谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗生理特性的影響

雷 陽，喬 寧，苗如意，楊玉花，梁燕萍

（1.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)基因與資源研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部黃土高原作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山西 太原 030031）

鎘（Cd）是植物體內(nèi)的有害元素，極易被植物吸收，并通過維管束從根轉(zhuǎn)移至地上部［1］。鎘元素在植物體內(nèi)大量富集會(huì)引起活性氧（ROS）積累，造成氧化脅迫，影響RNA和蛋白質(zhì)的正常表達(dá)合成，導(dǎo)致植物生長發(fā)育遲滯、光合作用受阻［2］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，我國土壤重金屬污染情況極其嚴(yán)重，污染超標(biāo)率高達(dá)19.4%，每年因重金屬污染造成的糧食損失接近1000萬t，其中36.08%的重金屬污染為鎘含量超標(biāo)［3-4］。

谷胱甘肽（GSH）是谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸縮合而成的水溶性氨基酸衍生物［5］，GSH可直接或間接清除ROS［6］，同時(shí)也能通過后續(xù)反應(yīng)與鎘等重金屬離子發(fā)生螯合，降低重金屬對(duì)植物的脅迫［7］。γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）是植物體內(nèi)GSH合成路徑上游的關(guān)鍵酶，丁硫堇（BSO）是該酶的抑制劑，能夠有效減少植物體內(nèi)GSH的含量，從而降低植物對(duì)重金屬的耐受性［8］。蔡仕珍等［9］研究表明，外源GSH可有效提高鎘脅迫下綿毛水蘇的生物量、光能的捕獲與轉(zhuǎn)換能力、抗氧化酶活性，有效緩解鎘脅迫對(duì)植株幼苗生長的抑制作用。楊志峰等［10］研究表明，GSH可有效減輕低溫脅迫下葉綠體膜脂的過氧化程度，增強(qiáng)黃瓜幼苗的抗寒性。Zhou等［11］研究表明，GSH可有效緩解鹽脅迫對(duì)番茄光合作用的抑制，并提高抗氧化物酶活性，而添加BSO則會(huì)起到與GSH相反的作用。

近年來，隨著我國鎘污染的情況不斷惡化，科研工作者做了大量關(guān)于緩解植物鎘脅迫的研究［12-14］。然而，關(guān)于GSH和BSO對(duì)鎘脅迫下辣椒葉片和根部生理影響的研究尚未見報(bào)道。鑒于此，本研究針對(duì)辣椒生產(chǎn)中出現(xiàn)的鎘污染問題，探究了鎘脅迫下GSH和BSO對(duì)辣椒幼苗各項(xiàng)生理性指標(biāo)的影響，旨在探討GSH對(duì)辣椒逆境響應(yīng)的調(diào)節(jié)機(jī)理，豐富辣椒抗逆機(jī)理的理論認(rèn)識(shí)，以期為辣椒耐重金屬栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試?yán)苯菲贩N為晉椒503（Capsicum annuumL.cv. Jinjiao 503），由山西省園藝學(xué)院辣椒育種團(tuán)隊(duì)提供。CdCl2、GSH和BSO均購自Sigma公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子萌發(fā)試驗(yàn)

選取均勻、無病害的晉椒503辣椒種子，用滅菌水在室溫下浸泡4～5 h。進(jìn)而用75%乙醇沖洗20 s，15%的NaClO沖洗15 min，滅菌水洗滌3次，放入真空干燥箱40℃烘干30 min，播種于72孔的穴盤中，置于25℃（光/暗，12 h/12 h）光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)15 d后，取長勢(shì)一致的幼苗，分成對(duì)照組（CK，處理液為滅菌水）和4個(gè)處理組（表1）移栽至營養(yǎng)箱中。在處理12 d后分別取樣測(cè)定各指標(biāo)含量，每處理測(cè)定3株，3次重復(fù)。

表1 試驗(yàn)處理

1.2.2 幼苗生理指標(biāo)的測(cè)定

葉部和根部Cd含量的測(cè)定：稱取晉椒503辣椒葉片或根部0.1 g，加入硝酸∶過氧化氫（H2O2）=3∶2的混合溶液5 mL，在消解爐中160℃消解4 h，蒸餾水定容至50 mL，火焰原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。

葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量的測(cè)定：避光條件下取晉椒503辣椒幼苗葉片2 g，采用丙酮溶解法提取，然后分別在470、649和665 nm波長下測(cè)定。

GSH、氧化型谷胱甘肽（GSSG）含量、超氧陰離子（O2·-）產(chǎn)生速率和H2O2含量的測(cè)定采用Murshed等［15］的方法。根據(jù)試劑盒說明書（蘇州格銳思生物技術(shù)有限公司）測(cè)定抗氧化物酶和抗壞血酸（AsA）-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶活性。過氧化物酶（POD）：在470 nm比色，記錄10 s和1 min 10 s吸光值。超氧化物歧化酶（SOD）：靜置30 min，在450 nm比色。過氧化氫酶（CAT）：靜置30 min，在510 nm比色?？箟难徇^氧化物酶（APX）：在290 nm比色，記錄30 s和5 min 30 s吸光值。單脫氫抗壞血酸還原酶（MDHAR）：在340 nm比色，記錄10 s和5 min 10 s吸光值。脫氫抗壞血酸還原酶（DHAR）：在265 nm比色，記錄10 s和3 min 10 s吸光值。谷胱甘肽還原酶（GR）：在412 nm比色，記錄30 s和10 min吸光值。谷胱甘肽過氧化物酶（GPX）：在340 nm比色，記錄3 s和10 min吸光值。γ-GCS：在412 nm比色，記錄1 min吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016整理數(shù)據(jù)和作圖；SAS 1.2分析數(shù)據(jù)，Duncan法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗生物量的影響

由表2可知，與CK相比，Cd處理的根長、株高、地上部鮮重和地下部鮮重均有顯著（P＜0.05，下同）下降，降幅分別為19.57%、14.69%、31.74%和29.04%。在鎘脅迫下，噴施谷胱甘肽的處理CdGSH比Cd處理的根長顯著升高了22.01%，株高顯著提高了6.59%，地上部鮮重顯著增加了39.11%，地下部鮮重顯著增加了26.47%；噴施谷胱甘肽合成抑制劑BSO可顯著降低辣椒地下部鮮重，而根長、株高和地上部鮮重與Cd處理差異不顯著；同時(shí)噴施GSH和BSO，比單獨(dú)噴施BSO的處理CdBSO在根長、地上部鮮重和地下部鮮重均有顯著提升，而比CdGSH處理均有顯著降低。

表2 GSH和BSO對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗生物量的影響

2.2 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗葉片光合色素含量的影響

光合色素的含量可以作為衡量植物對(duì)重金屬脅迫耐受性的一個(gè)重要指標(biāo)。由表3可知，與CK相比，處于鎘脅迫下Cd處理的葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量和葉綠素a/葉綠素b均顯著降低，分別降低了48.36%、35.03%、40.13%和18.64%。在鎘離子脅迫下，施加GSH與Cd處理相比，辣椒幼苗葉片的葉綠素a含量顯著提高了82.65%，葉綠素b顯著提高了51.33%，類胡蘿卜素含量顯著提高了32.19%，葉綠素a/葉綠素b顯著提高了20.70%。噴施谷胱甘肽合成抑制劑BOS后，葉部的3種光合色素含量較Cd處理均有顯著下降。同時(shí)噴施GSH和BSO，比單獨(dú)噴施BSO的CdBSO處理，葉片的綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量均有顯著提升。

表3 GSH和BSO對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗光合色素的影響

2.3 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗鎘含量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

由表4可知，各個(gè)處理的葉部鎘含量均小于根部的鎘含量。在鎘脅迫下噴施GSH后，辣椒幼苗葉部和根部的鎘含量均比Cd處理顯著升高，增幅分別為11.26%和33.26%，轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)有所降低，但差異不顯著。在噴施BSO后，葉部鎘含量比Cd處理顯著下降了12.82%，而根部則降低了10.53%。同時(shí)噴施GSH和BSO，比單獨(dú)噴施BSO的CdBSO處理，葉片和根部鎘含量分別顯著提升了16.34%和35.56%，而比CdGSH處理葉片和根部鎘含量分別顯著降低了10.00%和18.94%。

表4 GSH和BSO對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗鎘含量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

2.4 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗抗氧化酶活性的影響

SOD、CAT、APX和POD是植物重要的抗氧化酶，在植物體清除ROS的過程中起到重要作用。由圖1可知，辣椒葉部的4種抗氧化酶活性總體上均高于根部的酶活性。與CK相比，Cd處理根部的SOD活性以及根部和葉部的CAT、APX和POD活性均顯著下降。在鎘脅迫下，噴施GSH對(duì)根部的SOD、CAT、APX和POD活性均顯著提升，比Cd處理分別增加了49.63%、68.15%、51.60%和59.72%；噴施GSH對(duì)葉部的CAT、APX和POD酶活性均顯著提升，相比于Cd處理分別有28.11%、64.86%和40.47%的增幅。在噴施BSO后，辣椒葉部SOD、CAT和POD活性均顯著下降。同時(shí)噴施GSH和BSO，葉部的CAT、APX和POD酶活性和根部的SOD、CAT、APX、POD酶活性比CdBSO處理均顯著提升。

圖1 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒抗氧化物酶活性的影響

2.5 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗AsAGSH循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

AsA-GSH循環(huán)是除了抗氧化物酶系統(tǒng)以外，另一套植物體清除ROS的重要系統(tǒng)，GR、DHAR、MDHAR、GPX和γ-GCS是該系統(tǒng)的關(guān)鍵酶。由圖2可知，與CK相比，Cd處理根部和葉部的GR、DHAR、MDHAR和γ-GCS活性均顯著降低，而GPX活性則顯著升高。在鎘脅迫下，補(bǔ)充GSH可顯著提升GR、DHAR、MDHAR和GPX在辣椒葉片和根部的活性，而γ-GCS活性在葉部降低，在根部則與Cd處理差異不顯著。在施加了BSO后，葉部的GR、DHAR、GPX、γ-GCS活性和根部的MDHAR、DHAR、GPX、γ-GCS活 性 與Cd處理相比均顯著降低。同時(shí)噴施GSH和BSO，葉部和根部的GR、DHAR、MDHAR、GPX酶活性比CdBSO處理均顯著提升。

圖2 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶活性的影響

2.6 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗GSH循環(huán)的影響

GSH是植物體內(nèi)清除ROS的重要還原性物質(zhì)，GSH/GSSG代表了細(xì)胞內(nèi)還原氧化性物質(zhì)的能力，與植物抵抗非生物脅迫能力相關(guān)。由圖3可知，Cd處理比CK處理根部和葉部的GSH、GSSG含量顯著升高，葉部GSH/GSSG顯著降低，而根部GSH/GSSG變化不顯著。相比于Cd處理，CdGSH處理可顯著提升鎘脅迫下的辣椒葉片和根部GSH、GSSG含量和GSH/GSSG，增幅分別為165.83%、62.62%、37.18%和15.89%、93.78%、40.32%。相比于Cd處理，CdBSO處理可顯著降低辣椒葉部和根部GSH、GSSG含量以及葉部的GSH/GSSG。同時(shí)噴施GSH和BSO，葉部和根部GSH、GSSG含量和GSH/GSSG比CdBSO處理均顯著提高；與CdGSH處理相比，CdGSHBSO處理葉部的GSH、GSSG含量和GSH/GSSG均顯著下降，根部只有GSH顯著下降。

圖3 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒GSH循環(huán)的影響

2.7 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗ROS的影響

O2·-和H2O2是植物體內(nèi)主要的ROS，O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量可代表植物細(xì)胞內(nèi)ROS的積累程度。由圖4可知，與CK相比，Cd處理葉部和根部的O2·-產(chǎn)生速率分別顯著下降44.01%和60.63%，H2O2含量在葉部和根部分別顯著下降53.83%和119.98%。在鎘脅迫下，噴施GSH后，葉部和根部的O2·-產(chǎn)生速率比Cd處理分別降低27.92%和23.99%，H2O2含量分別降低24.99%和31.81%。在噴施BSO后，葉部和根部的O2·-產(chǎn)生速率和根部的H2O2含量均顯著升高。同時(shí)噴施GSH和BSO，葉部和根部的O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量比CdBSO處理均顯著降低，而與CdGSH處理相比則顯著上升。

圖4 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量的影響

3 討論

3.1 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗生物量和光合色素的影響

鎘脅迫會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)過量的ROS迅速積累，影響光合色素的穩(wěn)定性，阻礙光合作用對(duì)能量的轉(zhuǎn)化，破壞營養(yǎng)物質(zhì)的正常積累，從而嚴(yán)重影響植物生物量的增長［16］。本研究結(jié)果表明，在鎘脅迫條件下辣椒幼苗根長、株高、地上部鮮重和地下部鮮重以及葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素含量明顯下降，在葉面噴施GSH則可有效提升鎘脅迫下辣椒生物量和光合色素的含量，而噴施GSH合成抑制劑BSO則會(huì)加重鎘脅迫下辣椒生物量和光合色素含量的下降。正面和反面的結(jié)果共同說明GSH可以緩解鎘脅迫辣椒幼苗生長發(fā)育的抑制和對(duì)光合色素的降解，有效保護(hù)辣椒光合系統(tǒng)，從而提升幼苗對(duì)鎘脅迫的耐受性。

3.2 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗鎘含量和轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)的影響

GSH可通過聚合反應(yīng)形成多聚物骨架，進(jìn)而與重金屬陽離子發(fā)生螯合形成螯合肽，在重金屬吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)方面起著重要作用［17-18］。本研究結(jié)果表明，在葉面噴施GSH可增加葉部和根部的鎘含量，其中根部鎘含量的增加更為明顯，因此轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)反而下降；噴施BSO可同等程度地降低葉部和根部的鎘含量，因此轉(zhuǎn)運(yùn)系數(shù)變化不顯著。Yuan等［19］的研究表明，對(duì)馬藺噴施GSH會(huì)顯著增加根部和葉部的鉛含量，這與本研究結(jié)果相一致，但馬藺對(duì)鉛的轉(zhuǎn)移系數(shù)會(huì)因GSH而增加，這與本研究結(jié)果不同。Nakamura等［20］的研究結(jié)果表明，對(duì)油菜噴施BSO可降低根中鎘含量，但會(huì)增加油菜莖葉中的鎘含量，也與本研究結(jié)果部分不同，這可能是植物種類、重金屬種類和施用方式不同導(dǎo)致的。噴施GSH顯著增加了辣椒根部和葉部的鎘含量，但卻沒有對(duì)辣椒的生長和光合作用造成損害，反而增加了辣椒的生物量和光合色素含量。這可能是由于GSH通過螯合作用將原本可自由移動(dòng)的鎘離子固定為金屬螯合肽，螯合物可被轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白運(yùn)送至細(xì)胞外或儲(chǔ)存于液泡內(nèi)。辣椒鎘元素的總含量雖然在上升，但是可對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生脅迫的活性鎘的有效濃度卻明顯下降，因此減輕了細(xì)胞膜的過氧化程度，保護(hù)了光合色素的穩(wěn)定性，維護(hù)了營養(yǎng)物質(zhì)的正常積累。

3.3 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗抗氧化物酶的影響

植物體內(nèi)清除O2·-和H2O2等ROS的機(jī)制可分為抗氧化酶和非酶2個(gè)清除系統(tǒng)：抗氧化酶系統(tǒng)的關(guān)鍵酶為POD、SOD、CAT、APX；非酶系統(tǒng)又稱為AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)［21］。SOD可將O2·-催化分解為H2O2和O2，而H2O2可分別由POD催化還原型輔酶代謝以及APX催化AsA代謝，或者是CAT直接清除，因而抗氧化酶在響應(yīng)重金屬脅迫中具有重要作用［22］。本研究結(jié)果表明，鎘脅迫會(huì)造成辣椒幼苗的抗氧化物酶活性降低，這可能是鎘離子替換了抗氧化酶活性中心的鎂、鐵和錳等金屬陽離子，造成部分酶的功能喪失。對(duì)鎘脅迫下的辣椒幼苗噴施外源GSH后，抗氧化物酶活性均顯著提高，而添加BSO則會(huì)抑制這些酶的活性，從正反兩方面說明GSH可有效保護(hù)抗氧化物酶行使正常功能，降低鎘脅迫對(duì)酶活性的影響。

3.4 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗AsAGSH循環(huán)及其關(guān)鍵酶活性的影響

AsA和GSH可直接還原ROS，氧化產(chǎn)物分別為DHA和GSSG。GR則可將氧化態(tài)的GSSG還原為GSH［23］，MDHAR和DHAR酶可分別將單脫氫抗壞血酸（MDHA）和DHA還原為AsA［24］，GPX以GSH為電子供體還原ROS，γ-GCS是植物體內(nèi)GSH合成路徑上游的關(guān)鍵酶［25-28］。本研究結(jié)果表明，在鎘脅迫下，辣椒根部和葉部的GR、DHAR、MDHAR和γ-GCS活性以及GSH/GSSG均顯著降低，而GPX活性以及GSH、GSSG含量則顯著上升。同時(shí)本研究結(jié)果也表明，補(bǔ)充GSH可顯著提升辣椒葉片和根部GR、DHAR、MDHAR和GPX的活性以及GSH、GSSG含量和GSH/GSSG，而γ-GCS在葉部的活性則隨著GSH的增加而降低；添加BSO可不同程度地降低MDHAR、GR、DHAR、GPX和γ-GCS活性以及GSH、GSSG含量和GSH/GSSG。結(jié)果從正反兩方面說明GSH可通過激活A(yù)sA-GSH循環(huán)系統(tǒng)關(guān)鍵酶活性來提升AsA-GSH的循環(huán)速率，通過提高GSH循環(huán)系統(tǒng)還原態(tài)/氧化態(tài)比例來加快清除ROS效率。

3.5 谷胱甘肽和丁硫堇對(duì)鎘脅迫下辣椒幼苗ROS的影響

在非脅迫狀態(tài)下，植物細(xì)胞內(nèi)的O2·-和H2O2等ROS的產(chǎn)生和清除處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，而過多的鎘離子會(huì)打破該平衡狀態(tài)［29］。本研究結(jié)果表明，在鎘脅迫下，辣椒幼苗葉部和根部O2·-產(chǎn)生速率和H2O2含量均顯著升高，噴施GSH可有效清除辣椒體內(nèi)的ROS，而BSO則會(huì)加劇ROS的積累。結(jié)合上文的結(jié)果不難得出，鎘脅迫下辣椒體內(nèi)的抗氧化酶和非酶清除系統(tǒng)受到抑制，造成了體內(nèi)ROS的大量積累，而補(bǔ)充GSH則一方面可直接參與ROS的清除，另一方面可通過提高抗氧化酶系統(tǒng)和AsA-GSH循環(huán)系統(tǒng)的ROS清除效率，有效緩解鎘離子造成的細(xì)胞ROS脅迫效應(yīng)。

4 結(jié)論

本研究以在高濃度鎘脅迫下的晉椒503為試驗(yàn)材料，探究鎘脅迫下GSH和BSO對(duì)辣椒幼苗葉部和根部各項(xiàng)生理性指標(biāo)的影響。研究結(jié)果表明，高濃度鎘離子對(duì)辣椒的脅迫主要表現(xiàn)在抑制抗氧化酶和AsA-GSH循環(huán)關(guān)鍵酶活性而造成ROS過度積累，添加外源GSH一方面可直接清除ROS，另一方面可顯著提高POD、SOD、CAT、APX、GR、DHAR、MDHAR和GPX酶活性，提高GSH循環(huán)系統(tǒng)還原態(tài)/氧化態(tài)比例，兩個(gè)路徑共同作用降低了O2·-的產(chǎn)生速率和H2O2的含量，緩解了鎘對(duì)辣椒幼苗的正常生長和光合作用的抑制效應(yīng)；而添加GSH合成抑制劑BOS則會(huì)逆轉(zhuǎn)上述作用，從反面證明了GSH在辣椒響應(yīng)鎘脅迫的過程中起到重要作用。外源GSH雖然增加了辣椒幼苗鎘的總含量，但未對(duì)辣椒的各項(xiàng)生理指標(biāo)產(chǎn)生副作用，這可能是由于GSH與鎘離子形成了螯合肽，被轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外和液泡內(nèi)，降低了葉綠體內(nèi)和各個(gè)酶活動(dòng)區(qū)域的鎘離子濃度，從而緩解了鎘對(duì)于光合作用和ROS清除系統(tǒng)的抑制作用。而在噴施外源GSH和BSO的條件下，辣椒細(xì)胞內(nèi)重金屬螯合肽與活性鎘離子的具體變化情況還需要進(jìn)一步研究。