枸骨葉化學(xué)成分及其抗骨髓炎活性

李一豪， 楊 彬

(河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450002)

枸骨葉為冬青科植物枸骨IlexcornutaLindl.ex Paxt.的干燥葉[1]，主要分布于河南、安徽、湖南等地，始載于《本草拾遺》，具有清熱養(yǎng)陰、疏風(fēng)通絡(luò)、補(bǔ)益肝腎的功效，用于骨蒸潮熱、頭暈頭痛、目眩等，主要化學(xué)成分有黃酮類、三萜類、甾醇類、有機(jī)酸類等[2]，具有抗炎、抗生育、抗腫瘤、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、免疫抑制等活性[3-4]。代金剛等[5]研究表明，枸骨葉可有效緩解風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)紅腫、灼熱、疼痛等癥狀；本實(shí)驗(yàn)對(duì)其有效部位進(jìn)行考察，共分離鑒定出14個(gè)化合物，均為首次從枸骨葉中得到，其中化合物3、10、12、14為首次從該屬植物中發(fā)現(xiàn)，可能具有潛在的抗骨髓炎活性。

1 材料

Element GD Plus型質(zhì)譜儀(美國(guó)Thermo Fisher 公司)；Avance型超導(dǎo)核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)；RTQ-271型電子分析天平、SephadeX LH-20凝膠(瑞典Pharmacia公司)；柱色譜、薄層色譜GF254硅膠(青島海洋化工廠)；RE-2000B型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州市容亞儀器有限公司)；RE-193D型紫外分析儀(鄭州科文儀器設(shè)備有限公司)；DMSO培養(yǎng)液(二甲基亞砜，北京百奧萊博科技有限公司)；LPS(脂多糖，上海鼓臣生物科技有限公司)；吲哚美辛(廣東華南藥業(yè)集團(tuán)有限公司)。所用試劑均為分析純。

枸骨葉采自河南省鄭州市，經(jīng)河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院魯文英副主任藥師鑒定為枸骨IlexcornutaLindl.ex Paxt的葉。

2 提取與分離

取干燥的枸骨葉27.3 kg，90%乙醇回流提取3次(時(shí)間分別為2、2、1 h)，合并提取液，減壓濃縮后得到浸膏3.9 kg，超聲溶解于水中，等體積石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，減壓濃縮得到石油醚部分浸膏281.5 g、二氯甲烷部分浸膏254.2 g、乙酸乙酯部分浸膏193.6 g、正丁醇部分浸膏219.4 g。取二氯甲烷部分浸膏，進(jìn)行硅膠色譜柱分離，以石油醚-丙酮(80∶20～40∶60～20∶80)梯度洗脫，得到7個(gè)組分Fr.B1～Fr.B7，F(xiàn)r.B2進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(90∶10～70∶30～50∶50～30∶70～10∶90)梯度洗脫，得到8個(gè)組分Fr.B2-1～Fr.B2-8，F(xiàn)r.B2-3進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮(30∶70)洗脫，得化合物2(24 mg)；Fr.B2-5進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮(20∶80)洗脫，得化合物3(23 mg)；Fr.B2-7經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(1∶3)洗脫，得化合物14(18 mg)。Fr.B5進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-乙酸乙酯(80∶20～50∶50～20∶80)梯度洗脫，得到9個(gè)組分Fr.B5-1～Fr.B5-9，F(xiàn)r.B5-2進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以石油醚-丙酮(10∶90)洗脫，得化合物5(29 mg)、10(21 mg)；Fr.B5-6經(jīng)結(jié)晶、重結(jié)晶(甲醇)，得化合物4(26 mg)；Fr.B5-8經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(1∶3)洗脫，得化合物9(23 mg)。Fr.C進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-乙酸乙酯(100∶0～60∶40～40∶60～0∶100)梯度洗脫，得到7個(gè)組分Fr.C1～Fr.C7，F(xiàn)r.C3進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-丙酮(80∶20～50∶50～20∶80)梯度洗脫，得到6個(gè)組分Fr.C3-1～Fr.C-6，F(xiàn)r.C3-2進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-丙酮(20∶80)洗脫，得化合物12(22 mg)；Fr.C3-4進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以二氯甲烷-丙酮(10∶90)洗脫，得化合物7(21 mg)、13(26 mg)；Fr.C3-6經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，以二氯甲烷-甲醇(1∶3)洗脫，得化合物6(25 mg)。Fr.D進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以丙酮-甲醇(100∶0～60∶40～20∶80)梯度洗脫，得到5個(gè)組分Fr.D1～Fr.D5，F(xiàn)r.D3進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以乙酸乙酯- 甲醇(70∶30～50∶50～30∶70)梯度洗脫，得到5個(gè)組分Fr.D3-1～Fr.D3-5，F(xiàn)r.D3-3進(jìn)行硅膠柱色譜分離，以丙酮-甲醇(40∶60)洗脫，得化合物1(24 mg)、8(17 mg)； Fr.D3-4經(jīng)Sephadex LH-20柱色譜，以甲醇洗脫，得化合物11(23 mg)。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1: 白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z: 391.7[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ: 2.41(2H，t，J=8.2 Hz，H-2)，0.93(3H，t，J=8.2 Hz，H-24);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 179.1(C-1)，33.8(C-2)，31.7(C-3)，28.4～31.2(C-4～21)，24.6(C-22)，23.1(C-23)，15.2(C-24)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[6]基本一致，故鑒定為二十四烷酸。

化合物2: 白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z: 412.8[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ: 7.81(2H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-2，5)，7.73(2H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-3，4)，4.46(4H，ddd，J=8.2，2.2 Hz，H-2′， 2″)，1.68(2H，m，H-3′，3″)，1.41～1.32(16H，m，H-4′，4″5′，5″，6′，6″，8′，8″)，0.97～0.83(12H，m，H-7′，7′，9′，9′);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 131.7(C-1)，131.7(C-2)，128.7(C-3)，128.7(C-4)，131.7(C-5)，131.7(C-6)， 170.4(C-1′)， 71.3(C-2′)， 39.7(C-3′)，23.9(C-4′)，24.6(C-5′)，28.3(C-6′)，10.9(C-7′)，32.4(C-8′)， 13.8(C-9′)，170.4(C-1″)，71.3(C-2″)，39.7(C-3″)，23.9(C-4″)，24.6(C-5″)，28.3(C-6″)，10.9(C-7″)，32.4(C-8″)，13.8(C-9″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[7]基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酸二-(2-乙基己基) 酯。

化合物3: 紅色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z: 535.1[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ: 7.83(1H，d，J=2.2 Hz，H-16)，7.41(1H，d，J=2.2 Hz，H-17)，7.24(4H，brs，H-3，5，8，12)， 7.03(2H，d，J=8.2 Hz，H-29，33)，6.90(2H，d，J=2.2 Hz，H-20，24)，6.71(2H，d，J=8.2 Hz，H-30，32)，6.61(6H，d，J=2.2 Hz，H-2，6，9，11，21，23)，4.87(2H，s，H-26);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 66.3(C-1)，121.7(C-2)， 159.4(C-3)，130.9(C-4)， 141.2(C-5)，83.1(C-6)，166.3(C-7)，157.2(C-8)，152.4(C-9)，166.3(C-10)，115.2(C-11)，154.2(C-12)，130.9(C-13)，124.1(C-14)，143.0(C-15)，129.3(C-16)，131.6(C-17)，144.2(C-18)，141.7(C-19)， 129.7(C-20)，116.2(C-21)，158.1(C-22)，116.2(C-23)，129.7(C-24)，132.8(C-25)，64.1(C-26)， 85.2(C-27)，99.3(C-28)，133.6(C-29)，115.8(C-30)，133.6(C-33)，162.4(C-31)，115.8(C-32)，102.6(C-33)，113.7(C-34)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[8]基本一致，故鑒定為selaginellin。

化合物4: 白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z: 201.3[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ: 7.58(1H，d，J=12.0 Hz，H-7)，7.47～7.39(2H，m，H-2，6)，6.91～6.84(2H，m，H-3，5)，6.28(1H，d，J=12.0 Hz，H-8)，3.76(3H，s，H-OCH3);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 126.8(C-1)，115.7(C-2)，129.6(C-3)，158.1(C-4)，129.3(C-5)，115.6(C-6)，145.3(C-7)，114.7(C-8)，167.8(C-9)，52.4(C-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[9]基本一致，故鑒定為對(duì)香豆酸甲酯。

化合物5: 白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z192.8[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ: 4.31(1H，m，H-7)，4.18(1 H，m，H-1α)，3.67(1 H，m，H-1β)，2.81(1H，m，H-5)，2.72(1 H，dd，J=8.2，2.2 Hz， H-4α)，2.61(1H，m，H-9)，2.43(1 H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-4β)，1.96(1H，m，H-8)，1.93(1 H，ddd，J=12.0，8.2，2.2 Hz，H-6α)，1.68(1 H，ddd，J=12.0，8.2，2.2 Hz，H-6β)，0.97(3H， d，J=12.0 Hz，H-10);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 67.5(C-1)，72.4(C-2)，177.1(C-3)，33.1(C-4)，35.9(C-5)，40.2(C-6)，76.9(C-7)，40.7(C-8)，45.3(C-9)，12.8(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]基本一致，故鑒定為isobonein。

化合物6: 黃色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z: 305.2[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:7.82(1H，d，J=12.0 Hz，H-5)，7.68(1H，brs，H-9)，7.29(2H，d，J=12.0 Hz，H-2′，6′)，6.93(2H， d，J=12.0 Hz， H-3′，5′)，6.47(1H，dd，J=12.0，8.2 Hz，H-6)，6.31(1H，d，J=8.2 Hz， H-8)，5.29(2H，d，J=2.2 Hz，H-2)， 3.91(3H，s，6′-OCH3);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 61.4(C-1)，68.1(C-2)，127.5(C-3)，179.2(C-4)，130.4(C-5)，109.3(C-6)，164.8(C-7)，101.9(C-8)，135.7(C-9)，162.9(C-10)，113.7(C-11)， 127.1(C-1′)， 132.1(C-2′)，114.2(C-3′)， 158.4(C-4′)， 114.2(C-5′)，132.1(C-6′)，55.2(6′-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]基本一致，故鑒定為bonducellin。

化合物7: 黃色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z: 189.2[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ: 7.95(1H，d，J=8.2 Hz，H-3，5)，7.03(1H，d，J=8.2 Hz，H-2，6)，4.38(1H，q，J=8.2 Hz，H-2′)，1.39(1H，t，J=8.2 Hz，H-3′);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 123.4(C-1)，131.7(C-2)，114.6(C-3)，159.3(C-4)，114.9(C-5)，129.6(C-6)，170.4(C-1′)，59.3(C-2′)，17.1(C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]基本一致，故鑒定為對(duì)羥基苯甲酸乙酯。

化合物8: 白色結(jié)晶(甲醇)，ESI-MSm/z: 201.3[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6， 600 MHz)δ:8.35(1H，s，H-6)，7.93(1H，s，H-2)，3.76(3H，s，8-OCH3);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ:123.1(C-1)，106.3(C-2)，149.1(C-3)，139.2(C-4)，146.4(C-5)，111.8(C-6)，170.2(C-7)，54.6(8-OCH3)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[13]基本一致，故鑒定為沒(méi)食子酸-3-甲基醚。

化合物9: 白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z: 301.4[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ: 7.81(2H，dd，J=8.2，2.2 Hz，H-2，5)，7.43(2H，q，J=8.2，2.2 Hz，H-3，4)，3.92(4H，d，J=8.2 Hz，H-1′， 1″)， 1.95(2H，m，H-2′，2″)，1.05(12H，d，J=8.2 Hz，H-3′，3″，4′，4″);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 131.8(C-1)，129.4(C-2)，129.4(C-3)，129.4(C-4)，129.4(C-5)，131.8(C-6)，72.6(C-1′)，28.2(C-2′)， 20.5(C-3′)，20.5(C-4′)，72.6(C-1″)，28.2(C-2″)，20.5(C-3″)，20.5(C-4″)，158.4(-C=O)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[14]基本一致，故鑒定為鄰苯二甲酸二異丁酯。

化合物10: 白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z: 327.1[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ: 5.42(1H，t，J=8.2 Hz，H-14)，4.96(1H，s，H-17a)，4.48(1H，s，H-17b)，4.09(2H，d，J=8.2 Hz，H-15)，1.57(3H， s， H-16)，0.97(3H，s，H-18)，0.63(3H，s，H-20);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 37.3(C-1)，20.4(C-2)，39.1(C-3)，49.2(C-4)，55.1(C-5)，22.3(C-6)，35.1(C-7)，148.2(C-8)，55.8(C-9)，39.6(C-10)，23.1(C-11)，36.2(C-12)，140.3(C-13)，122.9(C-14)，58.4(C-15)，15.7(C-16)，108.2(C-17)，25.1(C-18)，205.8(C-19)，14.1(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[15]基本一致，故鑒定為isoagatholal。

化合物11: 黃色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z: 214.8[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ:9.63(1H，brs，4-OH)，7.84(2H，d，J=8.2 Hz，H-2，6)，6.81(1H，d，J=8.2 Hz，H-7)，6.69(2H，d，J=8.2 Hz，H-3，5)，5.71(1H，d，J=8.2 Hz，H-8)，4.03(1H，q，J=8.2 Hz，H-1′)，1.24(3H，t，J=8.2 Hz，H-2′);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 125.1(C-1)，134.2(C-2)，114.9(C-3)，126.1(C-4)，117.4(C-5)，132.1(C-6)，143.2(C-7)，115.1(C-8)，166.1(C-9)，60.1(C-1′)，14.2(C-2′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[16]基本一致，故鑒定為對(duì)羥基肉桂酸乙酯。

化合物12: 白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z: 527.1[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ: 5.91(1H，s，H-15)，5.61(1H，t，J=8.2 Hz，H-7)，5.46(1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，4.91(1H，t，J=8.2 Hz，H-1)，2.59(1H，t，J=8.2 Hz，H-9)，2.31～2.26(1H，m，H-8)， 2.19(7-OCOOH，s)，2.16～2.11(1H，m，H-11b)，2.03(6-OCOOH，s)，1.96～1.81(1H，m，H-2a)，1.76～1.69(1H，m，H-2b)，1.65～1.57(1H，m，H-3a)，1.51(1H，s，H-17)，1.49～1.43(1H，m，H-11a)，1.09～1.03(1H，m，H-3b)，1.08(1H，s，H-20)，0.97(1H，s，H-18)，0.92(1H，s，H-19);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 72.4(C-1)，22.3(C-2)，30.8(C-3)，38.2(C-4)，77.9(C-5)，73.6(C-6)，75.1(C-7)，50.2(C-8)，32.8(C-9)，41.1(C-10)，37.9(C-11)，104.2(C-12)，173.8(C-13)，74.1(C-14)，112.8(C-15)，170.1(C-16)，20.3(C-17)，30.4(C-18)，24.1(C-19)，16.2(C-20)，169.1(1-OCOOH)，168.2(6-OCOOH)，170.1(7-OCOOH)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[17]基本一致，故鑒定為neocaesalpin L。

化合物13: 綠色油狀物(甲醇)，ESI-MSm/z: 317.2[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ: 5.39(1H，m，H-14)，4.26(2H，d，J=8.2 Hz，H-15)，1.93(2H， m，H-12)，1.82(3H，brs，H-20)，1.06(3H，s，H-16)，0.91(3H， s，H-17)，0.87(3H，d，J=8.2 Hz，H-18)，0.76(3H，d，J=8.2 Hz，H-19);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 35.8(C-1)，39.1(C-2)，23.9(C-3)， 37.1(C-4)，26.4(C-5)，33.6(C-6)，22.7(C-7)，37.9(C-8)，31.9(C-9)， 35.6(C-10)， 25.1(C-11)，40.6(C-12)，139.7(C-13)，123.5(C-14)，59.1(C-15)， 21.6(C-16)，22.4(C-17)，20.3(C-18)，21.6(C-19)，16.2(C-20)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[18]基本一致，故鑒定為cassipourol。

化合物14: 白色粉末(甲醇)，ESI-MSm/z: 526.9[M + Na]+。1H-NMR(DMSO-d6，600 MHz)δ: 5.91(1H，s，H-4)，4.93(1H，d，J=2.2 Hz，H-1″)，4.53(1H，d，J=8.2 Hz，H-1′)，3.91(1H， t，J=8.2 Hz，H-3″)，3.86(1H，m，H-6′b)，3.75(1H，d，J=8.2 Hz，H-4″)，3.71(1H，td，J=8.2，2.2 Hz，H-9)，3.64(1H，d，J=8.2 Hz，H-5′)，3.37(1H，m，H-6′a)，3.26(2H，m，H-6″)，3.09(1H，t，J=2.2 Hz，H-3′)，2.85(1H，m，H-4′)，2.71(1H，m，H-2′)，2.26(1H，d，J=12.0 Hz，H-2a)，2.03(3H，d，J=2.2 Hz，H-13)，1.64(1H，t，J=8.2 Hz，H-6)，1.51(1H，dd，J=12.0 Hz，H-2b)，1.43(2H，m，H-8)，1.35(3H， m，H-7)，1.12(3H， d，J=8.2 Hz，H-10)，1.09(3H， s，H-11)，0.87(3H，s，H-12);13C-NMR(DMSO-d6，125 MHz)δ: 36.3(C-1)， 46.2(C-2)，197.6(C-3)，123.7(C-4)，166.1(C-5)，49.8(C-6)，25.3(C-7)，35.1(C-8)，74.1(C-9)，22.7(C-10)，25.8(C-11)，29.1(C-12)，23.9(C-13)，103.4(C-1′)，74.0(C-2′)，75.8(C-3′)，69.5(C-4′)，76.9(C-5′)，68.1(C-6′)，110.5(C-1″)，79.1(C-2″)，72.6(C-3″)，76.4(C-4″)，62.4(C-5″)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[19]基本一致，故鑒定為leeaoside。

4 抗骨髓炎活性篩選

選取2021年1月至2021年2月在河南省中醫(yī)院就診的因骨髓炎導(dǎo)致的股骨頭壞死患者8例，經(jīng)知情同意后以髂后上棘為穿刺點(diǎn)，抽取骨髓液2 mL，加入20 mL膠原酶。采用Griess法[20]檢測(cè)總NO水平，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的骨髓液細(xì)胞，配制成細(xì)胞懸液，3 000 r/min離心5 min，移除上清液，以完全培養(yǎng)基再次配置懸液，計(jì)數(shù)后置于6孔培養(yǎng)板中，每孔2 mL，在飽和5% CO2、37 ℃下培養(yǎng)24 h，去除上清液，加入DMEM培養(yǎng)基，隨機(jī)分成LPS(5 μg/L)+化合物(150、75、12.5 μg/L)組和吲哚美辛(150、75、12.5 μg/L)組，各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，分別加入對(duì)應(yīng)化合物，在飽和5% CO2、37 ℃下培養(yǎng)24 h，取上清液，采用SPSS 23.0軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)算IC50值，見(jiàn)表1。結(jié)果顯示，質(zhì)量濃度為150、75、12.5 μg/L的化合物5、13，質(zhì)量濃度為150、75 μg/L的化合物6均可減少骨髓NO釋放量，其中150 μg/L化合物13效果最強(qiáng)，與150 μg/L吲哚美辛比較無(wú)顯著差異(P>0.05)，而其他化合物均無(wú)作用。

表1 各化合物對(duì)骨髓NO釋放量的 IC50值Tab.1 IC50 values of various compounds on NO in bone marrowrelease

5 討論

NO在正常的組織細(xì)胞內(nèi)有少量的表達(dá)，當(dāng)機(jī)體感受炎性刺激時(shí)其水平急速升高，誘導(dǎo)破壞性自由基生成，加重炎性反應(yīng)，可作為抗炎活性篩選常用的考察指標(biāo)[21-22]。本研究從枸骨葉中分離鑒定出13個(gè)化合物，均為首次從該植物中得到，其中化合物5～6、13可能具有潛在的抗骨髓炎活性。本研究豐富了枸骨葉成分資源庫(kù)，對(duì)相關(guān)抗炎藥物的開(kāi)發(fā)提供了一定的幫助。