分散液液微萃取/HPLC-MS/MS測定保健茶中非甾體抗炎藥

周斌，孫亮*，張書玲

1.杭州市食品藥品檢驗研究院（杭州 310022）；2.通標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司杭州分公司（杭州 310052）

近年來，不法分子利益驅(qū)使，向保健茶中非法添加非甾體抗炎藥（NSAIDs）時有發(fā)生[1-2]。《中華人民共和國食品安全法》第十條規(guī)定，食品中不得加入藥物。NSAIDs是世界上使用最廣泛的藥物，物種類繁多。非甾體抗炎藥具有消炎、抗風(fēng)濕作用，主要有：甲酸類，代表藥物二氟尼柳等；乙酸類，代表藥物有雙氯芬酸、吲哚美辛、舒林酸等；丙酸類，代表藥物有芬布芬、萘普生、奧沙普秦等；昔康類，代表藥物包括吡羅昔康、美洛昔康等；昔布類，代表藥物包括塞來昔布[3]。非甾體抗炎藥會引起腸胃疾病、肝腎毒害、心肌梗塞、中風(fēng)等[4-6]。長期食用非法添加藥物，嚴(yán)重危害食用者健康[7]。

目前非法添加主要檢測方法有毛細(xì)管電泳法[8]、高效液相色譜法[9-10]、高效液相色譜-液質(zhì)聯(lián)用法[11-14]、電化學(xué)檢測法[15]、光譜檢測法[16-18]。樣品前處理常用固相萃取對保健茶中的非法添加NSAIDs進(jìn)行提取和凈化，這種方法耗費(fèi)大量的有機(jī)試劑，耗材和裝置昂貴。分散液液微萃取技術(shù)是通過形成穩(wěn)定的萃取劑/分散劑/樣品溶液乳濁液體系，使待測物在樣品溶液及萃取劑之間快速達(dá)到分配平衡而完成萃取[19-20]。其因操作簡便、消耗溶劑量少、富集倍數(shù)高等優(yōu)點(diǎn)，己成為國內(nèi)外研究藥物殘留分析研究的熱點(diǎn)之一。研究采用分散液液微萃取技術(shù)與高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)相結(jié)合，建立了保健茶中非法添加9種非甾體抗炎藥的測定方法，為保健茶中非甾體抗炎藥定性和定量檢測提供了可靠的分析手段。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

保健茶（市售）；美洛昔康、芬布芬、奧沙普秦、萘丁美酮、非普拉宗、塞來昔布（純度≥99.4%，購自中國食品藥品檢定研究院）；貝諾酯（購自LGC，純度≥98.9%）；吡羅昔康、依托考昔（購自麥克林，純度≥98%）。以上對照品均供含量測定用。

甲醇、乙腈、甲酸（色譜純，美國Fisher公司）；超純水（實驗室自制）。

1.2 儀器與設(shè)備

AB 4000 QTRAP型串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜（美國AB SCIEX公司）；Milli-Q超純水儀（美國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液（500 μg/mL）：準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)品各50.0 mg（精確至0.000 1 g），分別置于100 mL容量瓶中，美洛昔康加5 mL水溶解，再用甲醇稀釋至刻度，其余標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，配制成質(zhì)量濃度各為500 μg/mL標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 樣品前處理

稱取1.00 g樣品置于15 mL聚丙烯離心管中，加入10 mL乙腈，按4 500 r/min離心5 min，吸取1.0 mL乙腈提取液，加入5.00 mL水和50 μL四氯化碳，渦旋提取3 min，按7 000 r/min離心10 min，用微量注射器吸取底部一定量的沉淀相，氮?dú)獯蹈?，用甲醇溶解定容?.5 mL，過0.22 μm濾膜，供LC-MS/MS測定。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Acquity BEH-C18柱（2.1 mm×100 mm，1.6 μm）；流速：0.4 mL/min。柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：5 μL。流動相：B為乙腈，A為含0.05%甲酸的2 mmol/L乙酸銨溶液。梯度洗脫程序：0～1 min，5%B；1.1～5 min，5% B～45% B；5.1～9 min，45% B；9.1～10 min，45% B～55% B；10.1～11 min，55% B，11.1～12 min，95% B，12.1～13 min，5% B。

1.3.4 質(zhì)譜條件

質(zhì)譜離子源為ESI+；掃描方式：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；去溶劑溫度（TEM）：500 ℃；氣簾氣壓力（CUR）：20 psi；碰撞氣壓力（CAD）：10 psi；離子氣1壓力（GS1）：55 psi；離子氣2壓力（GS2）：60 psi；離子噴射電壓（IS）：5 500 V（正離子模式）。

采用MRM-信息依懶性采集（IDA）-EPI模式，建立EPI圖譜庫；MS條件下添加信息相關(guān)掃描，監(jiān)測響應(yīng)值超過1 000化合物，得到其離子信息，掃描范圍m/z50～500，去簇電壓60 V，碰撞能量35±15 eV；擴(kuò)展碰撞能量15 V；一級全掃描獲得的高精度相對分子質(zhì)量數(shù)據(jù)用于定量及定性分析，IDA全掃描獲得的二級碎片離子信息用于加強(qiáng)定性確證。

化合物定性、定量離子及其他質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 9種非甾體抗炎藥質(zhì)譜參數(shù)

2 結(jié)果與分析

2.1 流動相的選擇

試驗比較研究了在乙腈-水流動相體系中分別加入0.1%甲酸水-乙腈、0.05%甲酸水-乙腈、5 mmol/L乙酸銨、2 mmol/L乙酸銨、5 mmol/L乙酸銨（含0.1%甲酸）-乙腈等的影響，并進(jìn)行了梯度洗脫條件的優(yōu)化。結(jié)果表明，以0.1%甲酸的5 mmol/L乙酸銨溶液作為流動相，9種化合物的色譜峰形、分離度和質(zhì)譜信號響應(yīng)較好。

圖1 9種非甾體抗炎藥混標(biāo)總離子流圖

2.2 萃取溶劑的選擇

萃取劑需與水有較小的溶解能力，密度大于水以便萃取溶劑沉淀，對待測化合物的溶解性能好，以便后續(xù)色譜分析。試驗選擇水作為分散劑，按“2.2”方法進(jìn)行萃取測定?？疾斐Ｓ玫亩燃淄?、氯苯、四氯化碳、四氯乙烯作為萃取劑的萃取效果，其密度分別為1.325，1.11，1.59和1.62 g/mL。圖2表明：二氯甲烷作為萃取劑的結(jié)果重現(xiàn)性較差，可能是因為二氯化碳易揮發(fā)，導(dǎo)致萃取液體積變化大；四氯化碳的萃取效率（90.0%～104.1%）比氯苯（84.6%～93.1%）和四氯乙烯（77.9%～92.1%）要好，四氯化碳的萃取效率最好，故選擇四氯化碳為目標(biāo)化合物的萃取溶劑。

圖2 萃取劑種類對回收率的影響

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

試驗比較了在100 μg/kg濃度下，甲醇、乙腈、丙酮、乙酸乙酯對9種非甾體抗炎藥萃取效果試驗。圖3表明，采用乙腈作為提取溶劑時的效果最高，回收率能達(dá)到89.5%～110%，而且不易提取色素，雜質(zhì)干擾少。

圖3 在100 μg/kg濃度下9種非甾體抗炎藥在不同提取溶劑下的回收率

2.4 萃取條件的優(yōu)化

試驗通過考察萃取劑體積、分散劑體積、水的體積對萃取效率的影響，以測定美洛昔康的回收率的影響，確定最優(yōu)萃取效率。

2.4.1 分散劑體積對回收率的影響

試驗通過考察不同體積（30，50和90 μL）的萃取劑四氯化碳對美洛昔康回收率的影響。結(jié)果表明，萃取劑為50 μL時，美洛昔康回收率回收率最高，因此萃取劑的體積選擇50 μL。

2.4.2 分散劑體積對回收率的影響

考察不同分散劑體積（0.5，1.0和1.5 mL）對美洛昔康回收率的影響。結(jié)果表明，分散劑體積為1.0 mL時，美洛昔康回收率最高。結(jié)果表明，分散劑體積直接影響待測物在水中的溶解度，合適體積的分散劑不僅能提高傳質(zhì)效果，還能提高萃取效率。

2.4.3 水的體積對回收率的影響

考察不同水的體積（2.5，5.0和7.5 mL）對美洛昔康的回收率影響。結(jié)果表明，水的體積為5 mL時，美洛昔康的回收率最高?？赡苁且驗樗捏w積大于5 mL時，部分萃取劑會溶解在水中，導(dǎo)致萃取效率降低。因此，最優(yōu)萃取條件中水的用量為5 mL。

2.5 方法學(xué)驗證（標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、檢出限、定量限、相關(guān)系數(shù)）

取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用甲醇配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)，各組分質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算回歸方程、線性范圍以及相關(guān)系數(shù)。在相應(yīng)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，9種化合物的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r均在0.998以上。

取陰性保健茶，添加不同濃度的待測物，以性噪比（S/N）=3計算方法檢出限，S/N=10計算方法定量限，檢出限為0.5～5 μg/kg，定量限為1.5～15 μg/kg。

表2 9種非甾體抗炎藥的檢出限、定量限、線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)（r）

2.6 方法的添加回收率、精密度

取6份不含本底的保健茶，每份1.00 g，分別添加0.02，0.05和0.2 mg/kg 3個水平質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液。按2.2方法測定回收率，每個水平測定5次，結(jié)果見表4。結(jié)果顯示，在0.02，0.05和0.2 mg/kg 3個添加水平下，平均回收率為85.7%～105.7%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）為1.7%～8.9%，滿足定量分析的要求。

表4 陽性樣品EPI譜庫搜索匹配結(jié)果

2.7 實際樣品分析

用該方法測定了從網(wǎng)上購買的56批次保健茶。檢出一個批次進(jìn)口保健茶中含有吡羅昔康，EPI譜庫搜索匹配度≥90，為陽性樣品，含量為7.42 g/kg。

表3 9種非甾體抗炎藥的添加回收率和精密度（n=6）

圖4 陽性樣品和標(biāo)準(zhǔn)溶液（50 μg/L）增強(qiáng)離子掃描（EPI）圖譜

3 結(jié)論

將分散液液微萃取技術(shù)與液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）相結(jié)合應(yīng)用于保健茶中9種非甾體抗炎藥的檢測。與常規(guī)保健食品中非法添加非甾體抗炎藥的液相質(zhì)譜法相比，該方法操作簡單，選擇性好，靈敏度高，沒有繁瑣的凈化過程，有效地避免假陽性樣品。該方法可以應(yīng)用于種類繁多和樣品量巨大的保健茶中非法添加非甾體抗炎藥快速篩查，為相關(guān)的監(jiān)管部門提供了有效的技術(shù)支持。