多重連接探針擴(kuò)增結(jié)合熔解曲線法鑒別南、北板藍(lán)根摻雜

李小芳， 王文斌， 莫 靜， 定天明,3， 謝 云*， 汪 波

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，湖北 武漢 430065；2.湖北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430062；3.湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，國家藥品監(jiān)督管理局中藥質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430075)

板藍(lán)根(習(xí)稱北板藍(lán)根)為十字花科植物菘藍(lán)IsatisindigoticaFort.的干燥根[1]，南板藍(lán)根為爵床科植物馬藍(lán)Baphicacanthuscusia(Nees) Bremek. 的干燥根莖及根[2]，均有清熱解毒、涼血、利咽等功效[3]，自1995年版《中國藥典》開始，兩者作為2個(gè)品種分別被收載[4]。南、北板藍(lán)根來源于親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)的2個(gè)科，其成分不盡相同，功能主治必然有差別[5]。南板藍(lán)根中具有抗病毒活性的吲哚苷含量為北板藍(lán)根的2倍；靛玉紅對治療慢性粒細(xì)胞白血病有療效，它在南板藍(lán)根中的含量遠(yuǎn)高于北板藍(lán)根；北板藍(lán)根利咽作用強(qiáng)于南板藍(lán)根[6]。

目前，通過性狀來鑒別南、北板藍(lán)根的真?zhèn)尾粔蚩陀^準(zhǔn)確[7]。于英君[8]等采用RAPD 技術(shù)建立了南、北板藍(lán)根DNA指紋圖譜，對兩者進(jìn)行了遺傳差異性分析；孫稚穎[9]等報(bào)道了南、北板藍(lán)根的 ITS2序列；黃志海[7]等利用ITS2條形碼技術(shù)實(shí)現(xiàn)了對南、北板藍(lán)根的區(qū)分鑒定，但關(guān)于兩者混合物中的摻偽情況尚未見報(bào)道。

多重連接依賴性探針擴(kuò)增技術(shù)是一種在單一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)對50個(gè)不同靶基因進(jìn)行定性和半定量分析的核酸檢測技術(shù)[10]，利用MLPA探針與靶序列雜交，通過連接酶進(jìn)行探針的特異性連接，再用一對通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，利用毛細(xì)管電泳進(jìn)行分離分析[11]，具有高通量、高特異性、檢測速度快、操作簡便等特點(diǎn)，在病原微生物的檢測[10, 12]、腫瘤和遺傳性疾病[13-15]的診斷、中藥材真?zhèn)舞b定[16]等領(lǐng)域已有廣泛應(yīng)用。

本實(shí)驗(yàn)基于ITS2特異區(qū)差異，設(shè)計(jì)2對MLPA探針，在傳統(tǒng)MLPA技術(shù)的基礎(chǔ)上再結(jié)合熔解曲線，建立了一種快速準(zhǔn)確鑒別南、北板藍(lán)根的方法，可為兩者質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 藥材 北板藍(lán)根來自安徽阜陽、河北安國、重慶南川等地，南板藍(lán)根來自成都荷花池、海南興隆、重慶、廣西南寧等地，經(jīng)湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院中藥檢驗(yàn)研究中心肖凌博士鑒定為正品，保存于湖北省藥品監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，具體信息見表1。北板藍(lán)根(批號121367-201403)、南板藍(lán)根(批號120971-201507)對照藥材購自中國食品藥品檢定研究院。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

1.2 試劑與儀器 植物基因組DNA提取試劑盒(DP305-03,天根生化科技有限公司)；金牌Mix(green)(TSE101，北京擎科生物科技有限公司)；DNA產(chǎn)物純化試劑盒(D1300, 北京索萊寶科技有限公司)；9°NTMDNA Ligase(M0238S, 北京擎科生物科技有限公司)；2×TSINGKE? Master qPCR Mix-SYBR(+UDG)(TSE203, 北京擎科生物科技有限公司)；DL1000 DNA Marker(日本TaKaRa公司)；瓊脂糖(182215，西班牙Biowest公司)。引物、MLPA 探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

MS204S萬分之一電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司)；75002420冷凍高速離心機(jī)、Nanodrop 2000超微量分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher公司)；PCR 擴(kuò)增儀(美國Bio-Rad公司)；MyGo Mini(美國Life Technologies公司)；Syergyuv超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)； MX-RL-E旋轉(zhuǎn)混懸儀[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)股份公司]；DYY-10C電泳儀(北京君意東方電泳設(shè)備有限公司)；Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；UF55干燥箱(德國美墨爾特公司)；移液器(德國艾本德公司)。

2 方法

2.1 探針設(shè)計(jì)及合成 從NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中下載南板藍(lán)根和北板藍(lán)根的ITS2序列，導(dǎo)入MEGA6軟件篩選主導(dǎo)單倍型并進(jìn)行比對，見圖1。找到其特異性識別區(qū) “CAAGG”“CAAAG”，然后在上下游各截取適宜長度設(shè)計(jì)MLPA探針對。使用UNAfold(http://www.unafold.org/mfold/applications/dna-folding-form.php)網(wǎng)站評價(jià)探針質(zhì)量，BLAST搜索評估探針的特異性，RAW程序預(yù)測探針序列的長度、GC含量和Tm值。設(shè)計(jì)好的探針交由上海生工生物工程股份有限公司合成，新合成的探針為干粉狀態(tài)，使用前在冷凍高速離心機(jī)中12 000 r/min離心30 min，再根據(jù)離心管上的標(biāo)示量，加入一定體積的TE緩沖液使其成為濃度為10 μmol/L的貯備液，使用時(shí)再稀釋成1 μmol/L。探針信息見表2。

圖1 ITS2序列Fig.1 ITS2 sequences

表2 MLPA雜交探針序列Tab.2 HybProbe sequences for MPLA

2.2 模板DNA制備 取干燥植物至滅菌的2 mL離心管中，加入小鋼珠2個(gè)，球磨儀磨成極細(xì)粉。取對照藥材、樣品粉末各50～80 mg, 采用植物基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行DNA提取，超微量分光光度計(jì)檢測DNA濃度和純度，選取質(zhì)量較好者進(jìn)行ITS2序列擴(kuò)增，其擴(kuò)增所用引物為通用引物ITS2F(5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′)、ITS3R(5′-GACGCTTCTCCAGACTACAA-3′)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)電泳后在凝膠成像儀上檢視，取條帶明亮、擴(kuò)增條帶長度符合預(yù)期大小者，一部分由上海生工生物工程股份有限公司進(jìn)行測序，另一部分用DNA產(chǎn)物純化試劑盒按操作步驟進(jìn)行純化(質(zhì)量濃度50～200 ng/μL)，在-20 ℃下保存，后續(xù)進(jìn)行MLPA-熔解反應(yīng)。

2.3 MLPA-熔解反應(yīng) MLPA反應(yīng)包括雜交、連接、實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增、熔解過程。

2.3.1 DNA變性及雜交 取模板DNA 1 μL、預(yù)先充分混合探針1.5 μL、TE緩沖液5.5 μL，混勻，置于PCR儀中，在98 ℃下變形5 min，在70 ℃下雜交20 min，降溫至45 ℃后取出，連接反應(yīng)。取1.28 μL DNA雜交產(chǎn)物，加入6.72 μL 9°N DNA ligase連接酶混合物形成8 μL體系，在45 ℃下連接左右探針15 min，在98 ℃下加熱5 min使連接酶失活。9°N DNA ligase連接酶混合物包括9°N DNA ligase buffer 0.8 μL、9°N DNA ligase 0.32 μL、ddH2O 5.6 μL。

2.3.2 熒光定量PCR擴(kuò)增 取5 μL冷卻后的連接產(chǎn)物，加入2×T5 Fast qPCR Mix 10 μL、正向通用引物0.8 μL(5′-GGGTTCCCTAAGGGTTGGA-3′)、反向通用引物0.8 μL(5′-GTGCCAGCAAGATCCAATCTAGA-3′)、50×ROX Reference Dye Ⅰ 0.4 μL，ddH2O 3 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?5 ℃ 預(yù)變性60 s，95 ℃ 變性10 s，60 ℃ 連接5 s，72 ℃ 延伸15 s，擴(kuò)增38個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min；熔解曲線程序?yàn)?5 ℃變性3 min；熒光采集溫度45～97 ℃，升溫速率0.05 ℃/s，采用MyGo Mini PCR Software 軟件分析特征熔解曲線圖譜。

3 結(jié)果

3.1 探針特異性試驗(yàn) 單一探針特異性試驗(yàn)結(jié)果見圖2A，混合探針特異性試驗(yàn)結(jié)果見圖2B。由圖2A可知，南、北板藍(lán)根對照藥材的模板DNA與其對應(yīng)單一探針進(jìn)行MLPA-熔解曲線反應(yīng)時(shí)，分別產(chǎn)生84.98、83.35 ℃的熔解曲線峰；取北板藍(lán)根探針與南板藍(lán)根模板DNA、南板藍(lán)根探針與北板藍(lán)根模板DNA、不加模板DNA進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，均無熔解曲線峰產(chǎn)生。由圖2B可知，南、北板藍(lán)根模板DNA分別與混合探針進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，產(chǎn)生85.26、83.58 ℃的熔解曲線峰。探針特異性試驗(yàn)說明MLPA探針特異性良好，2個(gè)物種的模板DNA分別只與其對應(yīng)的MLPA探針雜交，與其他物種沒有交叉反應(yīng)，而且探針混合后未影響其特異性。

圖2 探針特異性試驗(yàn)熔解曲線Fig.2 Melting curves for probe specificity tests

3.2 敏感性試驗(yàn) 如圖3所示，當(dāng)北板藍(lán)根(圖3A)模板DNA質(zhì)量為187.0、97.7、47.9、19.9、14.0、7.3、5.3、3.4、1.2、0.72 ng，南板藍(lán)根(圖3B)模板DNA質(zhì)量為151.5、58.0、29.9、15.5、7.5、4.5、2.9、1.4、0.7 ng時(shí)，能產(chǎn)生相應(yīng)的熔解曲線峰；當(dāng)兩者質(zhì)量降低到0.1 ng時(shí)，信號峰響應(yīng)很弱，熔解曲線峰接近于基線。

圖3 敏感性試驗(yàn)熔解曲線Fig.3 Melting curves for sensitivity tests

3.3 混合樣品試驗(yàn) 如圖4所示，當(dāng)南板藍(lán)根比例為90%～5%時(shí)，可觀察到熔解曲線雙峰；將南板藍(lán)根的比例降至3%及3%以下，或北板藍(lán)根的比例降至5%及5%以下時(shí)，則檢測到單一的熔解曲線峰；當(dāng)混合樣品中南板藍(lán)根所占比例不低于5%，或北板藍(lán)根所占比例不低于10%時(shí)可進(jìn)行鑒別。

圖4 混合樣品試驗(yàn)熔解曲線圖譜Fig.4 Melting curves for mixed sample tests

3.4 適用性試驗(yàn) 對26批藥材進(jìn)行MLPA-熔解曲線反應(yīng)，將其DNA測序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列比對，確認(rèn)其基原。結(jié)果，有12批出現(xiàn)(83.53±0.60)℃的熔解曲線峰，14批出現(xiàn)(85.10±0.60)℃的熔解曲線峰，即前者為北板藍(lán)根，后者為南板藍(lán)根，與測序結(jié)果一致。

4 討論

基原、性狀、顯微和理化鑒定作為常規(guī)中藥鑒定方法，在中藥質(zhì)量控制方面發(fā)揮了重要作用[17]。分子生物學(xué)技術(shù)在中藥鑒定領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，如DNA條形碼[18]、RAPD[19]、ISSR、MLPA[4,16-17]等技術(shù)憑借其準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)受到研究者的青睞，但無法對混合樣品進(jìn)行鑒定。本研究利用MLPA技術(shù)結(jié)合熔解曲線，建立了一種新的快速鑒別南、北板藍(lán)根的方法。

MLPA-熔解曲線法在于設(shè)計(jì)與目標(biāo)靶序列高度特異的探針，當(dāng)探針特異性序列與靶序列完全互補(bǔ)，連接酶才能將兩段探針連接成為一段完整的序列[20]，后續(xù)反應(yīng)才能進(jìn)行。每組探針只能與特定的藥材模板DNA雜交，產(chǎn)生對應(yīng)的熔解曲線峰，相互之間不受干擾。靈敏度試驗(yàn)中，隨著南、北板藍(lán)根模板DNA濃度不斷降低，0.7 ng依舊可以產(chǎn)生特異性熔解峰。此外，該方法操作簡單且效率高，在模板DNA準(zhǔn)備好的情況下，使用MyGo Mini 熒光定量PCR儀，只需2～3 h便可完成至少16批樣品的檢測[21]。采用ITS2序列為擴(kuò)增片段，其實(shí)際參與雜交的序列約60 bp，序列較短，而且在基因組內(nèi)為多拷貝，降低了擴(kuò)增和測序的難度，保證了探針合成的數(shù)量和質(zhì)量，并且對于模板DNA的完整性要求不高，能避免因DNA降解對實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生的影響。

綜上所述，MLPA-熔解曲線法具有檢測速度快、靈敏度高、易于操作、成本低且無污染等特點(diǎn)，可為南、北板藍(lán)根的鑒別體系提供可靠的參考依據(jù)。