基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討艾柱燃燒產(chǎn)物保護(hù)視網(wǎng)膜損傷的機(jī)制

陳如一， 郭 璐， 李萱儒， 徐心如， 夏道宗

(浙江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，浙江 杭州 310053)

近年來(lái)，人們?cè)谝壕э@示終端上所花費(fèi)的時(shí)間日益增長(zhǎng)，發(fā)光二極管作為液晶顯示屏中主要的背光源，在工作的過程中會(huì)發(fā)出大量藍(lán)光，進(jìn)而損傷視網(wǎng)膜。視網(wǎng)膜損傷的病理基礎(chǔ)主要是基于視網(wǎng)膜色素上皮(retinal pigment epithelium, RPE)細(xì)胞功能的紊亂、退化和死亡[1]，一方面RPE細(xì)胞作為血-視網(wǎng)膜外屏障的重要組成部分，承擔(dān)著視網(wǎng)膜代謝物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、光感受器外節(jié)段降解以及保護(hù)視網(wǎng)膜免受光損害等重要作用；另一方面，RPE細(xì)胞作為人體內(nèi)耗氧量最大的組織之一，維持其所在部位的氧化還原穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[1-2]，但藍(lán)光輻照使RPE內(nèi)部穩(wěn)態(tài)被打破，體內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)不足以及時(shí)清除體內(nèi)由藍(lán)光誘導(dǎo)的過量氧自由基，進(jìn)而引發(fā)了機(jī)體的氧化應(yīng)激反應(yīng)和視網(wǎng)膜損傷。

艾葉為菊科蒿屬植物艾ArtemisiaargyiLévi. et Vant.的干燥葉，艾柱是由艾葉加工的艾絨填充而成的柱狀物[3]，艾灸治療眼部疾病、緩解視疲勞自古便有應(yīng)用[4]，但其具體作用機(jī)制尚不明確，藥效活性成分和核心靶點(diǎn)蛋白還有待探究。本課題組前期研究表明，艾柱燃燒產(chǎn)物含有苯酚、3-呋喃甲醇等34種成分，具有較強(qiáng)的抗氧化活性[5]；本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[6-7]，通過篩選艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分作用靶點(diǎn)和視網(wǎng)膜損傷疾病靶點(diǎn)建立藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，并對(duì)艾柱燃燒產(chǎn)物保護(hù)視網(wǎng)膜損傷的作用機(jī)制進(jìn)行初步驗(yàn)證，以期為其臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞ARPE-19購(gòu)自美國(guó)模式培養(yǎng)物集存庫(kù)，批號(hào)CRL-2302。

1.2 試劑與藥物 艾柱(批號(hào)20190415)購(gòu)自浙江乾一生物科技有限公司。葉黃素(批號(hào)F10J10M92153)購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；RIPA 裂解液(強(qiáng))、蛋白酶抑制劑混合液、磷酸酶抑制劑混合液、BCA蛋白定量試劑盒均購(gòu)自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；p44/42 MAPK(ERK1/2)、phospho-p44/42 MAPK(p-ERK1/2)、p38 MAPK、phospho-p38 MAPK、GAPDH抗體均購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；IRDye 800 CM Goat anti-Rabbit抗體購(gòu)自美國(guó)LI-COR公司。

1.3 數(shù)據(jù)庫(kù) PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.omim.org)；String數(shù)據(jù)庫(kù)(https://string-db.org/)；Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)(http://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)。

1.4 儀器 Synergy H1型多功能微孔板檢測(cè)儀(美國(guó)BioTek公司)；W201B型數(shù)顯恒溫水浴鍋(上海申勝生物技術(shù)有限公司)；BS224S型電子天平[萬(wàn)分之一，丹佛儀器(北京)有限公司]；5427R型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；CLX-1487型雙色紅外激光成像系[基因科技(上海)有限公司]；Mini-PROTEAN Tetra Cell型垂直電泳系統(tǒng)(美國(guó)Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1 艾柱燃燒產(chǎn)物化學(xué)成分信息及靶點(diǎn)獲取 基于本課題組前期發(fā)現(xiàn)的艾柱燃燒產(chǎn)物化學(xué)成分信息[5]，通過PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)獲得其對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)蛋白，NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)將其名稱轉(zhuǎn)化為基因名，整理合并后得到艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分及其作用靶點(diǎn)。

2.2 “艾柱燃燒產(chǎn)物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將篩選得到的艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分和相關(guān)作用靶點(diǎn)分別導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，構(gòu)建“艾柱燃燒產(chǎn)物-活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，以闡述艾柱燃燒產(chǎn)物物質(zhì)基礎(chǔ)。

2.3 視網(wǎng)膜損傷靶點(diǎn)獲取 通過檢索獲得OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中與視網(wǎng)膜損傷相關(guān)的疾病靶點(diǎn)，取艾柱燃燒產(chǎn)物相關(guān)的作用靶點(diǎn)與視網(wǎng)膜損傷疾病靶點(diǎn)的交集，獲得艾柱燃燒產(chǎn)物保護(hù)視網(wǎng)膜損傷的潛在作用靶點(diǎn)。

2.4 艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分-視網(wǎng)膜損傷-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分、交集靶點(diǎn)與視網(wǎng)膜損傷疾病導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件中，利用軟件功能構(gòu)建艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分-視網(wǎng)膜損傷-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)，在網(wǎng)絡(luò)中艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分、視網(wǎng)膜損傷疾病和靶點(diǎn)由節(jié)點(diǎn)表示，節(jié)點(diǎn)之間的相互關(guān)系由邊表示。

2.5 蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將艾柱燃燒產(chǎn)物與視網(wǎng)膜損傷疾病作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫(kù)中，構(gòu)建蛋白與蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)模型，選擇物種為“Homosapiens”，設(shè)定最低相互作用閾值為低置信度“l(fā)ow confidence(0.150)”，其余參數(shù)保持默認(rèn)設(shè)置，最終獲得蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖。

2.6 GO、KEGG富集分析 將艾柱燃燒產(chǎn)物與視網(wǎng)膜損傷疾病作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)，設(shè)置物種為“Homosapiens”，進(jìn)行GO富集分析(包括生物過程、細(xì)胞組分、分子功能，P≤0.01)和KEGG信號(hào)通路分析(P≤0.05)。通過GO富集分析得到3個(gè)部分?jǐn)?shù)據(jù)繪制柱狀圖，KEGG通路富集分析獲取艾柱燃燒產(chǎn)物保護(hù)視網(wǎng)膜損傷疾病相關(guān)通路，并繪制KEGG氣泡圖，節(jié)點(diǎn)大小表示富集到的靶點(diǎn)數(shù)量，P值越小，信號(hào)通路可信度越高。

2.7 分子對(duì)接技術(shù)預(yù)測(cè)艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分與潛在靶點(diǎn)結(jié)合能力 通過PDB數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.rcsb.org/)獲得目標(biāo)蛋白3D結(jié)構(gòu)(PDB格式)，設(shè)置物種為“Homosapiens”，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲取潛在活性化合物的3D結(jié)構(gòu)(mol2格式)。利用PyMOL軟件(www.pymol.org)去除蛋白質(zhì)上的溶劑和配體，Autodock tools 1.5.6、Autodock_vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，其結(jié)果以結(jié)合自由能的高低作為活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合程度的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，通?；钚晕镔|(zhì)與蛋白質(zhì)結(jié)合的構(gòu)象越穩(wěn)定能量越低，發(fā)生的作用可能性越大，對(duì)接結(jié)果越可靠。

2.8 細(xì)胞培養(yǎng)和處理 取含10%胎牛血清、100 U/mL青霉素/鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ARPE-19細(xì)胞，待細(xì)胞長(zhǎng)到80%時(shí)用胰酶消化，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。調(diào)整細(xì)胞密度2×105/mL，鋪板或皿適應(yīng)12 h后，分為5組，分別為對(duì)照組和藍(lán)光組，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)；對(duì)照+艾柱燃燒產(chǎn)物組和藍(lán)光+艾柱燃燒產(chǎn)物組，換用含2 μg/mL艾柱燃燒產(chǎn)物的培養(yǎng)基培養(yǎng)；藍(lán)光+葉黃素(陽(yáng)性對(duì)照)組，換用含30 μmol/L葉黃素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。藥物預(yù)處理24 h后，在LED藍(lán)光源(430 nm、96.1 W/m2)下光照1 h，得到藍(lán)光誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷模型，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.9 Western blot檢測(cè)MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的ARPE-19細(xì)胞，接種于直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中，按“2.8”項(xiàng)下方法分組及處理后收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解后提取總蛋白，采用BCA法進(jìn)行蛋白定量，加入適量上樣緩沖液，100 ℃下恒溫金屬浴變性10 min，得到蛋白樣本，再進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，加入一抗ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK，稀釋比例均為1∶1 000，置于4 ℃冰箱中，搖床上孵育過夜，以GAPDH(稀釋比例1∶5 000)為內(nèi)參，TBST洗膜3次后，加熒光標(biāo)記的二抗(稀釋比例為1∶10 000)，室溫下避光孵育2 h，TBST洗膜3次后，用LI-COR Odyssey CLx雙色紅外激光成像系統(tǒng)顯影，分析對(duì)比條帶強(qiáng)弱。

3 結(jié)果

3.1 艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分 共得到16種艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分和619個(gè)潛在作用靶點(diǎn)，見表1。

表1 艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分Tab.1 Active MSE components

3.2 艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分及其靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖 圖1顯示，方形陣列的為藥物作用靶點(diǎn)，環(huán)狀排列的為艾柱燃燒產(chǎn)物的活性成分，每條邊代表活性成分與靶點(diǎn)間的相互作用關(guān)系；艾柱燃燒產(chǎn)物中麥芽酚、油酸、烏洛托品等主要成分連接的靶點(diǎn)較多，與CASP7、RORC、CASP3、GBA等潛在靶點(diǎn)相互作用密切。

圖1 艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分及其靶點(diǎn)相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Network diagram for interactions among active MSE constituents and their targets

3.3 視網(wǎng)膜損傷靶點(diǎn) 在OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中以“Retina damage”為關(guān)鍵詞進(jìn)行檢索，將視網(wǎng)膜損傷靶點(diǎn)合并，剔除重復(fù)項(xiàng)，最終得到524個(gè)。

3.4 艾柱燃燒產(chǎn)物靶點(diǎn)與視網(wǎng)膜損傷相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖 將619個(gè)艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分靶點(diǎn)基因與524個(gè)視網(wǎng)膜損傷靶點(diǎn)基因取交集，得到17個(gè)艾柱燃燒產(chǎn)物作用于視網(wǎng)膜損傷的靶點(diǎn)。通過Cytocsape 3.8.0軟件構(gòu)建艾柱燃燒產(chǎn)物靶標(biāo)與視網(wǎng)膜損傷相互作用的網(wǎng)絡(luò)，見圖2，其中圓形(藍(lán)色)代表疾病，正六邊形(綠色)代表藥物，正三角形(黃色)代表有效活性成分，倒三角形節(jié)點(diǎn)(紅色)表示主要靶點(diǎn)，節(jié)點(diǎn)間相互作用關(guān)系用邊表示。由此可知，艾柱燃燒產(chǎn)物能通過多成分、多靶點(diǎn)聯(lián)合調(diào)節(jié)的方式治療視網(wǎng)膜損傷。

圖2 艾柱燃燒產(chǎn)物靶點(diǎn)與視網(wǎng)膜損傷相互作用的網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Network diagram for interactions among MSE targets and retinal damage

3.5 PPI網(wǎng)絡(luò) 艾柱燃燒產(chǎn)物與視網(wǎng)膜損傷作用的相關(guān)靶點(diǎn)共17個(gè)，將其上傳至String數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)，見圖3，其中節(jié)點(diǎn)表示蛋白，邊表示功能相關(guān)性，共包括17個(gè)節(jié)點(diǎn)、36條邊，平均節(jié)點(diǎn)數(shù)為4.24，平均局部聚類系數(shù)為0.732。通過基因相互連接次數(shù)選取Degree值較高者作為核心基因，前5位分別為前列腺素G/H合成酶2(prostaglandin G/H synthase 2, PTGS2)、轉(zhuǎn)錄因子AP-1(transcription factor AP-1, JUN)、溶酶體酸性葡萄糖神經(jīng)酰胺酶(lysosomal acid glucosyl ceramidase, GBA)、酪氨酸受體激酶(tyrosine-protein kinase Lck, LCK)、堿性磷酸酶組織非特異性同工酶(alkaline phosphatase, tissue-nonspecific isozyme, ALPL)，同時(shí)它們也是調(diào)節(jié)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)鍵因子。

圖3 艾柱燃燒產(chǎn)物靶點(diǎn)蛋白的PPI網(wǎng)絡(luò)Fig.3 PPI network of MSE target protein

3.6 GO富集分析 將17個(gè)艾柱燃燒產(chǎn)物與視網(wǎng)膜損傷作用的相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能分析,共得到286個(gè)富集結(jié)果(P<0.01)，其中生物過程(biological process, BP)240項(xiàng)，主要涉及衰老、對(duì)糖皮質(zhì)激素的反應(yīng)、對(duì)皮質(zhì)類固醇的反應(yīng)、去磷酸化、對(duì)維生素D的反應(yīng)等；細(xì)胞組成(cellular component, CC)9項(xiàng)，主要涉及轉(zhuǎn)錄因子AP-1復(fù)合體、核被膜、核纖層蛋白絲、細(xì)胞外面上細(xì)胞器、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體等；分子功能(molecular function, MF)37項(xiàng)，主要涉及cAMP反應(yīng)元件結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄激活物活性，核受體的激活、轉(zhuǎn)錄因子活性，直接配體調(diào)控序列特異性DNA結(jié)合、磷酸酶激活等。根據(jù)-LogP值進(jìn)行排序，分別在生物過程、分子功能、細(xì)胞組分中選出排名靠前的條目，見圖4。

圖4 GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis

3.7 KEGG富集分析 利用Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG富集分析，設(shè)置P<0.05，篩選出與艾柱燃燒產(chǎn)物保護(hù)視網(wǎng)膜損傷相關(guān)的信號(hào)通路，結(jié)果見圖5，可知核心靶點(diǎn)JUN主要富集到Th17細(xì)胞分化信號(hào)通路(圖6)。再根據(jù)P值進(jìn)行排序，前20條KEGG通路及其相關(guān)信息見表2。

圖5 KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis

圖6 Th17細(xì)胞分化富集分析Fig.6 Enrichment analysis for Th17 cell differentiation

表2 KEGG通路分析(前20)Tab.2 KEGG pathway analysis(top 20)

3.8 分子對(duì)接驗(yàn)證 PPI中具有較高Degree值的節(jié)點(diǎn)，被認(rèn)為是關(guān)鍵靶點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)關(guān)鍵靶點(diǎn)JUN的上游蛋白ERK1/2、p38 MAPK進(jìn)行研究，將兩者與16種艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證，結(jié)果見表3。就分子對(duì)接而言，結(jié)合能越小，表明活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間結(jié)合的越牢固，其數(shù)值小于-4.25 kcal/mol時(shí)表示活性物質(zhì)與蛋白質(zhì)之間有一定結(jié)合活性，小于-5.0 kcal/mol時(shí)有較好的結(jié)合活性，小于-7.0 kcal/mol時(shí)有強(qiáng)烈的結(jié)合活性[8]。由此可知，活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的結(jié)合能介于-8.6～-3.7 kcal/mol之間，表明艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分與核心靶點(diǎn)JUN上游蛋白之間具有較好的結(jié)合活性，預(yù)測(cè)結(jié)果可靠。選取4個(gè)對(duì)接能量較小者進(jìn)行展示，結(jié)果見圖7。

圖7 艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)JUN上游蛋白的分子對(duì)接模式Fig.7 Molecular docking patterns for active MSE components and upstream proteins of core JUN targets

表3 艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分與核心靶點(diǎn)JUN上游蛋白的分子對(duì)接結(jié)果Tab.3 Molecular docking results of active MSE components and upstream proteins of core JUN targets

3.9 艾柱燃燒產(chǎn)物對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞中JUN上游ERK1/2、p38 MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 圖8顯示，與對(duì)照組比較，對(duì)照+艾柱燃燒產(chǎn)物組ARPE-19細(xì)胞中ERK1/2、p-ERK1/2、p38 MAPK、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化(P>0.05)；經(jīng)藍(lán)光照射后，ARPE-19細(xì)胞中p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)升高(P<0.01)；與藍(lán)光組比較，藍(lán)光+艾柱燃燒產(chǎn)物組和藍(lán)光+葉黃素組p-ERK1/2、p-p38 MAPK蛋白表達(dá)均降低(P<0.05，P<0.01)。

注：A為對(duì)照組，B為對(duì)照+艾柱燃燒產(chǎn)物組，C為藍(lán)光組，D為藍(lán)光+葉黃素組，E為藍(lán)光+艾柱燃燒產(chǎn)物組。與對(duì)照組比較，**P<0.01；與藍(lán)光組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖8 艾柱燃燒產(chǎn)物對(duì)藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞中ERK1/2、p38 MAPK蛋白表達(dá)的影響Fig.8 Effects of MSE on protein expressions of ERK1/2 and p38 MAPK in blue light-induced ARPE-19

4 討論

近年來(lái)隨著各類電子設(shè)備的普及，視網(wǎng)膜損傷的發(fā)病率日益增高，表現(xiàn)為眼部酸脹、疼痛、視物模糊、眼睛干澀等眼部疾病，中醫(yī)稱其為“肝勞”[9]。艾灸在治療視網(wǎng)膜損傷方面表現(xiàn)出良好的受眾基礎(chǔ)和臨床療效。為了闡釋艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分對(duì)視網(wǎng)膜損傷的保護(hù)作用，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、分子對(duì)接、體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的研究方法，對(duì)其可能的作用機(jī)制進(jìn)行了分析。

通過綜合分析艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)和分子對(duì)接，發(fā)現(xiàn)艾柱燃燒產(chǎn)物關(guān)鍵化合物主要為油酸、麥芽酚和烏洛托品等。其中，油酸是一種單不飽和脂肪酸，能預(yù)防由高脂血癥引起的視網(wǎng)膜損傷[10]；麥芽酚是一種天然的芳香化合物，具有較強(qiáng)的自由基清除能力，能抑制H2O2作用下NF-κB核轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化，從而保護(hù)大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激的損傷[11]；烏洛托品作為一種具有抗生素活性的雜環(huán)有機(jī)化合物，可能在艾灸過程中起到一定的消毒殺菌作用[12]。

蛋白互作網(wǎng)絡(luò)顯示，艾柱燃燒產(chǎn)物保護(hù)視網(wǎng)膜損傷的靶點(diǎn)涉及CASP7、RORC、GBA、ATF6等。其中，caspase-7(CASP7)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞caspase家族中參與細(xì)胞凋亡執(zhí)行的成員，在損傷誘導(dǎo)的RGC細(xì)胞死亡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，抑制其活性是青光眼和其他視網(wǎng)膜神經(jīng)退行性疾病的新治療策略[13]；維甲酸相關(guān)孤兒核受體(RORC)是一種重要的T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它在實(shí)驗(yàn)性自身免疫性葡萄膜視網(wǎng)膜炎(EAU)的進(jìn)程中會(huì)發(fā)生動(dòng)態(tài)甲基化改變，通過調(diào)控這種動(dòng)態(tài)的甲基化過程可對(duì)其進(jìn)行治療[14]；GBA是一種與帕金森疾病密切相關(guān)的基因，帕金森病患者視覺障礙與其的突變有關(guān)[15]；激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6, ATF6)是6種會(huì)導(dǎo)致全色盲(achromatopsia, ACHM)的基因之一，其突變或者多組等位基因的刪除會(huì)引發(fā)視力下降，甚至全色盲，外源性激活藥物可能通過促進(jìn)ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運(yùn)來(lái)幫助其恢復(fù)活性，進(jìn)而糾正視力損傷[16]。

通過Metascape數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集分析，發(fā)現(xiàn)艾柱燃燒產(chǎn)物治療視網(wǎng)膜損傷的關(guān)鍵通路涉及Th17細(xì)胞分化、IL-17信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路等。其中，Th17細(xì)胞是一種以表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子RORC為特征的淋巴細(xì)胞亞群，在自身免疫性疾病的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮重要作用[17]，體外的小分子化合物能通過調(diào)節(jié)其免疫應(yīng)答來(lái)誘導(dǎo)Treg細(xì)胞改善實(shí)驗(yàn)性EAU[18]；IL-17RA作為IL-17信號(hào)通路的主要受體，當(dāng)RPE細(xì)胞處于氧化應(yīng)激狀態(tài)時(shí)能抑制其蛋白表達(dá)，可預(yù)防氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[19]；NF-κB是一種快速誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子，在基因誘導(dǎo)的疾病細(xì)胞反應(yīng)中發(fā)揮著廣泛作用，尤其是在免疫系統(tǒng)中[20]，ROS介導(dǎo)其激活后，可直接調(diào)控Ascl1表達(dá)和成纖維細(xì)胞重編程為化學(xué)誘導(dǎo)的光感受器樣細(xì)胞，在視網(wǎng)膜變性小鼠模型中部分恢復(fù)瞳孔反射和視覺功能[21]。

采用分子對(duì)接技術(shù)將艾柱燃燒產(chǎn)物活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)JUN上游ERK1/2、p38 MAPK蛋白進(jìn)行結(jié)合能力預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)麥芽酚、石竹素、叉明草素、豆甾醇與2種蛋白均具有良好的結(jié)合活性。同時(shí)，結(jié)合藍(lán)光誘導(dǎo)ARPE-19細(xì)胞損傷模型對(duì)具有結(jié)合活性的ERK1/2、p38 MAPK靶點(diǎn)進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)艾柱燃燒產(chǎn)物組兩者蛋白表達(dá)均降低，表明艾柱燃燒產(chǎn)物能通過作用于JUN上游ERK1/2、p38 MAPK信號(hào)通路來(lái)拮抗視網(wǎng)膜損傷發(fā)生發(fā)展。此外，本研究基于前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然艾柱在燃燒后成分組成發(fā)生了很大變化，但其作用于視網(wǎng)膜損傷疾病的靶點(diǎn)卻與艾柱揮發(fā)油基本相同，表明通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)來(lái)研究中藥在燃燒或炮制過程中化學(xué)成分的變化及作用靶點(diǎn)的改變是有價(jià)值的，可更明確是哪些活性物質(zhì)及靶點(diǎn)在疾病治療過程中起到核心作用。