廣藿香化學(xué)型分型及形成時期研究

歐曉華， 羅可可， 鄧文靜， 張眾生， 劉小華， 嚴寒靜*

[1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.島津企業(yè)管理(中國)有限公司，廣東 廣州 510670]

廣藿香Pogostemoncablin(Blanco)Benth.為唇形科植物，干燥地上部分入藥，為著名的“十大南藥”之一[1]，也是藿香正氣液、連花清瘟膠囊等中成藥的重要原料，功效芳香化濕、健運脾胃、辟穢解毒[2-3]。廣藿香主要分為醇型和酮型2種化學(xué)型，以百秋李醇、廣藿香酮的含量比值為劃分依據(jù)[4]。質(zhì)優(yōu)效佳的道地藥材石牌廣藿香與品質(zhì)相近的高要廣藿香的廣藿香酮含量遠高于百秋李醇，為酮型廣藿香，在胃腸道疾病等方面藥用效果較好；海南、湛江、陽春等產(chǎn)地的廣藿香大多用于提取揮發(fā)油，百秋李醇含量遠高于廣藿香酮，為醇型廣藿香，具有抗病毒、抗炎、抗幽門螺旋桿菌作用[5-7]。由于種質(zhì)退化、產(chǎn)量及經(jīng)濟效益降低，道地藥材牌香及質(zhì)量相近的高要廣藿香瀕臨滅絕，市面上大多為海南、陽春、湛江等產(chǎn)區(qū)藥材。為了研究2種化學(xué)型廣藿香組培苗生長過程中百秋李醇和廣藿香酮的動態(tài)變化規(guī)律，探究廣藿香化學(xué)型的成因，本實驗采用組培快繁技術(shù)，以海南、高要廣藿香為研究對象，分別培養(yǎng)獲得不同生長時期的醇型和酮型廣藿香組培苗，采用GC-MS法評價不同生長時期2種化學(xué)型廣藿香組培苗中化學(xué)成分差異。

1 材料

1.1 藥材 廣藿香葉片(產(chǎn)地海南省萬寧市、廣東省肇慶市高要區(qū)蓮塘鎮(zhèn))，經(jīng)廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院嚴寒靜教授鑒定為唇形科植物廣藿香Pogostemoncablin(Blanco) Benth.的葉片。

1.2 儀器 GC-MS QP-2020(日本島津公司)；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；KQ-250E數(shù)控超聲波清洗機(昆山市超聲儀器有限公司)；Sartorius BP211D電子分析天平(十萬分之一，德國賽多利斯公司)；電子分析天平[萬分之一，奧豪斯儀器(上海)有限公司]；HH-6恒溫水浴鍋(江蘇金壇市鴻科儀器廠)。

1.3 試劑 百秋李醇(批號B-037-180122，純度>98%)、廣藿香酮(批號G-055-180710，純度>98%)對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；十八烷(批號0110583，純度>98%)對照品購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；技術(shù)瓊脂粉(批號3207102)購自廣東環(huán)凱微生物生物科技有限公司。正己烷(色譜純)、二氯甲烷(分析純)均購自天津市致遠化學(xué)試劑有限公司。

1.4 培養(yǎng)基 叢生芽培養(yǎng)基，配方為MS+0.2 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA；生根培養(yǎng)基，配方為1/2MS，pH值均為5.8～6.0。

2 方法與結(jié)果

2.1 植物組織培養(yǎng) 將醇型、酮型廣藿香葉片用自來水沖洗1～2 min，75%酒精漂洗5 s，無菌水漂洗2次，0.1%升汞溶液消毒滅菌8 min，無菌水漂洗5次。葉片剪成5 mm×5 mm葉塊，接種到叢生芽培養(yǎng)基，從萌芽開始計算生長時間，在40 d時選取生長健壯、長勢一致(高1～2 cm)的不定芽，接種至1/2MS培養(yǎng)基中繼續(xù)進行生根培養(yǎng)，設(shè)定條件為培養(yǎng)溫度(25±1) ℃，光照強度2 000 lx，光照時間14 h/d。每隔30 d分別取出30瓶組培苗，凈制，晾干，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

生根培養(yǎng)20 d后(瓶內(nèi)苗生長60 d時)，取出醇型、酮型生根組培苗各200瓶，水培1周后移植至相同的土壤中，澆以0.5%滅菌靈、0.2%生根粉混合溶液，每隔30 d收取20棵組培苗，凈制，晾干，在4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 百秋李醇、廣藿香酮含量測定

2.2.1 供試品溶液制備 取粗粉約0.5 g至錐形瓶中，加入二氯甲烷30 mL，超聲處理3次，每次20 min，濾過，合并濾液，回收溶劑，殘渣加正己烷溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，正己烷溶解，0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.2 對照品、內(nèi)標(biāo)溶液制備 精密稱取百秋李醇、廣藿香酮對照品適量，正己烷定容至1 mg/mL，即得對照品溶液。精密稱取正十八烷對照品0.5 mg，正己烷定容至1 mL，即得內(nèi)標(biāo)溶液。

2.2.3 分析條件 GC-MS色譜圖見圖1。

2.2.3.1 色譜 DB-5MS毛細管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)；程序升溫(初始120 ℃，保持2 min，2 ℃/min升至160 ℃，保持2 min，10 ℃/min升至180 ℃，保持2 min，30 ℃/min升至280 ℃)；分流比30∶1；載氣高純氦氣；柱箱溫度120 ℃；進樣口溫度250 ℃；接口溫度250 ℃；進樣量1 μL。

2.2.3.2 質(zhì)譜 EI離子源，溫度200 ℃；電離能量70 eV；掃描質(zhì)量范圍m/z50～500(百秋李醇m/z138，廣藿香酮m/z168，十八烷m/z57)；溶劑延遲2 min。

注：A為對照品，B為瓶內(nèi)生長210 d醇型組培苗，C為移栽自然環(huán)境生長240 d醇型組培苗，D為瓶內(nèi)生長300 d酮型組培苗，E為移栽自然環(huán)境生長240 d酮型組培苗。1.百秋李醇 2.廣藿香酮 3.十八烷1.patchouli alcohol 2.pogostone 3.octadecane圖1 各成分GC-MS色譜圖Fig.1 GC-MS chromatogram of various constituents

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，制成系列質(zhì)量濃度，在“2.2.2”項條件下測定。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)進行回歸，得方程分別為百秋李醇Y=304.65X-0.002(R2=0.999 2)，在0.000 1～0.01 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；廣藿香酮Y=593.25X-1.659 1(R2=0.999 6)，在0.001～0.4 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，在“2.2.2”項條件下進樣測定6次，測得百秋李醇、廣藿香酮峰面積RSD分別為0.28%、0.91%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、10、12、24 h在“2.2.2”項條件下進樣測定，測得百秋李醇、廣藿香酮峰面積RSD分別為1.21%、2.12%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6份，在“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項條件下進樣測定，測得百秋李醇、廣藿香酮峰面積RSD分別為4.82%、2.70%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密稱取同一批各成分含量已知的樣品約0.25 g，共6份，精密加入對照品溶液，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”項條件下進樣測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 各成分加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)Tab.1 Results of recovery tests for various constituents(n=6)

2.3 樣品含量測定 結(jié)果見表2。

表2 各成分含量測定結(jié)果(n=3)Tab.2 Results of content determination of various constituents(n=3)

2.4 醇型廣藿香組培苗指標(biāo)成分動態(tài)變化 隨著生長時間延長，醇型廣藿香培養(yǎng)瓶內(nèi)生長組培苗中百秋李醇含量在0.019～0.151 mg/g范圍內(nèi)先降后升，而廣藿香酮含量升高；在30～210 d，廣藿香酮含量均高于百秋李醇，見圖2A。

隨著生長時間延長，移栽自然環(huán)境生長的醇型廣藿香組培苗中百秋李醇含量呈遞增趨勢，但在240 d時仍低于外植體植株；廣藿香酮含量在150 d時最高，但總體呈下降趨勢，在240 d時與外植體植株相比無顯著差異；在30～210 d，廣藿香酮含量均高于百秋李醇；外界生長210 d時，百秋李醇含量高于廣藿香酮，表現(xiàn)出醇型化學(xué)型特征，見圖2B。

2.5 酮型廣藿香組培苗指標(biāo)成分動態(tài)變化 隨著生長時間延長，酮型廣藿香瓶內(nèi)生長組培苗中百秋李醇含量在0.013～0.022 mg/g范圍內(nèi)波動，變化不大，而廣藿香酮含量逐漸增加，在240 d后更明顯；在30～330 d，廣藿香酮含量均高于百秋李醇，一直呈現(xiàn)酮型化學(xué)型特征，見圖3A。

移栽自然環(huán)境生長的酮型廣藿香組培苗中百秋李醇含量在210 d后升高，但在270 d時仍低于外植體植株；廣藿香酮含量總體呈增加趨勢，在270 d時與外植體植株相比無顯著差異；在30～270 d，廣藿香酮含量均高于百秋李醇，見圖3B。

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。與百秋李醇比較，*P<0.05，**P<0.01。圖2 醇型廣藿香組培苗指標(biāo)成分含量動態(tài)變化Fig.2 Dynamic changes of index components in tissue culture seedlings of patchoulol-type P.cablin

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。與百秋李醇比較，**P<0.01。圖3 酮型廣藿香組培苗指標(biāo)成分含量動態(tài)變化Fig.3 Dynamic changes of index components in tissue culture seedlings of pogostone-type P.cablin

注：不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。與瓶外苗比較，*P<0.05，**P<0.01。圖4 2種化學(xué)型組培苗指標(biāo)成分比較Fig.4 Comparison of index components between two chemotypes tissue culture seedlings

2.6 瓶內(nèi)生長、移栽自然環(huán)境生長的比較 在相同生長時間段，2種化學(xué)型廣藿香瓶外苗中百秋李醇含量均高于瓶內(nèi)苗,見圖4A。醇型廣藿香瓶外苗的廣藿香酮含量低于瓶內(nèi)苗；酮型廣藿香瓶外苗的廣藿香酮含量在30～180 d時高于瓶內(nèi)苗，但在210～240 d時低于后者；在瓶內(nèi)外生長前期醇型組培苗中廣藿香酮含量高于酮型組，但隨著生長時間延長逐漸降低，在240 d時低于酮型,見圖4B。

3 討論

本實驗發(fā)現(xiàn)，在瓶內(nèi)生長的醇型廣藿香組培苗中百秋李醇含量低于廣藿香酮，而移栽自然環(huán)境生長后前者逐漸升高，后者逐漸降低，在210 d時逆轉(zhuǎn)；而酮型廣藿香組培苗無論在培養(yǎng)瓶中生長還是移栽至外界生長，廣藿香酮含量均高于百秋李醇，表明它在30 d叢生芽階段就呈現(xiàn)出廣藿香酮高百秋李醇低的化學(xué)型特點。He[8]發(fā)現(xiàn)，廣藿香是從黃芩亞科分支分化；不同化學(xué)型廣藿香的葉綠體基因組完全相同，只存在1個堿基的差異[9-10]。由于植物葉綠體基因組高度保守，2種化學(xué)型廣藿香葉綠體堿基差異的形成很有可能發(fā)生在傳入我國之前，地理距離在廣藿香的遺傳分化中的作用不明顯[11]，種質(zhì)不同是化學(xué)型差異出現(xiàn)的主導(dǎo)因素，而遺傳學(xué)因素是廣藿香化學(xué)型差異形成的主導(dǎo)因素[4]。

廣藿香酮生物合成增加與相關(guān)基因的啟動子區(qū)域去甲基化有關(guān)[12]。在醇型廣藿香中，百秋李醇與廣藿香酮呈負相關(guān)，可能是百秋李醇和廣藿香酮的生物合成途徑競爭共同的前體[13-14]。醇型瓶內(nèi)苗由于甲基化水平較低，故廣藿香酮含量較高，但移栽自然環(huán)境生長后光照等環(huán)境因子可能導(dǎo)致相關(guān)基因甲基化，隨著其水平增加，該成分含量逐漸降低，而與廣藿香酮合成相關(guān)基因表達的減少反而對百秋李醇合成有促進作用，故兩者出現(xiàn)此消彼長的現(xiàn)象。

酮型化學(xué)型特征的形成除了與5′-CCGG位點胞嘧啶甲基化有關(guān)外，可能還與其它位點甲基化或非編碼RNA等可遺傳的表觀變異有關(guān)[15]。推測酮型組培苗的甲基化水平低于醇型，而且前者可能缺少需要光照等啟動的必要元件，致使相關(guān)基因的啟動子區(qū)未能甲基化，因此移栽前后酮型組培苗一直呈現(xiàn)酮型化學(xué)型特征?！芭葡恪迸c高要蓮塘產(chǎn)廣藿香(酮型)中廣藿香酮含量較高，而“湛香”“南香”(醇型)中百秋李醇、α-愈創(chuàng)木烯等倍半萜類成分含量較高[16]，即2種化學(xué)型廣藿香化學(xué)成分種類和含量存在明顯差異。