CRISPR-Cas系統(tǒng)在動(dòng)物及植物中不同的遞送方式研究進(jìn)展*

范杏飛 顧晶雯 顧曉燕 杜麗晶 蔣俊鋒 王 越

（海軍軍醫(yī)大學(xué)組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，上海 200433）

2020年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)授予了法國生物化學(xué)家埃瑪紐埃勒·沙爾龐捷和美國生物學(xué)家珍妮弗·道德納，以表彰她們對新一代基因編輯技術(shù)的突出貢獻(xiàn)。簇狀規(guī)律間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）及相關(guān)蛋白（CRISPR associated protein，Cas）系統(tǒng)，在自然界中被發(fā)現(xiàn)為微生物適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，目前已成為生物工程和基因組編輯的重要工具。CRISPRCas系統(tǒng)有3個(gè)分型，而CRISPR-Cas9系統(tǒng)為目前研究和應(yīng)用最多的。CRISPR-Cas9系統(tǒng)主要有Cas蛋白和單鏈導(dǎo)向RNA（single-stranded guide RNA，sgRNA）組成。當(dāng)Cas蛋白與sgRNA結(jié)合形成復(fù)合體后，Cas核酸酶構(gòu)象發(fā)生改變，產(chǎn)生一條通道，讓脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）更容易結(jié)合。復(fù)合體能夠識(shí)別原始間隔區(qū)相鄰基序（protospacer adjacent motif，PAM）位點(diǎn)導(dǎo)致DNA解旋，使sgRNA能夠找到PAM附近的互補(bǔ)序列，在Cas蛋白的作用下，使DNA降解。而當(dāng)sgRNA與靶DNA不互補(bǔ)時(shí)，Cas蛋白會(huì)被釋放出來，尋找新的PAM位點(diǎn)。DNA中的線性靶基因組斷裂后可通過非同源末端接合或者同源介導(dǎo)的修復(fù)來進(jìn)行修復(fù)，而非同源末端接合會(huì)引起插入或著刪除錯(cuò)誤，從而達(dá)到定點(diǎn)敲除某種基因的目的。CRISPR-Cas的發(fā)現(xiàn)徹底改變了基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，在醫(yī)療行業(yè)、生物制藥、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)等方面有著極其廣闊的前景。然而如何精準(zhǔn)高效將該系統(tǒng)遞送到待編輯的靶細(xì)胞，是該研究領(lǐng)域一個(gè)迫切需要解決的問題。本篇綜述將對目前動(dòng)植物中一些常用CRISPR-Cas輸送方法進(jìn)行詳細(xì)敘述，分析存在的問題，并對未來的努力方向提出展望。CRISPR-Cas酶、相關(guān)的引導(dǎo)RNA sgRNA和DNA修復(fù)模板必須精確進(jìn)入需要基因編輯的靶細(xì)胞才能發(fā)揮作用，達(dá)到預(yù)期目的。目前Cas9和sgRNA主要以Cas9的DNA、信使核糖核酸（messenger RNA，mRNA）或蛋白質(zhì)的形式與sgRNA一起遞送進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染Cas9的mRNA相較于DNA，mRNA不需要進(jìn)入細(xì)胞核再進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，可以較快速啟動(dòng)基因編輯，但mRNA的穩(wěn)定性相對較差，在載體設(shè)計(jì)方面必須保護(hù)mRNA免受胞外核酸酶的降解；蛋白質(zhì)形式主要與sgRNA形成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）的形式進(jìn)行基因編輯，且RNA的半衰期較短，以RNP形式遞送相對于輸送編碼Cas9 的DNA或mRNA可以減少發(fā)生脫靶突變的概率[1]。如今直接傳遞CRISPR-Cas9 RNP復(fù)合物的新策略在不斷涌現(xiàn)，如利用分子工程增強(qiáng)對特定類型細(xì)胞的靶向性[2]和提高細(xì)胞穿透效率[3]等。

1 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在動(dòng)物中的遞送

CRISPR-Cas9系統(tǒng)在動(dòng)物的基因相關(guān)疾病治療、優(yōu)良品種的孕育以及實(shí)驗(yàn)細(xì)胞動(dòng)物模型的建立等領(lǐng)域發(fā)揮重大作用，目前在動(dòng)物方面該系統(tǒng)組分的遞送方式有多樣的報(bào)道，現(xiàn)將常見遞送方式進(jìn)行總結(jié)（表1）。

表1 動(dòng)物中常見的遞送方式及主要特點(diǎn)

1.1 病毒載體

病毒載體具有高效、廣泛組織選擇性和臨床上有確定效果的優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在運(yùn)載能力有限、基因組整合、持續(xù)表達(dá)引起脫靶、免疫原性、高成本的問題，目前是實(shí)驗(yàn)室環(huán)境下細(xì)胞培養(yǎng)中實(shí)現(xiàn)Cas9表達(dá)的最流行的方法之一。病毒顆粒去除了負(fù)責(zé)復(fù)制的rep基因，并以感興趣的治療性轉(zhuǎn)基因來替代。處理后的病毒仍然能夠進(jìn)入宿主細(xì)胞并誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因的表達(dá)，但不再能夠自身復(fù)制或傳播到新的細(xì)胞。常用的病毒載體包括慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒（adenoassociated virus，AAV）。

1.1.1 慢病毒載體 慢病毒是由單鏈RNA組成的一種球狀病毒，裝載量約8 kb，具有不激活免疫系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)。但宿主基因組整合可能引起非預(yù)期位點(diǎn)的插入突變，限制了其作為載體的應(yīng)用。Tagliafierro等[4]利用慢病毒載體遞送CRISPR/dCas9-DNA甲基化系統(tǒng)從表觀遺傳學(xué)上調(diào)控SNCA基因的表達(dá)水平，為帕金森病的治療提供了基因?qū)用嫔系淖C據(jù)。

1.1.2 AAV載體 AAV載體從整體上降低了基因組整合的風(fēng)險(xiǎn)，且具有固有的組織趨向性和臨床上可管理的免疫原性，成為目前用于Cas9輸送的最常見病毒載體。此外，游離病毒基因組中編碼Cas9和sgRNA的反式基因的長期表達(dá)也有助于提高患者的基因組編輯效率，如Wang 等[5]報(bào)道基因治療杜興氏肌營養(yǎng)不良（Duchenne muscular dystrophy，DMD）和貝克爾肌營養(yǎng)不良（Becker's muscular dystrophy，BMD）。最近美國食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)使用AAV對脊髓性肌萎縮癥和先天性失明患者進(jìn)行基因替代治療，且臨床試驗(yàn)正在進(jìn)行[6]，但是使用AAV進(jìn)行CRISPR-Cas成分的治療輸送也存在很多問題。① AAVs基因組只有約4.7 kb，比其他病毒載體小且并不比編碼鏈球菌Cas9的基因（4.2 kb）大很多。因此插入一個(gè)正確的基因后，必須使用第2個(gè)AAV載體來編碼sgRNA和同源定向DNA修復(fù)模板。由于細(xì)胞必須同時(shí)獲得2種AAV載體才能達(dá)到相應(yīng)的效用，很大程度上降低了基因編輯的效率[7-8]。近期研究表明，一些更小的基因組編輯蛋白，如金黃色葡萄球菌或空腸彎曲桿菌的Cas9和其他一些新鑒定的CRISPR-Cas酶，可能會(huì)避免這個(gè)問題[9-12]。② 基因組編輯分子的長期表達(dá)可能使部分患者暴露于非預(yù)期的脫靶編輯或免疫反應(yīng)[13-14]。③目前規(guī)?；a(chǎn)AAV以及成本對臨床應(yīng)用仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)[15-17]。

1.2 納米顆粒

納米顆粒是一種人工制造的、小于100 nm的微型顆粒，具有強(qiáng)滲透性，可以選擇積累在不同的細(xì)胞和一定的細(xì)胞結(jié)構(gòu)中；通過一定的修飾后，可成為較理想的運(yùn)載工具；與其他載體相比，具有價(jià)格便宜，相對容易生產(chǎn)，不發(fā)生基因組整合和低免疫原性的優(yōu)勢，但納米顆粒的整體組織靶向能力相對較低。納米顆粒除可作為以病毒為基礎(chǔ)輸送Cas9和sgRNA的替代方法，還可以輸送DNA、mRNA或RNP形式的基因編輯組件。

1.2.1 脂質(zhì)介導(dǎo)的納米顆粒 脂質(zhì)介導(dǎo)的納米顆粒被用于將mRNA和sgRNA或預(yù)裝的RNP形式的CRISPR-Cas組分輸送到組織中[18-21]。帶陽離子的Cas9蛋白與高度陰離子性質(zhì)的sgRNA結(jié)合形成穩(wěn)定的陰離子性質(zhì)的RNP復(fù)合物后，被帶陽離子的脂質(zhì)納米顆粒包裹，通過內(nèi)吞作用或胞飲作用進(jìn)入細(xì)胞。這是一種相對簡單且低成本的CRISPR組分輸送方式[22]。Finn等[23]利用脂質(zhì)納米顆粒（lipid nanoparticle，LNP）介導(dǎo)的遞送系統(tǒng)，一次給藥顯著編輯小鼠肝中的運(yùn)甲狀腺素蛋白（transthyretin，Ttr）基因，進(jìn)而降低血清蛋白水平＞97%，且持續(xù)至少12個(gè)月，最終證明該LNP系統(tǒng)可以輸送CRISPR/Cas9組件，以實(shí)現(xiàn)臨床相關(guān)水平的體內(nèi)基因組編輯，但顯著的毒性及細(xì)胞攝取的非選擇性成為其最大的弊端[24]。

1.2.2 無機(jī)納米顆粒 無機(jī)納米顆粒是另一種常用的運(yùn)載工具，具有尺寸和表面性質(zhì)按預(yù)期目標(biāo)進(jìn)行調(diào)整的優(yōu)點(diǎn)。金和硫有內(nèi)在的親和力，使相關(guān)的含硫功能分子能夠偶聯(lián)至金納米顆粒表面，金納米顆粒因此成為極具吸引力的分子遞送材料。Ding 等[25]綜合報(bào)道了共價(jià)和非共價(jià)金納米顆粒結(jié)合物在基因傳遞中的應(yīng)用。Glass等[26]利用可以通過攜帶CRISPR組分的金納米顆粒糾正引起小鼠杜氏肌營養(yǎng)不良癥的DNA突變，且表現(xiàn)較小的脫靶效應(yīng)。Lee等[27]證明了由結(jié)合DNA并與陽離子內(nèi)體破壞性聚合物復(fù)合的金納米顆粒組成的遞送載體可以將Cas9核糖核蛋白和供體DNA遞送到多種類型細(xì)胞中，并可以通過局部注射有效糾正引起小鼠杜氏肌營養(yǎng)不良的DNA突變，脫靶DNA損傷效應(yīng)較小。目前進(jìn)行的研究正在持續(xù)推進(jìn)納米顆粒傳遞技術(shù)的進(jìn)展。

1.3 電穿孔

電穿孔是一種對細(xì)胞膜施加強(qiáng)電場的技術(shù)。電場暫時(shí)重構(gòu)細(xì)胞膜，使其滲透性和非選擇性更加突出，使原本會(huì)被細(xì)胞膜排斥的大生物分子通過細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞。電穿孔是目前Cas9-sgRNA體外傳遞到細(xì)胞的主要方法，且最近也有電穿孔法成功地用于Cas9在動(dòng)物受精卵中傳遞的報(bào)道[28，29]。Xu等[30]報(bào)道了利用電穿孔法直接輸送Cas9/gRNA到小鼠骨骼肌中用于DMD的治療。但電穿孔在體內(nèi)基因組編輯中應(yīng)用效用有限，不適用具體患者的治療。即使在細(xì)胞培養(yǎng)中，一些通常對電脈沖有反應(yīng)的細(xì)胞，如肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞，也可能會(huì)受到電穿孔引起的細(xì)胞表面電壓尖峰帶來的負(fù)面影響。電場若沒有被精細(xì)地調(diào)節(jié)，細(xì)胞膜生理可能發(fā)生不可逆的變化，影響細(xì)胞的長期生存能力。

1.4 修飾后直接遞送

蛋白質(zhì)和核酸可以直接進(jìn)行化學(xué)修飾，以達(dá)到不借助其他工具的遞送，如細(xì)胞穿透肽（cell penetrating peptides，CPPs）的應(yīng)用[31]。研究表明，將Cas9蛋白和gRNA與CPPs結(jié)合可以增強(qiáng)該蛋白的傳遞[24]。雖然Cas9蛋白與CPP結(jié)合可以解決細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)的問題，但它不能提供相應(yīng)的保護(hù)來防止蛋白酶的降解作用，且CPPs不能提供Cas9蛋白對不同細(xì)胞的特異靶向運(yùn)輸。因此，CPPs的成功使用可能還需要與其他遞送技術(shù)相結(jié)合。Cas9需要到達(dá)細(xì)胞核去發(fā)揮作用，因此Cas9必須包括一個(gè)核定位序列（nuclear localization sequence，NLS），可以選擇在傳遞前合成NLS，或?qū)LS直接編碼到DNA或mRNA Cas9結(jié)構(gòu)中。

1.5 顯微注射

通過顯微注射將CRISPR組分遞送到細(xì)胞中的效率可以高達(dá)100%[32]，通過顯微鏡和直徑為0.5～5.0 mm的針頭，刺穿細(xì)胞膜，將各組分直接運(yùn)送到細(xì)胞內(nèi)的目標(biāo)部位，繞過細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)的屏障；同時(shí)顯微注射不受組分分子量的限制，而這是病毒載體遞送系統(tǒng)的重要限制因素。Chuang等通過將Cas9和sgRNA的DNA顯微注射到細(xì)胞核，利用靶細(xì)胞轉(zhuǎn)錄和翻譯獲得相應(yīng)組分[33]；而Raveux等通過顯微注射將CRISPR的mRNA組分注射到細(xì)胞質(zhì)，直接被細(xì)胞翻譯。此外，顯微注射也是制作動(dòng)物模型的常用方法，有證據(jù)表明將Cas9和sgRNA注射到合子細(xì)胞質(zhì)中是產(chǎn)生含有所需修飾的正常胚胎和足月小鼠幼崽的最有效方法[32]。

2 CRISPR-Cas9系統(tǒng)在植物中的遞送

植物轉(zhuǎn)化所依賴的2種廣泛使用的傳遞方法—生物轟擊法和農(nóng)桿菌介導(dǎo)傳遞法都有局限性。生物轟擊可以通過機(jī)械力將遺傳物質(zhì)通過堅(jiān)硬的細(xì)胞壁傳遞，但效率低，會(huì)破壞基因組序列。農(nóng)桿菌可以侵染多種植物，但不可避免外源DNA的整合，其轉(zhuǎn)化效率受到受體基因型的很大影響，尤其是單子葉植物[34]。此外，這些傳統(tǒng)方法都不能避免冗長的組織培養(yǎng)程序。因此，迫切需要新的遞送策略?，F(xiàn)對目前出現(xiàn)的優(yōu)化策略敘述如下（表2）。

表2 植物中常見的遞送方式及主要特點(diǎn)

2.1 新生分生組織誘導(dǎo)

形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)因子的再生促進(jìn)活性正成為CRISPRCas9介導(dǎo)的植物基因編輯的有力工具。形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)劑還可以被設(shè)計(jì)用于誘導(dǎo)植物上的新生分生組織，從而完全規(guī)避組織培養(yǎng)的需要。最近，通過將攜帶形態(tài)發(fā)生調(diào)節(jié)因子WUS2、IPT、STM和sgRNA盒的根癌土壤桿菌注射到過表達(dá)Cas9的本氏煙草中已去除分生組織的修剪位點(diǎn)上，直接從所得芽中獲得基因編輯的植物，并且誘導(dǎo)的突變是可遺傳的[35]。該方法也同樣用于馬鈴薯、番茄和葡萄等。

2.2 病毒輔助的基因編輯

利用植物病毒是一種很有希望獲得基因編輯植物而不需要組織培養(yǎng)的方法。近年來，正義單鏈RNA病毒包括煙草響尾蛇病毒[36]、大麥條花葉病毒[37]、狐尾草花葉病毒[38]等已被用于植物中sgRNA的遞送，編輯效率可高達(dá)80%。但由于有限的運(yùn)載能力，Cas9在這些病毒中不能與sgRNA共編碼，因此就需要預(yù)先存在的Cas9過表達(dá)的植物系。有研究同時(shí)將Cas9和sgRNA盒插入大麥黃色條紋花葉病毒[39]和苦苣菜黃網(wǎng)彈狀病毒[40]的基因組中，2種具有優(yōu)良基因組穩(wěn)定性和傳遞能力的負(fù)義單鏈RNA病毒，實(shí)現(xiàn)了對野生型本薩姆豬籠草的系統(tǒng)基因編輯。最近研究將sgRNAs與RNA移動(dòng)元件融合，將它們引入煙草搖鈴病毒RNA2中，在農(nóng)桿菌介導(dǎo)的植物體細(xì)胞浸潤后，這些可移動(dòng)元件將其導(dǎo)向莖尖分生組織細(xì)胞，從而在后代中誘導(dǎo)可遺傳突變，其效率可高達(dá)100%，克服了病毒誘導(dǎo)的突變不能傳遞給下一代的障礙[41]。

2.3 通過單倍體誘導(dǎo)劑進(jìn)行基因編輯

在一些作物中，基因轉(zhuǎn)化仍然局限于特定的基因型。為了解決這個(gè)問題，最近開發(fā)了2種遞送系統(tǒng)，分別稱為“單倍體誘導(dǎo)編輯”[42]和“單倍體誘導(dǎo)物介導(dǎo)的基因組編輯”[43]。在這2種策略中，優(yōu)良玉米系均由具有CRISPR-Cas系統(tǒng)的單倍體誘導(dǎo)系授粉。受精后，來自單倍體誘導(dǎo)物系的父本基因組在母本基因組中誘導(dǎo)突變，隨后從合子中消除，從而生成具有母本背景的基因編輯的玉米單倍體。經(jīng)過編輯的單倍體系的染色體可以自然地翻倍，或者人工地用有絲分裂抑制劑對其進(jìn)行處理，這些方法不僅巧妙地繞過了難以克服的轉(zhuǎn)化問題，而且還可以產(chǎn)生純合無轉(zhuǎn)基因的基因編輯植株。

CRISPR-Cas系統(tǒng)無論在動(dòng)物還是植物領(lǐng)域都有著廣闊的應(yīng)用前景，但CRISPR-Cas技術(shù)的作用發(fā)揮完全依賴于Cas酶和gRNA正確進(jìn)入靶細(xì)胞，因此必須注意針對特定目標(biāo)調(diào)整遞送方式，這在面對更為復(fù)雜的CRISPR應(yīng)用，顯得更為重要，因其往往需要同時(shí)遞送多個(gè)功能實(shí)體。探尋能夠持續(xù)實(shí)現(xiàn)更高效率、更高特異性和更低毒性的新型遞送載體和材料，提高CRISPR的預(yù)期效果，達(dá)到實(shí)際應(yīng)用水準(zhǔn)，未來仍需要付出巨大的努力。