HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定狼毒二鱉消積湯中6種成分

楊浩然， 岳秀永， 付正豐*

(1.重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶 404020；2.重慶大學(xué)附屬三峽醫(yī)院，重慶 404000)

狼毒二鱉消積湯系重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校楊德全教授經(jīng)驗(yàn)方，由瑞香狼毒、木鱉子、鱉甲、紅豆杉、藤梨根等藥材組成，臨床上用于中晚期肝癌患者的治療，方中狼毒[1]、木鱉子[2]、鱉甲[3-4]活血化瘀通絡(luò)、破結(jié)軟堅(jiān)，紅豆杉[5]、藤梨根[6]清熱解毒抗癌，全方具有扶正抗癌之功效。經(jīng)長(zhǎng)期臨床應(yīng)用驗(yàn)證，該方在改善患者臨床癥狀、減輕痛苦、延長(zhǎng)生存期等方面療效確切，有一定的推廣價(jià)值。

目前，狼毒二鱉消積湯尚缺乏關(guān)于質(zhì)量控制方面的研究。為了保證用藥有效性和安全性，本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[2,7-9]報(bào)道和前期研究結(jié)果，選擇瑞香狼毒中新狼毒素A和狼毒素、藤梨根和木鱉子中齊墩果酸、藤梨根中熊果酸、曼地亞紅豆杉中三尖杉寧堿和紫杉醇作為指標(biāo)，采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)法(HPLC-DAD)測(cè)定上述成分含量，以期為狼毒二鱉消積湯質(zhì)量控制提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀，配置G1312A二元泵、G1329A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1315B二極管陣列檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司)；5430R離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司)；R200D電子天平(德國(guó)Sartorius公司)；KQ-300DE型醫(yī)用超聲波清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司)；FW177型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)。

1.2 試劑與藥物 狼毒素A(批號(hào)19082135)、狼毒素(批號(hào)19012418)對(duì)照品購(gòu)自武漢中標(biāo)科技有限公司；齊墩果酸(MUST-16082517)、熊果酸(MUST-16011712)對(duì)照品購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司；三尖杉寧堿(批號(hào)100926-201812)、紫杉醇(批號(hào)100382-201907)對(duì)照品購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院，純度均大于98%。狼毒、鱉甲、木鱉子、曼地亞紅豆杉、藤梨根均購(gòu)自重慶中藥材有限公司，經(jīng)三峽中藥研究所付紹智教授鑒定為正品，均符合2020年版《中國(guó)藥典》規(guī)定。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 迪馬Platisil ODS色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相0.05%三氟乙酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～30 min，25%～55%B；30～56 min，55%～90%B)；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm(齊墩果酸、熊果酸)、227 nm(三尖杉寧堿、紫杉醇)、290 nm(新狼毒素A、狼毒素)；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇對(duì)照品適量，加甲醇制成各成分質(zhì)量濃度分別為680.2、422.5、1 508、1 072、75.66、17.82 μg/mL的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液 根據(jù)處方稱取狼毒3.0 g、木鱉子10.0 g、鱉甲12.0 g、紅豆杉5.0 g、藤梨根50.0 g，10倍量水(800 g)浸泡30 min，大火煎開(kāi)后轉(zhuǎn)小火煎煮1 h，濾過(guò)，再加8倍量水同法煎煮1 h，濾過(guò)，合并濾液，濃縮至100 mL(生藥量0.8 g/mL)，吸取濃縮液10 mL，甲醇稀釋至20 mL，混勻，10 ℃、5 000 r/min離心5 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.2.3 陰性樣品溶液 取缺狼毒、缺木鱉子、缺藤梨根、缺紅豆杉陰性樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.3 專屬性考察 取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖1。由此可知，各成分色譜峰分離度良好(均大于1.6)，理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均大于3 000，陰性無(wú)干擾，表明該方法專屬性良好。

2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，置于10 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以對(duì)照品峰面積(Y)對(duì)質(zhì)量濃度(X)進(jìn)行回歸，結(jié)果見(jiàn)表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一份對(duì)照品溶液20 μL(含新狼毒素A 68.02 μg/mL、狼毒素42.25 μg/mL、齊墩果酸150.8 μg/mL、熊果酸107.2 μg/mL、三尖杉寧堿7.566 μg/mL、紫杉醇1.782 μg/mL)，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇峰面積RSD分別為1.02%、0.89%、1.58%、1.71%、1.80%、1.05%，表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取處方藥材適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，室溫下于0、2、4、6、8、12、24 h在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇峰面積RSD分別為2.64%、2.18%、2.05%、2.57%、3.28%、3.76%，表明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批藥材，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇峰面積RSD分別為3.20%、2.71%、3.09%、3.11%、2.12%、3.28%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取各成分含量已知的對(duì)半量處方藥材，即狼毒1.5 g、木鱉子5 g、鱉甲6 g、紅豆杉2.5 g、藤梨根25 g，加入“2.2.1”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 mL，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇平均加樣回收率分別為97.62%、96.57%、101.34%、96.31%、94.52%、102.08%，RSD分別為2.05%、2.18%、2.97%、2.13%、3.52%、4.02%。

2.9 樣品含量測(cè)定 取處方藥材適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，代入表1回歸方程，并折算成“2.2.2”項(xiàng)下濃縮液(甲醇稀釋前)中各成分含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 各成分含量測(cè)定結(jié)果(μg/mL)Tab.2 Results of content determination of various constituents(μg/mL)

3 討論

3.1 檢測(cè)指標(biāo)選擇 狼毒具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等活性[1]，但它有毒性，在畜牧業(yè)中被視為毒草[10-11]，所含新狼毒素A、狼毒素等黃酮類成分既具有抗癌作用，又為毒性來(lái)源[1,7]；藤梨根是常用的抗腫瘤中藥[6,12-13]，所含齊墩果酸、熊果酸具有抗癌、護(hù)肝等作用[6,14]；木鱉子中齊墩果酸為主要成分之一[15-16]；紅豆杉含有紫杉醇和三尖杉寧堿，具有很好的抗腫瘤活性[5,9]，故本實(shí)驗(yàn)選擇上述6種成分作為檢測(cè)指標(biāo)。另外，鱉甲具有軟堅(jiān)散結(jié)的功效[3,4,17-18]，但其定性鑒別和定量測(cè)定方法難以與本實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一，故未涉及該藥材，需另行開(kāi)展研究。

3.2 色譜條件選擇 本實(shí)驗(yàn)在參考文獻(xiàn)[2,7-9,19]和預(yù)實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，考察了水相體系0.1%甲酸、0.1%磷酸鹽緩沖液、0.05%三氟乙酸，發(fā)現(xiàn)0.05%三氟乙酸可使各成分得到良好分離，色譜峰對(duì)稱性理想，故采用0.05%三氟乙酸-乙腈作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。然后，采用二極管陣列檢測(cè)器(DAD)在200～400 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)對(duì)6種成分進(jìn)行掃描，確定了最大吸收波長(zhǎng)，再通過(guò)多波長(zhǎng)切換方式進(jìn)行檢測(cè)。

3.3 供試品溶液制備方法選擇 本實(shí)驗(yàn)參考文獻(xiàn)[20]，考察了不同溶劑(不同體積分?jǐn)?shù)甲醇、乙醇)、提取方式(超聲、熱提)，基于提取效率、減少雜質(zhì)、操作簡(jiǎn)便等方面的考慮，確定供試品溶液制備方法為藥材煎煮濃縮后先加甲醇低溫離心，再用微孔濾膜過(guò)濾。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定狼毒二鱉消積湯中新狼毒素A、狼毒素、齊墩果酸、熊果酸、三尖杉寧堿、紫杉醇的含量，該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、可靠，可為該方質(zhì)量控制和深入開(kāi)發(fā)提供參考。