘潛伏期均延長(zhǎng)(P<0.01)，見表1。

表1 各組小鼠引喘潛伏期比較

3.2 小鼠BALF中各類細(xì)胞數(shù)目比較 與正常組比較，模型組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和嗜酸性粒細(xì)胞增加(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組和清熱潤(rùn)燥各劑量組小鼠BALF中各類細(xì)胞數(shù)均減少(P<0.05，P<0.01)，見表2。

表2 各組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)及各類細(xì)胞總數(shù)比較

3.3 小鼠血清中總IgE、OVA-IgE水平 如圖1所示，與正常組比較，模型組小鼠血清中總IgE、OVA-IgE水平升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組和清熱潤(rùn)燥口服液各劑量組小鼠血清中總IgE、OVA-IgE水平均降低(P<0.01)。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖1 清熱潤(rùn)燥口服液對(duì)小鼠血清中總IgE、OVA-IgE水平的影響

圖2 清熱潤(rùn)燥口服液對(duì)小鼠肺組織黏液分泌的影響(PAS染色，×200)

3.5 小鼠BALF中IL-9、IL-13、MUC5AC水平 如圖3所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中IL-9、IL-13、MUC5AC水平升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組及清熱潤(rùn)燥口服液各劑量組小鼠BALF中IL-9、IL-13、MUC5AC水平均降低(P<0.01)。

3.6 小鼠BALF中IL-17A、IL-10水平 如圖4所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中IL-17A水平升高(P<0.01)，IL-10水平降低(P<0.05)；與模型組比較，地塞米松組及清熱潤(rùn)燥口服液各劑量組小鼠BALF中IL-17A水平降低(P<0.05，P<0.01)，IL-10水平升高(P<0.05，P<0.01)。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖3 清熱潤(rùn)燥口服液對(duì)小鼠BALF中IL-9、IL-13、MUC5AC水平的影響

注：與正常組比較，#P<0.05，##P<0.01；與模型組比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 清熱潤(rùn)燥口服液對(duì)小鼠BALF中IL-17A、IL-10水平的影響

3.7 小鼠BALF中IL-8、MCP-1水平 如圖5所示，與正常組比較，模型組小鼠BALF中IL-8、MCP-1水平升高(P<0.01)；與模型組比較，地塞米松組及清熱潤(rùn)燥口服液各劑量組小鼠BALF中IL-8、MCP-1水平降低(P<0.01)。

注：與正常組比較，##P<0.01；與模型組比較，**P<0.01。圖5 清熱潤(rùn)燥口服液對(duì)小鼠BALF中IL-8、MCP-1水平的影響

4 討論

氣道黏液主體成分黏蛋白由氣道上皮杯狀細(xì)胞分泌，目前已有21種黏蛋白在人類基因組中被發(fā)現(xiàn)。在正常人的氣道內(nèi)，MUC5B是分泌型黏蛋白的主要成分，MUC5AC水平較少，病理情況下則以MUC5AC為主[13]。因此，抑制MUC5AC的高分泌，可以有效地改善哮喘患者癥狀，并減少病死率。本研究提示清熱潤(rùn)燥口服液可以降低血清MUC5AC水平。

IL-9是一種由CD4+細(xì)胞亞群(稱為Th9細(xì)胞)釋放的多效性Th2細(xì)胞因子，在小鼠模型中，IL-9刺激粘蛋白轉(zhuǎn)錄和杯狀細(xì)胞增生，它還誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-13[14-15]，說明IL-13在促進(jìn)氣道杯狀細(xì)胞增生過程中起到關(guān)鍵作用，是促進(jìn)氣道炎癥和黏液分泌的重要細(xì)胞因子。本研究結(jié)果顯示，哮喘小鼠在接受清熱潤(rùn)燥口服液干預(yù)后，IL-9和IL-13水平降低，氣道內(nèi)的黏液高分泌減少，提示清熱潤(rùn)燥口服液可能通過抑制IL-9、IL-13的生成和相互作用，從而抑制了大量的杯狀細(xì)胞增生和氣道黏液的高分泌，以此減輕哮喘癥狀。

目前，隨著研究的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)，過敏性疾病與免疫球蛋白E(IgE)水平密切相關(guān)，IgE也是氣道過敏反應(yīng)的核心，而減少氣道過敏反應(yīng)是控制過敏性哮喘的關(guān)鍵[16-17]。研究顯示，IgE抗體與肥大細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞表面的IgE高親和力受體FcεRⅠ結(jié)合形成FcεRⅠ-IgE復(fù)合物，而低親和力受體FcεRⅡ與IgE特異性結(jié)合形成FcεRⅡ-IgE復(fù)合物，當(dāng)過敏原首次進(jìn)入機(jī)體時(shí)，漿細(xì)胞受到刺激分泌大量IgE，這些IgE分子將自身的Fc端附著于嗜堿性粒細(xì)胞或肥大細(xì)胞表面，隨即發(fā)生致敏反應(yīng)[18]。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見，清熱潤(rùn)燥口服液可能通過抑制小鼠體內(nèi)總IgE、OVA-IgE的表達(dá)起到抑制哮喘小鼠氣道炎癥的作用。

在過去的哮喘研究中認(rèn)為Th1/Th2細(xì)胞失衡在哮喘發(fā)病機(jī)制中一直具有主導(dǎo)作用，但目前有部分文獻(xiàn)報(bào)道表明Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞平衡可能是哮喘發(fā)病機(jī)制中的重要原因，其分泌的細(xì)胞因子IL-17A、IL-10在哮喘中占有重要作用[19]。Th17細(xì)胞分泌的主要效應(yīng)細(xì)胞因子IL-17A，它是T細(xì)胞誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)的早期啟動(dòng)因素，是一種強(qiáng)大的促炎細(xì)胞因子[20]。Treg細(xì)胞為一類調(diào)控機(jī)體免疫功能的細(xì)胞群，其作用機(jī)制主要通過分泌細(xì)胞因子IL-10直接介導(dǎo)免疫抑制，IL-10具有抗炎作用，既可抑制促炎細(xì)胞因子的合成，亦可抑制嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞及肥大細(xì)胞的致炎效應(yīng)[21]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在哮喘發(fā)生的過程中，與正常組比較，模型組IL-17 A水平升高，與之相反的是IL-10水平呈降低趨勢(shì)，而藥物組IL-17A水平降低、而IL-10水平升高，提示清熱潤(rùn)燥口服液可能通過抑制Th17細(xì)胞釋放IL-17A并促進(jìn)Treg細(xì)胞釋放IL-10來發(fā)揮抗炎作用。

趨化因子家族分為兩個(gè)亞家族，CXC家族和CC家族，其中，IL-8屬于CXC家族，單核細(xì)胞趨化蛋白(monocyte chemotactic protein-l，MCP-1)屬于CC趨化因子，IL-8可誘導(dǎo)中性粒細(xì)胞遷移至炎癥部位[22]。而MCP-1則主要誘導(dǎo)單核細(xì)胞、T細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞并誘導(dǎo)組胺釋放。本研究結(jié)果顯示，清熱潤(rùn)燥口服液能降低BALF中白細(xì)胞總數(shù)、單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞數(shù)量，且BALF中IL-8、MCP-1水平也均降低，由此可以看出，清熱潤(rùn)燥口服液可能通過對(duì)單核巨噬細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞趨化因子的不同程度抑制從而降低單核細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞在炎癥部位的聚集，減輕氣道高反應(yīng)性，改善哮喘癥狀，縮短哮喘小鼠的引喘潛伏期。

綜上所述，清熱潤(rùn)燥口服液可能通過調(diào)控Th17/treg平衡，干預(yù)趨化因子的釋放、炎性細(xì)胞的聚集以及氣道黏液的高分泌來發(fā)揮治療哮喘作用。