潛在生物標(biāo)記物NRG2在前列腺癌中的診斷和預(yù)后的作用

柳興源，魏國華，李菁媛

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，2.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 錦州 121000)

前列腺癌(prostate adenocarcinoma，PRAD)作為美國和歐洲男性癌癥死亡的第二大原因，影響著全世界數(shù)以百萬計(jì)的男性，全球每年有超過110萬例新診斷病例和30萬例死亡，近年來我國前列腺癌的發(fā)病率和死亡率都在迅速上升，它的風(fēng)險(xiǎn)因素包含家族病史、種族、年齡、遺傳因素及飲食因素等[1]，被診斷為轉(zhuǎn)移性前列腺癌的患者的存活率僅為29.8%[2]。根據(jù)多個(gè)臨床病理特征，如年齡、腫瘤大小、腫瘤侵犯的范圍(分期)、癌細(xì)胞惡性程度(依據(jù)Gleason score評(píng)分法)、血中PSA濃度、微血管侵犯、血栓形成和微衛(wèi)星區(qū)域的存在，研究者已經(jīng)嘗試了多種方法推斷前列腺癌的發(fā)生和轉(zhuǎn)歸[3]。然而，具有相同臨床病理特征的前列腺癌患者往往表現(xiàn)出不同的預(yù)后[4]，提示可能有多個(gè)復(fù)雜的分子和細(xì)胞事件參與了前列腺癌的發(fā)生和侵襲性進(jìn)展。由于缺乏早期診斷特異性生物標(biāo)志物，確診的患者大多處于晚期，生存率較低。但隨著高通量技術(shù)的迅猛發(fā)展，當(dāng)前研究者可以獲得人類癌癥基因組學(xué)相關(guān)的豐富信息。利用公開的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的微陣列集通過生物信息學(xué)綜合分析揭示腫瘤的特定生物標(biāo)記物和治療靶點(diǎn)特異性標(biāo)志物和預(yù)測(cè)生化復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險(xiǎn)因素、闡明腫瘤進(jìn)展的分子機(jī)制、識(shí)別區(qū)分前列腺癌發(fā)展的不同階段的關(guān)鍵標(biāo)志物，對(duì)于改進(jìn)治療策略至關(guān)重要[5]。

本研究從現(xiàn)有的腫瘤數(shù)據(jù)集合中收集基于臨床特征的差異表達(dá)或遺傳變異的重要基因和蛋白，進(jìn)行生存分析的驗(yàn)證和基因表達(dá)趨勢(shì)穩(wěn)定性驗(yàn)證得到候選基因，構(gòu)建了相關(guān)基因蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行了富集注釋，而后qRT-PCR實(shí)驗(yàn)在前列腺癌患者和正常男性志愿者血漿中進(jìn)行候選腫瘤標(biāo)志物的mRNA的差異表達(dá)特異性和診斷敏感性驗(yàn)證，以篩選前列腺癌中的可用于診斷和預(yù)后的潛在生物標(biāo)記物。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 表達(dá)譜的獲取和差異表達(dá)基因的篩選

選擇存儲(chǔ)在GEO中的數(shù)據(jù)集GSE74685前列腺癌基因表達(dá)譜，包含來自63個(gè)患者的176個(gè)原發(fā)、轉(zhuǎn)移前列腺癌樣本以及逐個(gè)個(gè)體的匹配的良性組織樣本[6]。通過R軟件limma包，截?cái)嘀翟O(shè)置為P<0.05和[log(foldchange)]>1.5，使用差異標(biāo)準(zhǔn)化讀取計(jì)數(shù)和無監(jiān)督的分層聚類選擇了100個(gè)差異表達(dá)最高的基因作為候選基因，并對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。

1.1.2 候選基因的生存分析和表達(dá)穩(wěn)定性驗(yàn)證

GEPIA是一種包含32種癌癥類型、9736個(gè)腫瘤樣本的數(shù)據(jù)的用于分析核酸測(cè)序表達(dá)數(shù)據(jù)的工具?；赥CGA提供的總體生存數(shù)據(jù)，與患者生存率顯著相關(guān)的基因通過LogRankP值被計(jì)算出來并顯示生存曲線。同時(shí)驗(yàn)證已篩選出的候選基因在前列腺癌和正常組織中的表達(dá)狀況，結(jié)果以柱狀圖的形式展示。

1.1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和富集分析

將確定的候選基因?qū)隨TRING數(shù)據(jù)庫，獲得PPI網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行可視化。使用Gene Ontology數(shù)據(jù)庫對(duì)相關(guān)蛋白進(jìn)行GO分析和通路富集分析，使用Fisher’s精確檢驗(yàn)，將判定條件設(shè)置為錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率(false discovery rate，F(xiàn)DR)P<0.05。

1.1.4 患者和樣本

選取2019年1月至2020年8月期間，在錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院間接受手術(shù)的214個(gè)前列腺癌患者，手術(shù)前患者未接受過放療或化療。由錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院兩名以上經(jīng)驗(yàn)豐富診斷醫(yī)生根據(jù)泌尿系統(tǒng)及男性生殖器官腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)(WHO腫瘤分類2016)進(jìn)行系統(tǒng)準(zhǔn)確診斷和分級(jí)分期。214例前列腺癌患者術(shù)前取外周血3 mL，分離血漿。按照年齡和性別匹配的標(biāo)準(zhǔn)從161名健康男性志愿者身上采集了新鮮的正常血漿樣本。所有外周血樣均采用乙二胺四乙酸(EDTA)作為抗凝劑。招募前獲得每個(gè)患者的書面知情同意，所有涉及人類受試者的研究進(jìn)過錦州醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 qRT-PCR檢測(cè)

用TRIzol試劑從血漿中提取總RNA，進(jìn)行RNA提取、逆轉(zhuǎn)錄和實(shí)時(shí)熒光定量PCR。所有的cDNA都是按照制造商的說明用SuperScript III First-strand Synthesis System(Invitrogen，18080-051)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，并使用Power SYBR Green PCR Master Mix進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。NRG2引物序列為：正向：5’-tttccagatgtccataggttac-3’，反向：5’-ttttggctgagctcactcacat-3’；使用GAPDH作為對(duì)照，引物序列為5’-tcgacagtcagccgcatcttcttt-3’和5’-accaaatccgttgactccgacctt-3’。按照廠商說明在OpenArray?(Life Technologies)平臺(tái)上采用定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)測(cè)量了mRNA的表達(dá)水平，分析相關(guān)表達(dá)數(shù)據(jù)，并且歸一化。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

qRT-PCR檢測(cè)mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析比較采用t檢驗(yàn)。建立受試者工作特征(ROC)曲線評(píng)價(jià)其診斷價(jià)值。使用Graphpad Prism 8.0.2軟件進(jìn)行所有統(tǒng)計(jì)分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌候選生物標(biāo)記物的篩選

本研究分析來自NCBI GEO服務(wù)器中的GSE74685前列腺癌基因表達(dá)譜，確定了100個(gè)差異表達(dá)最大的候選基因(50個(gè)上調(diào)的候選基因和50個(gè)下調(diào)的候選基因)，結(jié)果以熱圖的形式顯示，紅色表示上調(diào)，藍(lán)色表示下調(diào)，見圖1。

2.2 候選基因表達(dá)驗(yàn)證和生存分析

對(duì)來自TCGA前列腺癌數(shù)據(jù)基因表達(dá)譜差異表達(dá)TOP100候選基因進(jìn)行生存分析驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，在前列腺癌患者(n=502)中PLK1、PAQR6和NRG2這3個(gè)候選基因與總生存期相關(guān)。以中位數(shù)為截?cái)鄻?biāo)準(zhǔn)，生存曲線顯示，PLK1和PAQR6高表達(dá)的前列腺癌患者與低表達(dá)前列腺癌患者相比，總生存期縮短；NRG2高表達(dá)的前列腺癌患者與低表達(dá)前列腺癌患者相比，總生存期延長(LogRankP<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)。PLK1，PAQR6和NRG2在前列腺癌不同數(shù)據(jù)集合的表達(dá)穩(wěn)定程度，見圖2，使用GEPIA驗(yàn)證得到箱式圖顯示，NRG2在前列腺癌組織中穩(wěn)定低表達(dá)(與對(duì)照組相比，*P<0.05)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和富集分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫，為NRG2相關(guān)基因模塊中的構(gòu)建了蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)，圖3。NRG2相關(guān)基因模塊在生物進(jìn)程與調(diào)節(jié)表皮生長因子激活的受體活性(GO：0045741)，跨膜受體蛋白酪氨酸激酶活性的激活(GO：0007171)，正向調(diào)節(jié)表皮生長因子激活的受體活性(GO：0007176)等過程有關(guān)；在細(xì)胞組分富集在ERBB3：ERBB2復(fù)合物(GO：0038143)，凝結(jié)素包裹的內(nèi)細(xì)胞囊泡膜(GO：0030669)，凝結(jié)素包裹的內(nèi)細(xì)胞囊泡(GO：0045334)部位；在分子功能主要參與ERBB-3類受體結(jié)合(GO：0043125)，跨膜受體蛋白酪氨酸激酶激活劑活性(GO：0030297)，表皮生長因子受體結(jié)合(GO：0005154)等功能。通路分析顯示EGF受體信號(hào)通路(P00018)，鈣粘蛋白信號(hào)通路(P00012)等相關(guān)，見表1。

圖1 前列腺癌數(shù)據(jù)集合GSE74685得到差異表達(dá)基因

A，D：PLK1；B，E：PAQR6；C，F(xiàn)：NRG2

圖3 STRING數(shù)據(jù)庫構(gòu)建NRG2相關(guān)基因PPI網(wǎng)絡(luò)

2.4 qRT-PCR檢測(cè)

qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)NRG2的mRNA在前列腺癌患者血漿中表達(dá)低于正常男性志愿者血漿的表達(dá)(與對(duì)照組相比，***P<0.001)。采用ROC曲線評(píng)價(jià)NRG2的潛在診斷價(jià)值，ROC曲線下面積(AUC)值為0.9657，P<0.001，見圖4。

表1 NRG2相關(guān)基因模塊富集分析

圖4 qRT-PCR定量檢測(cè)前列腺癌患者與健康男性血漿中NRG2的mRNA的相對(duì)表達(dá)量和NRG2在前列腺癌中受試者工作特征(ROC)曲線診斷效能分析

3 討 論

早期發(fā)現(xiàn)和疾病進(jìn)展檢測(cè)仍然是治療前列腺癌的有效方法。由于現(xiàn)有的生物標(biāo)記物如血清新喋呤和Ki67等缺乏足夠的特異性，目前還沒有一種準(zhǔn)確預(yù)測(cè)前列腺癌預(yù)后的方法，因此迫切需要新的前列腺癌的診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的標(biāo)記物[7]。在我們的研究中，對(duì)公開基因芯片數(shù)據(jù)進(jìn)行篩選得到候選基因，其中PLK1、PAQR6和NRG2等3個(gè)候選基因與總生存期相關(guān)，只有NRG2與之前研究一致且具穩(wěn)定，NRG2蛋白相互作用模塊的網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建對(duì)理解相互作用和后續(xù)研究提供了線索和方向。

NRG2作為ErbB蛋白家族中的成員，在各種成人組織中均有表達(dá)，包括腦、前列腺、腎臟等，被認(rèn)為在涉及神經(jīng)發(fā)生和調(diào)節(jié)的多種人類疾病中起重要的作用[8]。NRG2蛋白水解后釋放胞外結(jié)構(gòu)域通過與ERBB受體家族的相互作用，誘導(dǎo)上皮細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞和其他類型細(xì)胞的生長和分化，作用于組織中的不同位點(diǎn)并在細(xì)胞中引發(fā)不同的生物反應(yīng)來介導(dǎo)不同的生物學(xué)過程。通路富集分析顯示NRG2相關(guān)基因模塊與EGF受體信號(hào)通路，鈣粘蛋白信號(hào)通路等相關(guān)。在前列腺癌患者群中，檢測(cè)EGFR表達(dá)可能對(duì)確定預(yù)后有理論意義[9]，通過靶向EGFR途徑阻斷癌癥轉(zhuǎn)移的新的治療潛力，聯(lián)合使用EGFR可能提高當(dāng)前診斷和預(yù)后準(zhǔn)確性和療效，從而控制腫瘤發(fā)展到致命的狀態(tài)[10]。鈣黏蛋白在前列腺癌發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用，E-cadherin有望成為侵襲性前列腺癌的預(yù)后因子[11]，并且與根治術(shù)后生化復(fù)發(fā)存在密切聯(lián)系[12]。這些都與本研究的結(jié)果一致。

qRT-PCR檢測(cè)說明NRG2具有成為前列腺癌早期診斷和預(yù)后預(yù)測(cè)的穩(wěn)定生物標(biāo)記物的潛力；ROC曲線AUC值越大，說明用于診斷潛在價(jià)值越高。發(fā)現(xiàn)在血漿中有研究篩選了6個(gè)對(duì)前列腺癌術(shù)后的生化復(fù)發(fā)具有較強(qiáng)預(yù)測(cè)作用的標(biāo)記基因，其中包括NRG2，與本研究具有一致性[13]。Wouter R. Karthaus等利用單細(xì)胞RNA測(cè)序在mRNA水平上檢測(cè)到配體表達(dá)的最大變化是NRG2，論證出在器官和小鼠中雄激素驅(qū)動(dòng)生長因子NRG2表達(dá)后，通過間充質(zhì)細(xì)胞以旁分泌方式作用于腔細(xì)胞而驅(qū)動(dòng)前列腺再生的結(jié)論[14]，這也支持了我們的研究。在腫瘤研究領(lǐng)域，NRG2的差異甲基化CpG島與石棉接觸者肺癌組織致癌作用存在顯著相關(guān)性[15]。不僅如此NRG2因其在精神障礙相關(guān)行為的神經(jīng)發(fā)生和調(diào)節(jié)的作用而受到越來越多的關(guān)注。

本研究存在幾個(gè)限制因素：首先，所有臨床研究病例均來自一家醫(yī)院并且樣本數(shù)量較小，因此需要以后進(jìn)行長時(shí)程、多中心、大樣本量的研究驗(yàn)證。其次，本研究從大數(shù)據(jù)分析和臨床血漿樣本中得出的結(jié)論，NRG2調(diào)節(jié)前列腺癌增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的詳細(xì)分子機(jī)制還有待進(jìn)一步動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)研究和驗(yàn)證。

本研究發(fā)現(xiàn)了NRG2在前列腺癌中表達(dá)下調(diào)，并可能作為一種新的前列腺癌診斷和預(yù)后的生物標(biāo)記物，并且參與調(diào)節(jié)前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展。這對(duì)腫瘤作用機(jī)制深入的理解、基因數(shù)據(jù)精準(zhǔn)挖掘、新抗原預(yù)測(cè)優(yōu)化算法以及前列腺癌精準(zhǔn)免疫治療的應(yīng)用起到積極的作用。