液相色譜—質(zhì)譜法檢測(cè)食品和飼料中黃曲霉毒素研究進(jìn)展

趙勝男*，高海軍，劉瑩，戴冠蘋，彭星星，曹晶晶

河南省糧油飼料產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（鄭州 450004）

黃曲霉毒素是由環(huán)境中常見的真菌產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。在干旱、溫暖和潮濕的條件下，黃曲霉和寄生曲霉是主要產(chǎn)生黃曲霉毒素的真菌物種[1]。20世紀(jì)60年代，土耳其一種名為“X”的疾病致使超過100 000只火雞和其他家禽在英格蘭死亡[2]。這次瘟疫爆發(fā)與受污染的飼料息息相關(guān)，這使得科學(xué)家開始認(rèn)識(shí)黃曲霉毒素并研究其毒性。此后，黃曲霉毒素污染已逐漸被認(rèn)為會(huì)對(duì)全球的食品安全與貿(mào)易產(chǎn)生威脅[3]。眾所周知，黃曲霉毒素會(huì)污染田間和貯藏作物。通常情況下，食用谷物、花生、奶制品等食品容易受黃曲霉毒素侵害，這是因?yàn)楫?dāng)前的農(nóng)業(yè)和食品加工技術(shù)無法完全去除黃曲霉毒素。黃曲霉毒素主要包括B1、B2、G1、G2和M1，羥化代謝產(chǎn)物B1可通過膳食對(duì)人類和動(dòng)物的健康構(gòu)成嚴(yán)重威脅。黃曲霉毒素的毒性是毋庸置疑的。據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（International Agency for Research on Cancer，IARC）報(bào)道，黃曲霉毒素會(huì)使人體肝臟致癌。黃曲霉毒素B1、B2、G1和G2被歸類為人類致癌物，而B1是最強(qiáng)有力的致癌物質(zhì)。世界各地政府均將黃曲霉毒素列入監(jiān)管范圍，并規(guī)定了不同食品中的限量[4]。

為確保食用和流通的食品和飼料安全，研究適用于監(jiān)管黃曲霉毒素含量的分析方法是至關(guān)重要的。完善的分析黃曲霉毒素的方法是基于對(duì)目標(biāo)分析物（包括極性、溶解性、熱穩(wěn)定性等）、食品成分（如脂肪、水和糖含量）、提取條件、樣品純化以及儀器設(shè)備的全面理解。圖1展示了黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1的結(jié)構(gòu)式和主要化學(xué)性質(zhì)。黃曲霉毒素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展離不開其自身固有的化學(xué)特性。例如，質(zhì)譜分析通常依靠其分子離子和特定結(jié)構(gòu)片段。

圖1 黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2和M1的結(jié)構(gòu)式和主要化學(xué)性質(zhì)

通過回顧比較不同的液質(zhì)檢測(cè)技術(shù)并評(píng)估其潛力和局限性，我們可以總結(jié)促進(jìn)黃曲霉毒素分析方法發(fā)展的關(guān)鍵技術(shù)、目前需要解決的問題以及未來的研究方向。文章不僅概括了各種食品（包括谷物、花生、香料和乳制品等）和飼料中黃曲霉毒素的液質(zhì)檢測(cè)技術(shù)，而且闡明了當(dāng)前應(yīng)該解決的問題，并預(yù)測(cè)了未來檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展方向，以期為黃曲霉毒素分析研究提供依據(jù)。

1 液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

20世紀(jì)80年代以來，液相色譜和質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS）已經(jīng)成為真菌毒素檢測(cè)發(fā)展最快的一項(xiàng)技術(shù)?；贚C分離和目標(biāo)物質(zhì)荷比（m/z），LC-MS可同時(shí)分析多種毒素，優(yōu)勢(shì)明顯。相對(duì)于紫外、可見光吸收或者熒光發(fā)射，m/z基于目標(biāo)分析物的分子量是更可靠的定性依據(jù)。目前，LC-MS分析靈敏度高，可特異性識(shí)別多種毒素，成為真菌毒素分析的首選技術(shù)。

1.1 定性

早期LC-MS分析真菌毒素常采用LC和熱噴霧MS聯(lián)用。作為一種軟電離技術(shù)，熱噴霧MS基于分子離子識(shí)別黃曲霉毒素，這項(xiàng)技術(shù)與LC保留時(shí)間結(jié)合，可作為一種定性的有用工具。Holcomb[5]采用熱噴霧MS研究了衍生化黃曲霉毒素B1、B2的結(jié)構(gòu)式和分子量，用碘試劑確定了柱后化學(xué)衍生的機(jī)理，碘試劑已被廣泛用于液相色譜熒光檢測(cè)（liquid chromatographyfluorescence detection，LC-FLD）分析中增強(qiáng)黃曲霉毒素B1、G1熒光發(fā)射。Cappiello[6]采用電子轟擊電離質(zhì)譜（EI-MS）分析毒素，黃曲霉毒素通過反相毛細(xì)管柱進(jìn)入離子源，結(jié)果表明全掃描模式可用于定性目標(biāo)離子，選擇離子掃描（selected ion monitor，SIM）模式適用于定量分析，檢出限大約10 ng/mL，靈敏度較高。

盡管早期LC-MS分析食品中黃曲霉毒素靈敏度不夠高，但作為定性工具特異識(shí)別性較高。最初，通過生物認(rèn)證定性黃曲霉毒素[7]，這種方法間接、耗時(shí)，迅速被基于黃曲霉毒素物理化學(xué)特性的新技術(shù)取代（例如薄層色譜、化學(xué)衍生和熒光檢測(cè)）[8]，目前，包括氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用（Gas chromatography-tandem mass spectrometry，GC-MS）、LC-MS在內(nèi)的質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)廣泛用于特異性識(shí)別黃曲霉毒素[9]。

1.2 定量

20世紀(jì)90年代后期，由于靈敏度較高，LC-MS尤其是液相三重四級(jí)桿質(zhì)譜聯(lián)用（LC-triple quadrupole，LC-QQQ）已被廣泛用于食品中不同有機(jī)化學(xué)物的定量分析。盡管LC-MS花費(fèi)高，研究者也嘗試用這項(xiàng)技術(shù)來定量分析黃曲霉毒素。研究表明，受樣品基質(zhì)成分影響，LC-MS分析黃曲霉毒素時(shí)信號(hào)明顯降低[10]，這主要是黃曲霉毒素不完全電離造成的，我們可通過稀釋基質(zhì)濃度、純化、加標(biāo)或者使用內(nèi)標(biāo)例如13C標(biāo)記黃曲霉毒素來減少基質(zhì)影響[11]。稀釋是一種簡(jiǎn)單的降低基質(zhì)影響的方法，但對(duì)LC-MS靈敏度要求較高。例如，牛奶中黃曲霉毒素質(zhì)量濃度0.5 ng/mL，如果稀釋10倍可消除基質(zhì)影響，LC-MS本身必須可定量低于0.05 ng/mL黃曲霉毒素，以此類推，如果樣品中黃曲霉毒素濃度更低，對(duì)LC-MS靈敏度要求更高。如果大部分商品化LC-MS靈敏度無法滿足試驗(yàn)要求，就需要加標(biāo)或者純化步驟來檢測(cè)較低濃度的黃曲霉毒素。樣品純化常被用于實(shí)驗(yàn)室消除基質(zhì)干擾，但是步驟繁瑣，甚至采用免疫親和柱，LC-MS分析也不能免于基質(zhì)影響。采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校正可得到滿意的定量結(jié)果，此法需加標(biāo)黃曲霉毒素到干凈基質(zhì)用作標(biāo)準(zhǔn)校正，并假設(shè)標(biāo)準(zhǔn)校正和樣品中的基質(zhì)對(duì)黃曲霉毒素有相似的影響，但是準(zhǔn)備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校正比較復(fù)雜，尤其當(dāng)研究者需處理多種食品基質(zhì)[12]。加標(biāo)是定量最直接的方法，但是分析一個(gè)樣品中四種不同濃度的黃曲霉毒素，加標(biāo)法有一定困難。同位素稀釋試驗(yàn)（stable isotope dilution assay，SIDA）是一種較為理想的減少基質(zhì)干擾的方法，此法采用13C作為內(nèi)標(biāo)可定量黃曲霉毒素。

Vahl等[13]研究了LC-MS法檢測(cè)食品中四種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2，此法采用黃曲霉毒素M1作為內(nèi)標(biāo)物，即用甲醇提取，柱層析法純化，在無花果、花生醬、花生、辣椒、胡椒和咖喱中加標(biāo)2 ng/mL黃曲霉毒素回收率在40%～270%之間，這主要是由于樣品純化方法對(duì)消除基質(zhì)干擾效果不佳。Cavaliere等[14]同樣采用黃曲霉毒素M1作為內(nèi)標(biāo)物檢測(cè)了谷物中的黃曲霉毒素，用乙腈-水（80∶20，V/V）作為提取液，稀釋后用固相萃取（SPE）純化，LC-MS/MS上機(jī)檢測(cè)，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校正定量，回收率在81%～101%之間變化，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（SRSD）小于12%，方法檢出限（SLOD）在0.1～0.6 ng/mL之間。采用內(nèi)標(biāo)法是一個(gè)很好的方法，但關(guān)鍵是選擇合適的內(nèi)標(biāo)物或者基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校正溶液，否則將難以降低定量時(shí)的基質(zhì)干擾。

Cervino等[15]合成了氘代黃曲霉毒素B2、G2用于補(bǔ)償提取過程和基質(zhì)干擾中分析物的損失，這兩種氘代內(nèi)標(biāo)在提取前加入樣品中（杏仁、小麥粉），結(jié)果顯示回收率、精密度較高，四種黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2回收率變化在90%～105%之間，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）分別是3.6%，4.8%，12%和14%。氘代黃曲霉毒素B2、G2由于相似的物化性質(zhì)更適用于定量黃曲霉毒素B2、G2。Li等[16]研究了同位素稀釋LC-MS法檢測(cè)飼料中的黃曲霉毒素，用甲醇-水（70∶30，V/V）或者乙腈-水（84∶16，V/V）作為提取液，過濾稀釋，上機(jī)前向提取物中加標(biāo)13C—黃曲霉毒素B1，在C18色譜柱上（2.1 mm×50 mm，1.7 mm）分離，三重四級(jí)桿MS上分析，通過比較標(biāo)品和樣品的保留時(shí)間及相對(duì)離子比率來定性黃曲霉毒素，日內(nèi)回收率變化在78%～122%之間。此外，Breidbach等[17]采用二維液相色譜（2D-LC）和雙同位素稀釋法研究了一種準(zhǔn)確檢測(cè)黃曲霉毒素B1方法，黃曲霉毒素B1和基質(zhì)成分成功分離，13C作為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)降低了基質(zhì)效應(yīng)，采用此法檢測(cè)谷物嬰兒食品、玉米和玉米類飼料中黃曲霉毒素B1的誤差為8.9%。Campone等[18]報(bào)道了采用2D-LC-MS分析檢測(cè)啤酒中的黃曲霉毒素、赫曲霉毒素A和伏馬菌素B1、B2，2D-LC消除了伏馬菌素和赫曲霉毒素洗脫時(shí)殘留的干擾物質(zhì)，同樣采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校正定量。

1.3 檢測(cè)通量

對(duì)研究者來說，如何監(jiān)控多種真菌毒素污染是一個(gè)挑戰(zhàn)。當(dāng)需要分析多種真菌毒素時(shí)，由于LC-MS可同時(shí)定性定量多種毒素，成為首選的技術(shù)。例如，Zhang等[19]比較了LC-MS和LC-FLD兩種技術(shù)分析檢測(cè)零售超市嬰兒食品中的真菌毒素，研究表明采用LCFLD技術(shù)，需使用多種方法逐一分析各種真菌毒素，而采用LC-MS技術(shù)只需一種通用方法即可分析多種毒素。當(dāng)前重點(diǎn)是充分利用LC-MS的分析通量，研究出多種真菌毒素的檢測(cè)方法。目前，已經(jīng)研究出許多LC-MS分析多種毒素方法，包括從樣品中提取毒素、純化、上機(jī)檢測(cè)，LC-QQQ-MS已經(jīng)實(shí)現(xiàn)連續(xù)檢測(cè)500多種真菌毒素[20]，研究者分析大量毒素時(shí)，需要利用不同分析物的物理化學(xué)特性找到合適的提取和樣品純化方法。

Spanjer等[21]提取了不同食品中（花生、開心果、小麥、玉米、玉米片、葡萄干和無花果）包括黃曲霉毒素在內(nèi)的33種真菌毒素，用乙腈-水（80∶20，V/V）和甲醇-水（70∶30，V/V）作為提取液，稀釋后上機(jī)LC-MS/MS分析，采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校正定量，這比使用SPE或者免疫親和柱純化更簡(jiǎn)化。Mol等[22]提出采用一種常規(guī)提取法分析食品和飼料中的136種農(nóng)藥、36種毒素（包括黃曲霉毒素）和86種獸藥，水-乙腈-1%甲酸作為提取液，提取后無需純化，直接上機(jī)LC-QQQ，大部分分析物回收率在70%～120%之間，SRSD＜10%，并通過基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)校正和減少進(jìn)樣體積（5 mL）降低基質(zhì)干擾。目前，基于LC-MS分析多種毒素的方法可明顯改善分離效率，未來將取代許多單一毒素的分析方法[23]。另外，檢測(cè)多種真菌毒素的方法需要平衡檢測(cè)結(jié)果和分析通量。例如，Zhang等[24]提出了一種分析食品中多種毒素的同位素稀釋LC-MS/MS法，包括黃曲霉毒素、伏馬菌素、赫曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、HT-2/T-2毒素和玉米赤霉烯酮等，每種毒素用13C內(nèi)標(biāo)，可分析花生醬、小麥粉和玉米中濃度在1～1 000 ng/g的毒素，總體回收率在80%～120%之間，SRSD＜20%，超過90%的回收率在90%～110%之間，實(shí)驗(yàn)室內(nèi)SRSD＜10%，實(shí)驗(yàn)室間SRSD＜15%。盡管這個(gè)方法并不能完全定量食品中191種真菌毒素[25]、295種細(xì)菌以及真菌代謝物[23]，但可用于篩選不同基質(zhì)中的毒素。

目前，盡管大部分LC-MS檢測(cè)毒素的方法采用LC-QQQ，但液相高分辨率質(zhì)譜（LC-high resolution mass spectrometry，LC-HRMS）逐漸吸引了研究者關(guān)注，包括液相色譜軌道阱高分辨質(zhì)譜聯(lián)用儀（LCOrbitrap-MS）、液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（LC-Q-time of flight-MS，LC-Q-TOF-MS）等。LC-HRMS可以獲得高分辨率的全掃描數(shù)據(jù)，盡管應(yīng)用并未普及，但已在真菌毒素分析領(lǐng)域快速發(fā)展，并成為篩選食品和飼料中多種毒素的有力工具。早期LC-HRMS缺少儀器軟件和檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重阻礙其在毒素檢測(cè)領(lǐng)域的發(fā)展，但計(jì)算機(jī)硬件、數(shù)據(jù)處理、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)系統(tǒng)發(fā)展極大促進(jìn)了LC-HRMS進(jìn)步步伐。類似于LC-QQQ，LC-HRMS尤其是LC-Orbitrap-MS通常用于多種毒素分析，而LC-Q-TOF用于黃曲霉毒素分析應(yīng)用較少。Toth等[26]采用LC-Q-TOF研究了黃曲霉毒素在不同的碰撞能量下的分裂模式，但這項(xiàng)研究并未定量。早期關(guān)于LC-HRMS研究中，Vaclavik等[27]將實(shí)時(shí)直接分析（Direct Analysis in Real Time，DART）的電離源和LC-Orbitrap-MS結(jié)合定量分析了小麥和玉米中的多種毒素，無需LC分離，通過DART-LC-Orbitrap-MS直接分析樣品提取物，并研究了定性準(zhǔn)確率和定量分辨率。對(duì)于黃曲霉毒素，LC-QQQ靈敏度高于DART。Lattanzio等[28]采用LC-Orbitrap-MS研究了谷物中包括黃曲霉毒素、伏馬菌素、赫曲霉毒素A、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮等在內(nèi)的多種毒素，通過分子離子和高能量碰撞分解（High Energy Collision Dissociation，HCD）產(chǎn)生的片段來分析每種毒素，結(jié)果顯示靈敏度、回收率和重復(fù)性與LC-QQQ方法類似。另外，Castaldo等[29]提出了一種采用LC-Orbitrap-MS將寵物食品中的目標(biāo)毒素檢測(cè)與其他物質(zhì)篩選相結(jié)合的新穎方法，分辨率高、結(jié)果準(zhǔn)確。

上述代表性研究是為了說明基于LC-MS分析檢測(cè)黃曲霉毒素的主要趨勢(shì)和挑戰(zhàn)。目前，LC-QQQ已經(jīng)由分析單一毒素發(fā)展為可同時(shí)分析多種毒素，而LCHRMS可以兼顧分析目標(biāo)物和其他物質(zhì)，這是毒素檢測(cè)的新模式。另外，和LC-MS相比，快速檢測(cè)法（例如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法）和LC-FLD花費(fèi)較低，檢測(cè)精密度和準(zhǔn)確度相當(dāng)[30]，具有一定的競(jìng)爭(zhēng)力。選擇檢測(cè)技術(shù)需要考慮多方面因素，不僅僅是定量，如果對(duì)毒素分子識(shí)別有要求，LC-MS將是首選技術(shù)。

2 結(jié)論

黃曲霉毒素污染對(duì)全球公共衛(wèi)生領(lǐng)域是一項(xiàng)巨大挑戰(zhàn)，全球貿(mào)易、氣候變化和多樣化的監(jiān)管政策讓問題更復(fù)雜，對(duì)毒素分析技術(shù)手段的需求極大促進(jìn)了食品和飼料中黃曲霉毒素液質(zhì)檢測(cè)的發(fā)展。黃曲霉毒素儀器分析經(jīng)歷了液相色譜紫外/熒光檢測(cè)到液質(zhì)聯(lián)用的過程，從非特異性識(shí)別（目視判斷、紫外吸收或熒光發(fā)射）到特異性識(shí)別（質(zhì)荷比、離子比、分子碎片），傳統(tǒng)的單一毒素檢測(cè)已經(jīng)被同時(shí)分析多種毒素替代。目前，液質(zhì)檢測(cè)技術(shù)發(fā)展最快，包括樣品提取、純化和上機(jī)檢測(cè)在內(nèi)，每一步均扮演著關(guān)鍵角色，雖然定性定量結(jié)果較為滿意，但多種復(fù)雜樣品前處理耗時(shí)繁瑣，檢測(cè)成本、對(duì)人員檢驗(yàn)技能要求較高，未來高效的前處理技術(shù)、降低成本將成為研究重點(diǎn)，同時(shí)在特異性識(shí)別、靈敏度和檢測(cè)通量方面有突破的新技術(shù)將繼續(xù)成為研究熱點(diǎn)。