喘貼靈巴布劑處方工藝優(yōu)化及其體外透皮特性

李姿銳， 鄒蘇蘭， 陸慧玲， 李 雅

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

支氣管哮喘是常見的炎癥性氣道疾病，感染了世界上超過10%的人口[1-2]。雖然西醫(yī)能有效控制癥狀，但其不良反應(yīng)大，用藥療程長，患者順應(yīng)性差，停藥后易反復(fù)發(fā)作，導(dǎo)致療效不理想[3-4]。

喘貼靈由芥子、麻黃、細(xì)辛等8味藥材組成，具有益氣活血、補(bǔ)肺固腎作用，臨床上將其穴位貼敷來治療支氣管哮喘，作用顯著，可明顯降低氣道反應(yīng)性，抑制炎癥介質(zhì)釋放，延長哮喘潛伏期，從而改善哮喘氣道變應(yīng)性炎癥[5-6]。巴布劑是一種新型透皮給藥制劑，主要由水溶性高分子骨架材料、交聯(lián)劑、保濕劑、填充劑、提取物等組成，具有避免肝臟首過效應(yīng)、載藥量大、與皮膚生物相容性好、透氣、可反復(fù)貼敷，生物利用度高、藥物透皮吸收效率高、減少胃腸刺激等優(yōu)點，近年來受到大量科研工作者的重視，也成為國內(nèi)外醫(yī)藥行業(yè)開發(fā)的熱點[7-8]。本實驗將喘貼靈制成巴布劑，并考察其體外透皮特性，以期為該制劑進(jìn)一步開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent Technologies 1200 Series高效液相色譜儀，配置Agilent ChemStation色譜工作站(美國Agilent公司)；CZY-GY初黏力測定儀(濟(jì)南蘭光機(jī)電技術(shù)有限公司)；CP114電子天平[奧豪斯儀器(上海)有限公司]；DK-98-ⅡA電熱恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司)；TP-6智能透皮擴(kuò)散儀(天津精拓儀器科技有限公司)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(鞏義市中天儀器科技有限公司)；DZTW型調(diào)溫電熱套(北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 NP-700(昭和電工株式會社，批號931170A)；甘氨酸鋁(上海麥克林生化科技有限公司)；聚乙烯吡咯烷酮K90(PVP K90)；氮酮(天津市瑞金物化學(xué)品有限公司，批號20190620)；甘油(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號20191014)；乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)(湖南匯虹試劑有限公司，批號10180131)。細(xì)辛(批號20110412)、麻黃(批號20120806)、芥子(批號19070809)、丁香(批號20071605)、肉桂(批號20112103)、醋延胡索(批號20122306)、醋甘遂(批號19090404)均購自湖南振興中藥有限公司，經(jīng)專家鑒定為正品。芥子硫氰酸鹽(純度98.3%，批號111702-202102)、鹽酸麻黃堿(純度100%，批號171241-20201)對照品(中國食品藥品檢定研究院)。所用試劑均為色譜純；蒸餾水由湖南中醫(yī)藥大學(xué)模擬藥廠提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 浸膏制備 稱取芥子30 g、麻黃20 g、細(xì)辛6 g、丁香20 g、肉桂20 g、延胡索20 g、甘遂20 g、生姜汁20 g，8倍量蒸餾水提取2次，提取時間分別為1.5、1 h，濾過，合并濾液，減壓濃縮，即得。

2.2 巴布劑制備 稱取處方量PVP K90，加入純化水，水浴溶解10 min，作為A相；另取處方量的NP-700、甘氨酸鋁混勻，再加入甘油和促滲劑，在60 ℃下攪拌6 min，作為B相；取處方量浸膏、EDTA、高嶺土，溶于20 g水中，作為C相，將A相緩慢加到B相中，攪拌均勻，再加入C相，繼續(xù)攪拌均勻，立即涂布于無紡布上，放置1 d，即得。

2.3 巴布劑質(zhì)量評價

2.3.1 感官評分 參考文獻(xiàn)[9]報道，以外觀性狀、涂展性、膜殘留量、皮膚追隨性、反復(fù)粘貼性為主觀考察指標(biāo)，總分40分，具體見表1。

表1 感官評分標(biāo)準(zhǔn)

2.3.2 初黏力 采用滾球斜坡停止法，板上有2條相隔10 mm的水平線，上線為鋼球起始位置的標(biāo)記，下線為供試品固定的標(biāo)記。取巴布劑(10 cm×4 cm)，揭去防黏層，將上端固定在下線位置，黏性面向上，調(diào)節(jié)底座使鋼板表面與水平面成30°傾斜，從大到小的順序取鋼球從水平線的上線自由滾落，記錄巴布劑能黏住的最大鋼球號，滿分20分，其余與其相比依次評分。

2.3.3 持黏力 將巴布劑黏性面粘貼于試驗板表面，垂直放置，沿長度方向懸掛1個規(guī)定質(zhì)量的砝碼，記錄滑移直至脫落的時間，重復(fù)3次，取平均值，滿分20分，其余與其相比依次評分。

2.3.4 剝離強(qiáng)度 取巴布劑(10 cm×4 cm)，揭去防黏層，粘貼于實驗板表面，垂直放置，上端懸掛200 g砝碼，記錄脫落所需時間，重復(fù)3次，取平均值，滿分20分，其余與其相比依次評分。

2.3.5 綜合評分 根據(jù)2020版《中國藥典》結(jié)合文獻(xiàn)[10-11]報道，設(shè)定感官評分、初黏力、持黏力、剝離強(qiáng)度權(quán)重系數(shù)分別為0.4、0.2、0.2、0.2，計算綜合評分，公式為綜合評分=0.4*感官評分+0.2*初黏力+0.2*持黏力+0.2*剝離強(qiáng)度。

2.4 Plackett-Burman設(shè)計 在前期實驗及預(yù)試驗基礎(chǔ)上，選擇NP-700(A)、PVP K90(B)、甘氨酸鋁(C)、EDTA(D)、甘油(E)、高嶺土(F)用量作為影響因素，每個因素取1、-1水平，具體見表2，結(jié)果見表3。

表2 Plackett-Burman設(shè)計因素水平

表3 Plackett-Burman設(shè)計結(jié)果

通過Minitab軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得方程為Y=36.6-4.15A+14.36B-41.1C+3.6D+1.066E+12.42F，結(jié)果見表4。由此可知，模型P<0.05，表明它具有顯著性；相關(guān)系數(shù)R2為0.867 9，表明模型可較好地描述結(jié)果；各因素影響程度依次為E>A>F>B>C>D。

表4 Plackett-Burman方差分析

2.5 Box-Behnken響應(yīng)面法 在Plackett-Burman設(shè)計基礎(chǔ)上，確定甘油(A)、NP-700(B)、高嶺土(C)用量作為影響因素，外觀性狀(D)、初黏力(E)、持黏力(F)、剝離強(qiáng)度(G)的綜合評分作為評價指標(biāo)，因素水平見表5，結(jié)果見表6。

表5 Box-Behnken響應(yīng)面法因素水平

表6 Box-Behnken響應(yīng)面法設(shè)計與結(jié)果

圖1 各因素響應(yīng)面圖

表7 Box-Behnken響應(yīng)面法方差分析

2.6 設(shè)計空間建立 根據(jù)Design-Expert 10.0軟件所得數(shù)學(xué)模型，采用MODDE 12.1軟件開發(fā)設(shè)計空間。由于巴布劑綜合評分大于80分，故故設(shè)置其優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)為80，最大限度為100。再通過Monte Carlo法獲取基于達(dá)標(biāo)概率的設(shè)計空間，首先進(jìn)行仿真模擬實驗，獲得實驗測定誤差來計算達(dá)標(biāo)概率，以綜合評分滿足優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)時為達(dá)標(biāo)，設(shè)置模擬次數(shù)為5 000次，結(jié)果見圖2。由此可知，設(shè)計空間為綠色區(qū)域，該區(qū)域時中甘油、高嶺土用量等條件的改變不會對巴布劑綜合評分造成影響，數(shù)字表示工藝參數(shù)落在該范圍內(nèi)綜合評分不能達(dá)到優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)的概率，其值越小，顏色由紅變綠，代表滿足優(yōu)化標(biāo)準(zhǔn)的可能性逐漸增加。最終確定，推薦的操作空間為甘油用量30～36 g，NP-700用量5～6 g，高嶺土用量0.6～0.833 g。

圖2 各因素設(shè)計空間

在設(shè)計空間范圍內(nèi)制備2份喘貼靈巴布劑(P1、P2)，測定各項指標(biāo)，平行3次，計算綜合評分，結(jié)果見表8。由此可知，該范圍內(nèi)所制備的巴布劑外觀光潔有彈性，初黏力、持黏力良好。

表8 驗證試驗結(jié)果(n=3)

再對巴布劑載藥性能進(jìn)行考察，結(jié)果見表9。由此可知，載藥量在10%～40%時性能較穩(wěn)定，但低于10%或超過40%時綜合評分明顯降低。在不影響性能的前提下，應(yīng)使巴布劑盡可能多地載藥以確保療效，故設(shè)定其最大載藥量為40%。

表9 巴布劑載藥性能考察結(jié)果

2.7 各成分含量測定

2.7.1 供試品溶液制備 精密稱取巴布劑1.0 g，置于錐形瓶中，精密加入10 mL甲醇，超聲處理30 min，甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，即得。

1. 鹽酸麻黃堿 2. 芥子堿硫氰酸鹽圖3 各成分HPLC色譜圖

2.7.2 對照品溶液制備 精密稱取鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽對照品適量，甲醇溶解，制成分別含兩者0.24、0.34 mg/mL的溶液，即得。

2.7.3 色譜條件 SinoChrom ODS-BP色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相乙腈-0.08 mol/L磷酸二氫鉀(0～40 min，10∶90)；體積流量1 mL/min；柱溫30 ℃；檢測波長210 nm。色譜圖見圖3。

2.7.4 線性關(guān)系考察 取“2.7.2”項下對照品溶液適量，甲醇稀釋(鹽酸麻黃堿質(zhì)量濃度分別為0.001 67、0.005、0.012 5、0.025、0.033 mg/mL，芥子堿硫氰酸鹽質(zhì)量濃度分別為0.013 3、0.016 7、0.025、0.033、0.05 mg/mL)，分別精密吸取10 μL，在“2.7.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定。以對照品峰面積(Y)對其質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，得方程分別為鹽酸麻黃堿Y=20 304X-21.03(r=0.999 2)，線性范圍1.67～33.0 mg/mL；芥子堿硫氰酸鹽Y=19 193X-250.24(r=0.999 5)，線性范圍13.3～50 mg/mL。

2.7.5 精密度試驗 精密吸取“2.7.2”項下對照品溶液(鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽質(zhì)量濃度分別為25.0、33.0 mg/mL)10 μL，在“2.7.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定6次，測得鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽峰面積RSD分別為 0.17%、0.43%，表明儀器精密度良好。

2.7.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取“2.7.1”項下供試品溶液，于0、0.5、1、1.5、3、6、12、24 h在“2.7.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽峰面積RSD分別為1.03%、0.59%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.7 重復(fù)性試驗 精密稱取巴布劑6份，按“2.7.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.7.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，測得鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽含量RSD分別為1.58%、0.93%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.8 加樣回收率試驗 精密吸取各成分含量已知的供試品溶液3 mL，共6份，分別精密加入80%、100%、120%水平對照品溶液，在“2.7.3”項色譜條件下進(jìn)樣測定，計算回收率。結(jié)果，鹽酸麻黃堿平均加樣回收率為100.22%，RSD為1.13%；芥子堿平均加樣回收率為99.78%，RSD為0.91%。

2.8 體外透皮實驗 預(yù)實驗選擇氮酮、尿素、冰片、油酸、薄荷油作為透皮促滲劑[12]進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)氮酮、薄荷油對巴布劑的促透效果更優(yōu)。本實驗采用Franz擴(kuò)散池法考察氮酮、薄荷油用量，HPLC法測定各時間點巴布劑君藥(芥子、麻黃)中抗哮喘成分(芥子堿硫氰酸鹽、鹽酸麻黃堿)的滲透量。

2.8.1 透皮促滲劑用量選擇 根據(jù)“2.6”項下優(yōu)化操作空間，分別加入1%、3%、5%氮酮、薄荷油制備巴布劑。

2.8.2 離體大鼠皮膚制備 脫毛膏去除大鼠腹部毛發(fā)，正常飼養(yǎng)1 d后取皮，去掉皮下脂肪，生理鹽水洗凈黏液組織，即得，置于-20 ℃冰箱中冷凍保存，實驗前自然解凍。

2.8.3 透皮實驗 將“2.8.2”項下皮膚在37 ℃生理鹽水中解凍，固定于Franz透皮擴(kuò)散池上(接收池體積為20 mL，接收面積為7.065 cm2)，表皮層朝上面向供給池，真皮層朝面向接收池，排凈氣泡，將含有不同用量透皮促滲劑的巴布劑緊貼于皮膚上，接收介質(zhì)為生理鹽水，恒溫(32 ℃)攪拌(300 r/min)，于 2、4、6、8、10、12、24 h取出接收介質(zhì)各0.8 mL，同時向接收池中補(bǔ)充等溫同體積生理鹽水，0.45 μm微孔濾膜過濾，采用HPLC法測定鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽含量，計算累積滲透量Qn，公式為Qn=(V總Cn+ΣCn-1V取)/A，其中V總為接收池體積(20 mL)，Cn為第n個取樣點鹽酸麻黃堿或芥子堿硫氰酸鹽含量，Cn-1為第n-1個取樣點鹽酸麻黃堿或芥子堿硫氰酸鹽含量，V取為取樣體積(0.8 mL)，A為滲透面積(7.065 cm2)，累積滲透量-時間曲線見圖4，再測定速率倍增系數(shù)(ER)、體外透皮速率(J)，結(jié)果見表10。

圖4 各成分累積滲透量-時間曲線

表10 不同透皮促滲劑對巴布劑累積滲透量的影響(n=3)

由此可知，當(dāng)不加入透皮促滲劑時，芥子堿硫氰酸鹽體外透皮速率高于鹽酸麻黃堿，而加入后2種成分體外透皮速率明顯升高；氮酮促滲作用與其用量不成正比關(guān)系，當(dāng)大于1%時2種成分促滲速率反而被抑制；薄荷油用量為3%時對鹽酸麻黃堿的促滲效果最強(qiáng)，但與1%氮酮相比無明顯差異，而且后者對芥子堿硫氰酸鹽有顯著促滲作用顯著。最終，選擇1%氮酮作為透皮促滲劑。

3 討論

3.1 基質(zhì)篩選 在基質(zhì)處方設(shè)計中，NP-700為骨架材料，甘氨酸鋁為交聯(lián)劑，兩者交聯(lián)形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，使巴布劑具有較高的彈性和黏性[13]，其中PVP K90為增黏劑，EDTA為螯合劑，甘油為保濕劑，高嶺土為無機(jī)填充劑，可調(diào)節(jié)其成型性、涂展性，增加膏體強(qiáng)度。同時，在制備C相的過程中利用高嶺土結(jié)構(gòu)疏松多孔，能吸附提取物中揮發(fā)油等油性物質(zhì)的特性，將其與喘貼靈浸膏混合均勻，可提高其療效[14]。

3.2 優(yōu)化設(shè)計方法篩選 QbD理念強(qiáng)調(diào)增加對生產(chǎn)過程可靠控制，建立全方位易于開展的控制平臺，有利于實際生產(chǎn)和操作[15-17]。本實驗將該理念應(yīng)用于喘貼靈巴布劑的工藝制備過程，結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)行優(yōu)化，構(gòu)建了關(guān)鍵質(zhì)量屬性、關(guān)鍵工藝參數(shù)的工藝設(shè)計空間。在相關(guān)生產(chǎn)過程中，可根據(jù)實際情況對工藝參數(shù)在操作空間內(nèi)進(jìn)行調(diào)整，從而保障喘貼靈巴布劑的質(zhì)量可控性。

3.3 體外透皮研究 喘貼靈中芥子、麻黃為君藥，故本實驗選擇兩者主要質(zhì)量控制指標(biāo)成分作為體外透皮試驗檢測指標(biāo)，其中鹽酸麻黃堿、芥子堿硫氰酸鹽治療哮喘療效顯著[18-21]。再考察了透皮促滲劑種類及用量，其中氮酮無味，無不良反應(yīng)、性質(zhì)穩(wěn)定，可廣泛用于促進(jìn)透皮給藥制劑的滲透中[22-24]，并且當(dāng)其用量大于1%時麻黃堿、芥子堿透皮速率顯著降低，表明促透作用并不隨者用量增加而提高。