豬胸膜肺炎放線桿菌血清15型的分離鑒定與藥敏試驗

李 國，張垚垚，王嘉珍，李 郁

（安徽農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，安徽 合肥 230036）

豬傳染性胸膜肺炎（Porcine contagious pleuropneumoniae, PCP）是由豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobczcillus pleuropeumonicze, APP）引起的豬高度致死性呼吸道傳染病，主要臨診特征為肺出血、壞死和纖維素性滲出。PCP傳染性強，任何生長階段的豬均有易感性，世界范圍內(nèi)各養(yǎng)豬場PCP發(fā)病率不斷上升，對養(yǎng)豬業(yè)造成的危害不容忽視。根據(jù)APP莢膜多糖（CPS）和脂多糖（LPS）抗原性差異，可將其分為18種血清型；依據(jù)生長是否需要煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），又分為兩個生物型，即生物Ⅰ型（NAD依賴型）和生物Ⅱ型（非NAD依賴型），其中血清13、14型為生物Ⅱ型，血清17型菌株生物Ⅰ型和Ⅱ型都有，其他血清型均為生物Ⅰ型。不同國家和地區(qū)的APP優(yōu)勢血清型存在差異，但隨著種豬交流日益增多，一些非典型菌株逐漸流行，其中血清15型菌株分離率呈現(xiàn)上升趨勢[1-2]。不同血清型或同一血清型不同菌株之間臨床致病力不盡相同，且不同血清型之間沒有或僅有較弱的交叉保護力，尤其是目前市場上存在的商品化疫苗僅涉及血清1、2、3和7型，致使疫苗免疫效果常不確實或免疫失敗，從而使該病的防治難度進一步增大。

2021年9—10月，某集團公司在GX、SD地區(qū)部分豬場70～300日齡豬只出現(xiàn)疑似PCP疫情，臨床表現(xiàn)為呼吸困難、咳嗽、急性死亡等，剖檢變化均為肺臟淤血，部分為肺臟腫大、肺間質(zhì)增寬、肺表面有纖維素性滲出，脾臟淤血，發(fā)病率為5.0%～30.0%，病死率為1.1%～19.0%。為確定致病原，本試驗采用常規(guī)細菌學方法對病料組織進行細菌分離培養(yǎng)與生物型鑒定，PCR技術(shù)進行APP及其血清型鑒定、毒力基因型檢測及分離菌株之間的親緣關(guān)系鑒定，Kirby-Bauer紙片瓊脂擴散法（簡稱K-B法）測定分離菌株的藥物敏感性。試驗結(jié)果不僅為豬場有效防治PCP提供了技術(shù)支撐，也為了解區(qū)域性APP流行動態(tài)提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病料來源

病料為某集團公司在GX、SD地區(qū)部分豬場疑似PCP的11份病料組織（1份病死豬脾臟和10份病死豬肺臟），相關(guān)試驗于2021年9—10月在安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病研究室開展。

1.2 主要試驗材料

0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆瓊脂（TSA-YE）、0.6%酵母浸膏胰酪胨大豆肉湯（TSB-YE）購自杭州微生物試劑有限公司；新生小牛血清購自上海羽哚生物科技有限公司；無菌脫纖維兔血購自南京茂捷微生物科技有限公司；革蘭氏染液購自南京建成生物工程研究所；瓊脂糖、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；2×Taq PCR Master Mix、DL 2 000 DNA Marker購自莫納（武漢）生物科技有限公司；17種抗生素（新霉素、環(huán)丙沙星、慶大霉素、頭孢唑林、氧氟沙星、復(fù)方新諾明、甲氧芐啶、氨芐西林、氟苯尼考、阿奇霉素、頭孢曲松、丁胺卡那、諾氟沙星、鏈霉素、紅霉素、四環(huán)素和林可霉素）購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 質(zhì)控菌株

肺炎鏈球菌（菌種保藏編號為ATCC49619）和大腸桿菌（菌種保藏編號為ATCC25922）均由安徽農(nóng)業(yè)大學動物傳染病研究室保存，作為測定APP分離株耐藥表型的質(zhì)控菌株。

1.4 細菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

無菌采取1份病死豬脾臟和10份病死豬肺臟接種于TSA-YE培養(yǎng)基（含5%小牛血清及1.5%NAD）、TSA-YE培養(yǎng)基（含5%小牛血清）、5%兔血瓊脂培養(yǎng)基，置37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h，觀察細菌的生長情況，并挑取單個可疑菌落進行革蘭氏染色，鏡檢，觀察其形態(tài)特征。

1.5 引物合成

參照文獻[3-4]設(shè)計PCR鑒定APP及其血清型、毒力基因型引物（表1）。引物均由合肥通用生物科技有限公司合成。

表1 PCR鑒定APP及其血清型、毒力基因型引物序列

1.6 分離菌的PCR鑒定

利用煮沸法提取分離菌基因組DNA作為模板，用于PCR鑒定APP。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，57 ℃ 90 s，72 ℃ 1 min，3個循環(huán)；95 ℃ 20 s，57 ℃1 min，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進行觀察，并記錄結(jié)果。

1.7 NAD依賴試驗

將鑒定為APP的分離菌分別接種于NAD陽性（含5%小牛血清及1.5% NAD）和NAD陰性（只含5%小牛血清，不含NAD）的TSA-YE培養(yǎng)基上，置37 ℃條件下培養(yǎng)18～24 h后觀察其生長情況。

1.8 血清型鑒定

參照1.6提取APP模板DNA，用于PCR鑒定血清型。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各1 μL，模板DNA 5 μL，ddH2O 5.5 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，57 ℃ 1 min 30 s，72 ℃2 min 30 s，30個循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進行觀察，并記錄結(jié)果。

1.9 毒力基因鑒定

ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ基因PCR反應(yīng)體系（總體積15 μL）：2×Taq PCR Master Mix 7.5 μL，ddH2O 6.5 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各加0.5 μL，挑取菌落放入配好的PCR體系中，用移液槍吹打均勻，作為DNA模板。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，ApxⅠ65 ℃退火30 s，ApxⅡ63 ℃退火30 s，ApxⅢ、ApxⅣ61 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，30個循環(huán)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進行觀察，并記錄結(jié)果。

1.10 毒力基因分析

將含目的基因片段的PCR產(chǎn)物純化后測序，采用DNAStar（Version 7.10）軟件對獲得的毒力基因序列進行序列同源性分析，用MEGA 11.09軟件構(gòu)建APP的毒力基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹進行遺傳進化分析。

1.11 藥物敏感性試驗

參照美國臨床和實驗室標準化協(xié)會（Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI, 2016）推薦的方法，采用Kirby-Bauer紙片瓊脂擴散法測定分離株對17種藥物的敏感性。

2 結(jié)果與分析

2.1 細菌的分離培養(yǎng)及形態(tài)學觀察

自11份病死豬組織臟器中各分離1株菌，共計11株。其中，7株于2021年9—10月分離自GX地區(qū)部分豬場病死豬脾臟、肺臟，編號為1—7號，4株于2021年10月分離自SD地區(qū)部分豬場病死豬肺臟，編號為8—11號。分離菌在TSA-YE培養(yǎng)基（含5%小牛血清及1.5% NAD）上培養(yǎng)24 h后，均呈圓形、表面光滑、灰白色半透明的水珠樣菌落。對TSA培養(yǎng)基（含5%小牛血清和1.5% NAD）上可疑菌落涂片染色鏡檢，分離菌鏡檢結(jié)果均為革蘭氏陰性菌，顯微鏡下觀察均呈細小短桿狀、球桿狀或長絲狀，兩端鈍圓，符合APP的形態(tài)學特征（圖1）。

圖1 分離菌培養(yǎng)特性及形態(tài)學特征

2.2 分離菌的PCR鑒定

利用APP特異性引物對分離菌進行PCR擴增和瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性對照出現(xiàn)342 bp擴增條帶、陰性對照無條帶出現(xiàn)，試驗結(jié)果成立。11株分離菌PCR擴增產(chǎn)物與陽性片段大小均相符，確定為APP，分別命名為GXgg21-1、GXgg21-2、GXgg21-3、GXgg21-4、GXgg21-5、GXgg21-6、GXgg21-7、SDdz21-1、SDdz21-2、SDdz21-3、SDta21-1，編號為1—11號（圖2）。

圖2 分離菌的PCR擴增結(jié)果

2.3 NAD依賴試驗

分離菌在NAD陽性的TSA-YE培養(yǎng)基上均生長良好，在NAD陰性的TSA-YE培養(yǎng)基、5%兔血瓊脂培養(yǎng)基上均不生長，均符合生物Ⅰ型APP特征（圖3）。

圖3 分離菌NAD依賴試驗結(jié)果

2.4 血清型鑒定

利用APP血清15型特異性引物對APP分離菌進行PCR擴增。結(jié)果顯示，生物Ⅰ型APP分離菌均獲得1 575 bp目的片段，與預(yù)期片段的大小相符，確定為血清15型（圖4）。

圖4 分離菌的血清型PCR擴增結(jié)果

2.5 毒力基因鑒定

對11株APP分離菌的ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ毒力基因進行PCR檢測，結(jié)果顯示，分離菌共有3種毒力基因譜，1—5號、8—10號分離菌的毒力基因譜一致，均檢測到ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ基因，而均未檢測到ApxⅠ毒力基因；6、7號分離菌的毒力基因譜一致，均檢測到ApxⅢ和ApxⅣ基因，而均未檢測到ApxⅠ和ApxⅡ毒力基因；11號分離菌檢測到ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅣ基因，而未檢測到ApxⅢ基因（表2、圖5）。

表2 APP分離菌血清15型毒力基因檢測結(jié)果

圖5 11株APP分離菌毒力基因的PCR鑒定

2.6 毒力基因分析

利用DNAStar（Version 7.10）軟件對APP分離菌的ApxⅠ、ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ基因序列進行比對。結(jié)果顯示，9株APP分離菌（1—5號、8—11號分離菌）的ApxⅡ基因相似度為97.1%～100.0%，其中1、2號，5、11號，8、9號分離菌的ApxⅡ基因相似度為100.0%，高度同源；10株APP分離菌（1—10號分離菌）的ApxⅢ基因相似度為99.0%～100.0%，其中1、2、7號，3、5號，4、6號，8、9號分離菌的ApxⅢ基因相似度為100.0%，高度同源；11株APP分離菌（1—11號分離菌）的ApxⅣ基因相似度為96.5%～100.0%，其中1號、2號、5—10號分離菌的ApxⅣ基因相似度為100.0%，高度同源（圖6）。

圖6 ApxⅡ、ApxⅢ、ApxⅣ毒力基因核苷酸序列

用Maximum Likeihood tree方法分別構(gòu)建APPApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ毒力基因核苷酸序列系統(tǒng)進化樹。結(jié)果顯示9株APP分離菌ApxⅡ基因序列分為兩個分支，1、2、4、10號分離菌同處于分支一，其中1、2、4，10分別處于同一分支的2個水平上；3、5、8、9、11號分離菌同處于分支二，其中5、11，3、8、9分別處于同一分支的2個水平上。10株APP分離菌ApxⅢ基因序列分為兩個分支，其中1、2、7號分離菌同處于分支一；3—6、8—10號分離菌同處于分支二，4，3、5、10，6、8、9分別處于同一分支的不同水平上；11株APP分離菌ApxⅣ基因序列同處于分支一，其中1—10號，11號分離菌分別處于同一分支的2個水平上（圖7）。

圖7 11株APP分離菌毒力基因核苷酸序列系統(tǒng)發(fā)育樹分析

綜上可見，1—11號APP分離菌具有極近的親緣關(guān)系，與目前國內(nèi)外部分APP流行菌株同源性高，親緣關(guān)系較密切，其中1、2號，8、9號分離菌分離自同一場區(qū)，且1、2號，8、9號分離株的ApxⅡ、ApxⅢ和ApxⅣ基因核苷酸序列相似度均達100%，并處于系統(tǒng)發(fā)育樹的同一分支，高度同源，為同一菌株。

2.7 藥物敏感性試驗

根據(jù)CLSI執(zhí)行標準判斷，質(zhì)控菌株的抑菌圈大小在規(guī)定范圍內(nèi)。1—11號APP分離菌對氧氟沙星和甲氧芐啶的敏感率最高（81.8%），其次是環(huán)丙沙星、頭孢唑林和阿奇霉素（敏感率為72.7%），對氨芐西林、復(fù)方新諾明、頭孢曲松、慶大霉素和諾氟沙星的敏感率為63.6%～54.5%，對丁胺卡那、新霉素、鏈霉素、氟苯尼考、林可霉素、紅霉素和四環(huán)素的耐藥率為45.5%～90.9%（表3）。

表3 1—11號APP分離菌藥物敏感性試驗結(jié)果

3 討論

APP主要定居于豬的呼吸道并且具有高度宿主特異性，各個生長階段的豬均可感染。PCP具有較強的季節(jié)性，多發(fā)生在春夏交接的4～5月和秋冬交接的9～11月，飼養(yǎng)密度、濕度、舍內(nèi)氨氣和粉塵過高、氣溫驟變、飼養(yǎng)環(huán)境的突然改變、混群、轉(zhuǎn)群、擁擠、長途運輸?shù)葢?yīng)激因素是豬群發(fā)病的原因。隨著現(xiàn)代化養(yǎng)豬生物安全措施加強、管理理念提升、生產(chǎn)工藝的改進、溫控條件的改善，由天氣突變造成的影響可能越來越小。每年1～2月是生豬的消費旺季，導致存欄豬減少；而3～5月與10～12月發(fā)病報道數(shù)增多的原因，可能與年后生豬滯銷造成存欄增多，年前銷售壓欄待價有關(guān)，導致欄舍密度、氨氣濃度、粉塵等增多，PCP死亡案例數(shù)報道增多。

本試驗針對2021年9—10月，某集團公司在GX、SD地區(qū)部分豬場70～300日齡豬只出現(xiàn)的疑似PCP疫情，在掌握相關(guān)信息的基礎(chǔ)上，包括飼養(yǎng)數(shù)量、飼養(yǎng)方式、免疫接種、發(fā)病時間、病程進展、用藥情況、發(fā)病率與病死率等，以及發(fā)病時的臨床表現(xiàn)和病理剖檢變化，通過常規(guī)細菌學鑒定方法，采集病料組織進行細菌分離培養(yǎng)與生物型鑒定，應(yīng)用PCR技術(shù)對分離菌進行APP及其血清型鑒定、毒力基因檢測以及分離菌之間親緣關(guān)系的確定。結(jié)果顯示，從疑似APP感染的11份（GX地區(qū)7份，SD地區(qū)4份）病死豬組織中均分離獲得歸屬于生物Ⅰ型、血清15型的APP。APP分離菌共有3種毒力基因譜，為ApxⅠ-ApxⅡ+ApxⅢ+ApxⅣ+、ApxⅠ-ApxⅡ-ApxⅢ+ApxⅣ+和ApxⅠ+ApxⅡ+ApxⅢ-ApxⅣ+。APP的一種血清型只能產(chǎn)2種或3種Apx毒素，能同時產(chǎn)生ApxⅠ和ApxⅡ毒素的毒性最強[5]，由此毒力基因譜為ApxⅠ+ApxⅡ+ApxⅢ-ApxⅣ+的11號APP分離菌毒力可能較強。11株APP分離菌之間具有極近的親緣關(guān)系，同時也與國內(nèi)外部分APP流行菌株同源性高，關(guān)系較密切，其中1、2號，8、9號APP分離菌為同一菌株。目前，國外以血清1、5和7型最為流行，國內(nèi)優(yōu)勢血清型雖主要為血清7、1和3型，其次為血清5、11、10和13型，然而血清5、11、15和1型菌株分離率呈現(xiàn)逐年增高的趨勢[6]。這不僅表明不同地區(qū)流行的APP優(yōu)勢菌株不同，同時也提示APP流行血清型處于動態(tài)變化中，現(xiàn)存的商品化疫苗可能并不與各地流行的優(yōu)勢菌株相契合。因此，實時監(jiān)測生產(chǎn)實際中APP流行血清型動態(tài)變化是豬場實施長期防治的重要參考。

對PCP的綜合防制措施主要包括加強飼養(yǎng)管理、藥物防治、預(yù)防接種等。免疫接種是預(yù)防PCP的有效方法，但APP血清型眾多，且相互間交叉保護力弱，因此疫苗中所含APP血清型的選擇，要根據(jù)具體情況確定。對受威脅但未發(fā)病的豬群，可以進行預(yù)防性給藥。對于發(fā)病豬群，早期及時治療是有效的降低損失的方法。本次試驗藥敏結(jié)果顯示，1—11號APP分離菌對氧氟沙星和甲氧芐啶的敏感率最高（81.8%），可作為首選治療藥物，其次是環(huán)丙沙星、頭孢唑林和阿奇霉素（敏感率為72.7%），對氨芐西林、復(fù)方新諾明、頭孢曲松、慶大霉素、諾氟沙星的敏感率為63.6%～54.5%，對丁胺卡那、新霉素、鏈霉素、氟苯尼考、林可霉素、紅霉素和四環(huán)素則具有不同程度的耐藥率（45.5%～90.9%）。據(jù)國內(nèi)外研究報道，源自美國和加拿大的312株APP分離菌對頭孢噻呋和氟苯尼考的敏感率均為100%，對托拉菌素和恩諾沙星的敏感率分別為99%和90%，對四環(huán)素類藥物耐藥率為94%～100%[7]。源自塞爾維亞的148株APP分離菌對頭孢噻肟、恩諾沙星、氟苯尼考敏感率均為100%，75%分離菌對一種或多種藥物具有耐藥性，對四環(huán)素和鏈霉素的耐藥率分別為34%和31%[8]。我國11株APP四川分離菌呈多重耐藥現(xiàn)象，對四環(huán)素和多西環(huán)素耐藥率為90.90%；對鹽酸林可霉素、復(fù)方新諾明和鏈霉素耐藥率為54.55%[9]。31株APP貴州分離菌對頭孢噻吩和頭孢拉定敏感率分別為29.03%和22.58%，對青霉素、氨芐西林等10種抗生素耐藥率均為100%，呈10重耐藥[10]。表明不同來源APP分離菌的耐藥性呈現(xiàn)區(qū)域耐藥、多重耐藥特點，因此應(yīng)通過藥敏試驗確定行之有效的臨床治療藥物，同時應(yīng)注意使用現(xiàn)行敏感抗菌藥物也要謹慎，輪換、穿梭用藥結(jié)合，關(guān)注耐藥性變化趨勢，防止藥物選擇壓力加重APP多重耐藥程度，給PCP的防治帶來困難。此外，8、9號APP分離菌雖鑒定為同一菌株，但對包括頭孢曲松、慶大霉素等在內(nèi)的7種抗生素的藥物敏感性存在差異，推測可能是由于人類、動物和環(huán)境之間的活動與聯(lián)系，加強了耐藥細菌及耐藥基因的傳播，致使耐藥差異性的出現(xiàn)[11]。