一例豬鏈球菌與豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌混合感染的診治報(bào)告

陸 闊，程家園，張垚垚，王嘉珍，李 郁

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，安徽 合肥 230036）

豬鏈球菌病是由豬鏈球菌（Streptococcus suis,SS）引起的一種重要的人畜共患傳染病。臨床上主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)膿腫、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎及敗血癥等癥狀。目前，SS根據(jù)莢膜多糖抗原特性的不同可分為35種血清型，其中1、2、7、9型通常被認(rèn)為是優(yōu)勢血清型，分布廣泛并且致病性較強(qiáng)。SS屬于豬體內(nèi)的常在菌之一，可原發(fā)或繼發(fā)致病，是威脅養(yǎng)豬業(yè)的主要細(xì)菌性病原。

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine infectious pleuropneumonia）是由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuropneumoniae, APP）引起的以急性出血和慢性纖維素性壞死性胸膜炎病變?yōu)橹饕卣鞯呢i呼吸道傳染病，病豬和亞臨床感染帶毒豬是本病的主要傳染源。APP是一種條件性致病菌，常存在于健康豬的扁桃體和上呼吸道，可通過豬之間的直接接觸或短距離飛沫傳播，既能單獨(dú)引起感染，也能與其他病原混合感染。

SS和APP是導(dǎo)致豬呼吸道病綜合征（Porcine respiratory disease complex, PRDC）的主要病原菌，常造成生豬的急性死亡，給養(yǎng)豬場造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來豬病的混合感染呈現(xiàn)升高趨勢，僅通過臨床癥狀和病理變化難以確診，還需要依靠微生物學(xué)檢測方法和分子生物學(xué)技術(shù)進(jìn)行鑒定。文章系對由SS、APP混合感染所致某集團(tuán)公司豬場保育豬發(fā)病進(jìn)行診治，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 發(fā)病情況及病理變化

2021年10月中旬，某集團(tuán)公司豬場陸續(xù)有保育豬群出現(xiàn)不明原因死亡病例，病豬表現(xiàn)出皮膚發(fā)紺、突然癱瘓和急性死亡等癥狀，豬群曾免疫豬繁殖與呼吸綜合征疫苗，發(fā)病豬只曾使用慶大霉素、磺胺類和頭孢類藥物治療。

對10月17日送檢至安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動物傳染病研究室的2頭35日齡發(fā)病豬（分別編為1號、2號）心臟、肺臟、脾臟、肝臟、下頜淋巴結(jié)、腹股溝淺淋巴結(jié)進(jìn)行病理變化觀察。1號豬心冠脂肪部分膠凍樣變；肺臟充血、水腫；脾臟淤血；肝臟質(zhì)脆、淤血，邊緣有出血性梗死灶；下頜淋巴結(jié)出血；腹股溝淺淋巴結(jié)腫大、出血，切面濕潤多汁。2號豬心臟無明顯病理變化；肺臟淤血，表面有白色壞死灶；脾臟充血；肝臟質(zhì)脆、黃染，表面有出血點(diǎn)；下頜淋巴結(jié)腫大；腹股溝淺淋巴結(jié)腫大，切面隆起呈灰白色。

1.2 主要材料

0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基（MAC）均購自紹興天恒生物科技有限公司；新生小牛血清均購自北京索萊寶科技有限公司；瓊脂糖、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×TaqPCR MasterMix、DL 2 000 DNA Marker均購自天根生化科技有限公司；抗生素藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司；微量DNA提取試劑盒購自O(shè)mega Bio-Tek公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司；豬瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）通用型實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測試劑盒和非洲豬瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）熒光PCR檢測試劑盒均購自哈爾濱元亨生物藥業(yè)有限公司；所用引物均由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)室檢測

1.3.1 細(xì)菌和病毒組織核酸檢測 將病豬下頜淋巴結(jié)、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腹股溝淺淋巴結(jié)組織混合后研磨取上清液，分別用微量DNA提取試劑盒和病毒DNA/RNA提取試劑盒提取上清液中核酸作為模板。通過PCR方法檢測6種細(xì)菌核酸和2種病毒核酸（引物見表1），包括SS、APP、豬丹毒絲菌（Erysipelothrix rhusiopathiae,ER）、副豬嗜血桿菌（Haemophilus parasuis,HPS）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida,Pm）、沙門氏菌（Salmonella）、豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2, PCV2）和豬偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus, PRV）。通過實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法檢測CSFV、PRRSV核酸，實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測ASFV核酸，按照檢測試劑盒說明書操作。

表1 SS、ER、HPS、APP、Pm、Salmonella、PCV2、PRV引物序列

1.3.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察 無菌采集2頭病豬下頜淋巴結(jié)、心臟、肺臟、肝臟、脾臟、腹股溝淺淋巴結(jié)，劃線接種于5%兔血瓊脂培養(yǎng)基、MAC、TSA培養(yǎng)基（含5%小牛血清和1.5%NAD），采用需氧、厭氧和微需氧3種培養(yǎng)方式，置于37 ℃培養(yǎng)24 h。挑取單一菌落進(jìn)行革蘭氏染色，鏡檢，觀察分離菌的菌體形態(tài)特征。

1.3.3 分離菌PCR鑒定 煮沸法提取細(xì)菌核酸，通過PCR方法檢測6種細(xì)菌核酸，包括SS、ER、HPS、APP、Pm和Salmonella。所用引物序列同1.3.1。

1.3.4 分離菌血清型鑒定 參考文獻(xiàn)[1]，設(shè)計(jì)SS特異的cps基因引物，通過PCR方法確定菌株的血清型。分型引物見表2。

表2 SS血清型分型PCR引物

1.3.5 藥物敏感性試驗(yàn) 參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會（Clinical Laboratory Standards Institute,CLSI, 2016）推薦的方法，采用Kirby-Bauer紙片瓊脂擴(kuò)散法測定分離株對18種藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌和病毒組織核酸檢測結(jié)果

通過PCR及實(shí)時(shí)熒光RT-PCR方法檢測病原核酸，結(jié)果顯示，1號豬病料組織核酸檢測為SS、APP陽性，2號豬病料組織核酸檢測為SS陽性，見圖1。HPS、Pm、ER、Salmonella、PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、ASFV核酸檢測均為陰性。

圖1 病原核酸檢測結(jié)果

2.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)及形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

自1號豬的心臟、肝臟、腹股溝淺淋巴結(jié)和2號豬的心臟各分離出1株可疑菌。分離菌在TSA培養(yǎng)基（含5%小牛血清和1.5%NAD）上呈灰白色半透明、表面光滑、邊緣整齊針尖狀菌落，在5%兔血瓊脂培養(yǎng)基上呈灰白色、表面光滑、邊緣整齊小菌落，呈β溶血。革蘭氏染色結(jié)果均陽性，呈球形或卵圓形，鏈狀排列。初步推斷，分離菌為SS。見圖2。

圖2 分離菌的菌落形態(tài)及革蘭氏染色鏡檢形態(tài)

2.3 分離菌PCR鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，擴(kuò)增出688 bp大小的預(yù)期目的條帶，表明4株分離菌均為SS。見圖3。

圖3 分離菌PCR鑒定結(jié)果

2.4 分離菌血清型鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，自1號病料的心臟、肝臟、腹股溝淺淋巴結(jié)分離的3株SS擴(kuò)增出368 bp大小的預(yù)期目的條帶，為SS9；自2號病料的心臟分離的1株SS擴(kuò)增出633 bp大小的預(yù)期目的條帶，為SS10。見圖4。

圖4 分離菌血清型鑒定結(jié)果

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果顯示，4株SS對復(fù)方新諾明、青霉素、紅霉素、甲氧芐胺嘧啶、頭孢曲松、慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素、多黏菌素B、頭孢噻肟耐藥率為100%；對氧氟沙星、氟苯尼考、林可霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、多西環(huán)素耐藥率為75%，對阿莫西林和新霉素耐藥率為50%。見表3。

表3 4株SS分離株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在現(xiàn)代集約化養(yǎng)殖中，隨著養(yǎng)殖規(guī)模和地域范圍的不斷擴(kuò)大，疾病的復(fù)雜程度也在發(fā)生著變化，混合感染或繼發(fā)感染越來越嚴(yán)重，防治更為困難。在本病例中，PCV2、PRV、CSFV、PRRSV、ASFV 5種病毒核酸檢測結(jié)果均為陰性，1號豬病料組織細(xì)菌核酸檢測為SS、APP陽性，2號豬為SS陽性，提示細(xì)菌感染是引起該場豬群發(fā)病的主要原因。但在2頭病豬組織中只分離到SS，未分離到APP，究其原因，一方面可能是因?yàn)椴∝i曾使用過慶大霉素、磺胺類和頭孢類藥物，將APP有效抑制或殺滅；另一方面可能與病料采集時(shí)間、病料組織運(yùn)輸或保存不當(dāng)?shù)纫蛩孛芮邢嚓P(guān)。

長期以來，由于抗生素的不合理使用，使SS耐藥菌株逐年增加，不僅出現(xiàn)了較高的耐藥性，且多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重。焦安心[2]對196株SS安徽分離株進(jìn)行藥物敏感性分析，結(jié)果顯示，分離株對復(fù)方新諾明、四環(huán)素、阿奇霉素、鏈霉素、強(qiáng)力霉素、慶大霉素、磺胺甲基異唑耐藥率均達(dá)85.0%以上。彭凌等[3]對3株SS廣東分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，分離株對多西環(huán)素、阿莫西林、林可霉素、克林霉素、四環(huán)素等21種藥物耐藥率為100%，對頭孢氨芐、頭孢拉定、先鋒Ⅴ、左氟沙星敏感。王治方等[4]對68株SS河南分離株進(jìn)行耐藥性研究，結(jié)果表明，分離株對四環(huán)素類藥物耐藥性最強(qiáng)，其中土霉素、強(qiáng)力霉素、四環(huán)素耐藥率高達(dá)100%，對頭孢噻呋、頭孢他啶、阿莫西林和氨芐西林敏感性較好。而本病例中4株SS分離株對18種抗菌藥物表現(xiàn)出不同程度的耐受，其中對復(fù)方新諾明、青霉素、紅霉素、甲氧芐胺嘧啶、頭孢曲松、慶大霉素、四環(huán)素、鏈霉素、多黏菌素B、頭孢噻肟的耐藥率為100%，對氧氟沙星、氟苯尼考、林可霉素、環(huán)丙沙星、卡那霉素、多西環(huán)素的耐藥率為75%，對阿莫西林和新霉素的耐藥率也達(dá)50%。這充分表明不同地區(qū)SS分離株對抗菌藥物的敏感性存在差異，即使是同一地區(qū)甚至同一豬場不同時(shí)間段，SS分離株的耐藥性也不盡相同。隨著抗生素的使用，SS分離株的不同耐藥趨勢將會日益明顯。因此，豬場應(yīng)及時(shí)做好病原學(xué)診斷及敏感藥物篩選，根據(jù)篩選出的敏感藥物，針對性地治療病原菌感染，從而減少盲目用藥、降低細(xì)菌耐藥性，達(dá)到有效防治豬病的目的。細(xì)菌性疾病控制和預(yù)防的一般思路就是依靠抗生素的使用，但在飼料端“禁抗”，養(yǎng)殖端“減抗、限抗”的新形勢新要求下，通過疫苗來防治細(xì)菌性疾病所帶來的優(yōu)勢逐漸顯現(xiàn)。

SS血清型眾多，目前從病豬體內(nèi)分離出的SS血清型主要為SS1、SS2、SS7和SS9。近年來，SS9的分離率和流行率持續(xù)增加[5]。本病例中，共分離出3株SS9和1株SS10，說明該豬場同時(shí)存在多種血清型SS感染，針對流行菌株血清型研制菌苗是控制SS感染的有效措施。目前，國內(nèi)市場豬鏈球菌病商品化滅活疫苗主要以SS2為主，即：豬鏈球菌病滅活疫苗（2型，HA9801株）、豬鏈球菌病+副豬嗜血桿菌病二聯(lián)滅活疫苗（LT株+MD0322株+SH0165株）、豬鏈球菌病蜂膠滅活疫苗（SEZ+SS2）、豬鏈球菌病滅活疫苗（SEZ+SS2）、豬鏈球菌病滅活疫苗（SEZ+SS2+SS7）[6]。但已有不少研究表明SS流行血清型呈現(xiàn)出多樣性，在臨床實(shí)踐中如SS4、SS12、SS14、SS31等血清型已被檢測分離到，且有些菌株已被證明有較強(qiáng)致病性[7-8]。因此，對于除SS2外其它流行血清型疫苗的研制顯得尤為重要。滅活疫苗因其具有良好的免疫原性，易于制備多價(jià)苗或聯(lián)苗而適用于生產(chǎn)實(shí)際。這也提示豬場可通過篩選臨床流行的優(yōu)勢菌株作為疫苗候選株，研制多價(jià)滅活疫苗，使不同血清型之間產(chǎn)生交叉保護(hù)，可達(dá)到一針多防的效果。

混合感染和疾病的發(fā)生不是一蹴而就的，豬病混合感染主要有發(fā)病前不同帶毒豬間的相互感染和發(fā)病后的繼發(fā)感染，這兩種形式均會導(dǎo)致2種病原以上的混合感染。在非洲豬瘟流行的背景下，豬場應(yīng)通過敏感藥物、疫苗預(yù)防以及重視生物安全等多方面相結(jié)合的手段進(jìn)行嚴(yán)格把控[9]。對于該豬場SS、APP混合感染的情況，建議定期開展細(xì)菌病流行病學(xué)調(diào)查及耐藥情況調(diào)查，以指導(dǎo)臨床合理用藥；結(jié)合生產(chǎn)情況制定科學(xué)的免疫計(jì)劃及免疫程序，定期開展抗體水平的監(jiān)測，選擇恰當(dāng)?shù)臅r(shí)間注射合適的疫苗；對病死豬及廢棄物做好無害化處理，將發(fā)病豬進(jìn)行緊急隔離，發(fā)病豬舍場區(qū)進(jìn)行嚴(yán)格消毒；同時(shí)做好健康豬群的飼養(yǎng)管理，以增強(qiáng)健康豬的免疫力。