主成分分析法優(yōu)化檸檬果酒發(fā)酵工藝

殷小雪，杜慧慧*，陳煥，秦洪文，江鴻翎，劉行

重慶三峽學院生物與食品工程學院（重慶 404120）

檸檬[Citrus limon（L.）Burm.f.]屬于蕓香科柑橘屬常綠小喬木，喜溫耐陰不耐寒[1]。根據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）數(shù)據(jù)庫統(tǒng)計，2019年中國檸檬種植面積約16萬 hm2[2-3]。萬州區(qū)位于長江上游結(jié)合部，三峽庫區(qū)腹地，氣候冬暖夏涼，適合栽植檸檬。萬州作為中國重要的檸檬三大產(chǎn)區(qū)之一，已有60年的種植歷史，2020年種植面積達0.67萬 hm2以上[4]。檸檬中不僅富含多種維生素，還含有大量檸檬酸，其果汁中維生素C含量達76 mg/100 mL。檸檬具有殺菌、美容、穩(wěn)定情緒、提神、化痰止咳、生津健胃、降低膽固醇、促進牙齒生長、防止牙齦出血、預防壞血病和心血管動脈硬化等功效[5-7]。

由于感官評定易受評價人員的主觀影響，導致感官結(jié)果誤差大，故采用模糊數(shù)學法與感官評價相結(jié)合，使感官指標數(shù)字化，保證結(jié)果的科學可靠[8-9]。另外，食品品質(zhì)影響因素眾多，可通過主成分分析法（PCA）對主要因素進行分析，并建立數(shù)學模型，從而得到的產(chǎn)品綜合評價更加準確[10-11]。

試驗以三峽庫區(qū)尤力克檸檬為主要原料，應用模糊數(shù)學感官評價法從色澤、香氣、滋味和風格4個方面真實客觀評價檸檬發(fā)酵酒，對檸檬發(fā)酵酒模糊感官評分、酒精度、總糖含量、總酸含量等進行主成分分析，建立綜合評價模型，并結(jié)合正交試驗優(yōu)化檸檬酒釀造工藝流程，為檸檬的深加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

尤力克檸檬（重慶市萬州區(qū)橫山村采摘）；安琪耐高溫釀酒高活性干酵母（食用級，安琪酵母股份有限公司）；白砂糖（永輝超市購買）；玻璃層析柱（30 mm×500 mm，宸喬科技有限公司）。

1.2 試驗試劑

β-環(huán)狀糊精（食品級，浙江一諾生物科技有限公司）；大孔弱堿性陰離子交換樹脂（D318、D301G、D301、D315）、弱堿性環(huán)氧系陰離子交換樹脂（330，鄭州和成新材料科技有限公司）；DNS試劑（化學純）、鄰苯二甲基氫鉀（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；氫氧化鈉、鹽酸（分析純，上海麥克林生化科技有限公司）。

1.3 儀器與設備

電子天平（瑞安市樂祺貿(mào)易有限公司）；pH-100型pH計（上海力辰邦西儀器科技有限公司）；HT-512ATC型糖度計（上海丙?？萍加邢薰荆还茖Ｓ眯途凭嫞熍_帝伯仕自釀機有限公司）；精密膜過濾器（煙臺帝伯仕自釀機有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；SP-756型可見光分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）。

1.4 試驗方法

1.4.1 工藝流程

檸檬鮮果→去皮、瓤、籽→滅菌→裝罐→配料、接種→主發(fā)酵→后發(fā)酵→陳釀→澄清→過濾→裝瓶

1.4.2 操作要點

選擇完全成熟、無蟲害、無霉爛的檸檬鮮果，40℃流水沖洗，將附著在檸檬上的土壤、微生物以及殘留的農(nóng)藥清洗干凈。剝?nèi)ス?、果瓤和籽，得到檸檬果肉。調(diào)整糖度，按一定的料液比裝罐，裝至發(fā)酵罐容積的80%。接入活化后的酵母溶液，攪拌充分。在25 ℃密閉環(huán)境下發(fā)酵。待發(fā)酵醪液面上升，表示主發(fā)酵開始，每日測定發(fā)酵罐中的各項理化指標。直至可溶性固形物及pH無變化時，主發(fā)酵結(jié)束[12]。經(jīng)后發(fā)酵[13]，根據(jù)NY/T 1508—2017《綠色食品果酒》放置于干凈通風的貯酒室進行陳釀。隨后添加澄清劑使檸檬果酒中的雜質(zhì)沉淀，液體澄清；采用精密膜過濾器，去除細小雜質(zhì)[14]。

1.4.3 理化指標測定

pH，參照GB 5009.237—2016《食品安全國家標準食品pH的測定》；可溶性固形物，按手持糖度計法測定；總糖含量，按DNS試劑法測定；總酸含量，按酸堿滴定法測定；酒精度，按酒精計法測定，參照GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》。

1.4.4 模糊數(shù)學感官評價

設檸檬果酒的評價因素集合為U=（u1，u2，u3，u4），u1、u2、u3和u4分別代表檸檬果酒的色澤、香氣、滋味和風格。建立評價評語集合。設檸檬果酒的評價評語集合為V=（v1，v2，v3，v4）=（90，80，70，60），v1、v2、v3和v4分別代表優(yōu)、良、中和差4個等級，每個等級分別對應90，80，70和60分。通過采用強制決定法[15]確定檸檬果酒的權(quán)重集合W=（w1，w2，w3，w4）=（0.3，0.2，0.4，0.1），即色澤、香氣、滋味和風格分別占比0.3，0.2，0.4和0.1。由10名評價人員按表1標準對檸檬果酒進行感官評價，假設檸檬果酒得分情況如表2所示。

表1 檸檬果酒感官評價標準

表2 檸檬果酒感官評價得分情況匯總表

1.4.5 矩陣變換及模糊感官綜合評價

通過將表中數(shù)據(jù)進行轉(zhuǎn)化即可得到檸檬果酒的模糊感官評價得分矩陣R。

令模糊感官的綜合評分集合為Y，根據(jù)模糊變換原理Y=W×R，即矩陣變化如式（2）所示。

檸檬果酒的模糊感官評分為綜合評分集合Y與評語集合V的乘積，即模糊感官評分T=Y×V[16]。

1.4.6 單因素試驗

將檸檬果酒的基本條件設置為主發(fā)酵溫度25 ℃、糖度25%、酵母添加量0.12%、料液比1∶0 g/mL、發(fā)酵時間15 d。按照上述試驗流程及操作要點進行單因素試驗，分別研究糖度（17%，18%，19%，20%和21%）、酵母添加量（0.08%，0.10%，0.12%，0.14%和0.16%）、料液比（1∶0，1∶0.1，1∶0.2，1∶0.3和1∶0.4 g/mL）和發(fā)酵時間（11，13，15，17和19 d）對檸檬果酒模糊感官評分的影響。

1.4.7 正交試驗

采取小組評分法，確定10名評定人員進行模糊感官評定。以檸檬果酒的模糊感官評分作為評判標準，分析檸檬果酒的單因素試驗結(jié)果，制定各因素正交試驗水平（表3）。

表3 正交試驗因素水平表

1.5 超高效液相色譜測定類黃酮含量分析

1.5.1 樣品預處理

檸檬果酒充分搖勻，吸取1 mL提取液，過0.22 μm親水性PTFE膜到2 mL進樣小瓶，待測。

1.5.2 儀器條件

UPLC檢測主要參考趙梓燕[17]的方法。具體方法：使用ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm，Waters，美國），以0.1%甲酸水溶液（A）和甲醇（B）作為流動相，梯度洗脫，分離條件為0～0.6 min，10%～20% B；0.6～5.0 min，20%～70% B；5.0～7.0 min，70%～90% A；流速0.4 mL/min；柱溫40 ℃；進樣體積1 μL；檢測波長283 nm（黃烷酮）和330 nm（PMFs）。

1.6 數(shù)據(jù)分析

使用軟件SPSS 20.0進行數(shù)據(jù)處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

糖度對檸檬酒模糊感官評分的影響如圖1（A）所示。糖度20%時，其模糊感官評分值最高，其色澤、香氣、滋味、風格都達到最佳。

酵母添加量對檸檬酒模糊感官評分的影響如圖1（B）所示。酵母添加量0.14%時，其模糊感官評價分達到最高值。

檸檬果酒的模糊感官評分隨著料液比變大呈現(xiàn)先增加后減小趨勢，料液比1∶0.2 g/mL時，檸檬果酒模糊感官評分達到最大（圖1C）。料液比的增加會使檸檬果酒的透明度、色澤逐漸變好。

當發(fā)酵時間小于15 d時，檸檬酒渾濁、無光，無明顯的酒香，滋味偏酸澀，酒體風格不協(xié)調(diào)。當發(fā)酵時間大于15 d，檸檬酒色澤偏淡，滋味由于檸檬過度發(fā)酵而導致苦澀，檸檬果酒的模糊感官評分下降。由圖1（D）可知，最適發(fā)酵時間為15 d。

圖1 檸檬酒發(fā)酵中單因素結(jié)果

2.2 正交試驗結(jié)果

由表4可知，5號試驗產(chǎn)品的模糊感官評分最高，對應的試驗組為A2B2C3D1，極差的結(jié)果顯示RB＞RA＞RD＞RC，表明酵母添加量對產(chǎn)品的影響最大，糖度和發(fā)酵時間的影響程度次之，料液比對檸檬果酒的模糊感官評價影響最小。通過k值的大小可得到其最優(yōu)比為A2B2C2D1。

表4 正交試驗樣品模糊感官評分

2.3 正交試驗樣品PCA綜合得分正交結(jié)果分析

由表5可知，極差分析結(jié)果顯示RB＞RA＞RD＞RC，結(jié)果表明各因素對檸檬果酒的PCA分析綜合得分的影響程度為酵母添加量＞糖度＞發(fā)酵時間＞料液比。檸檬果酒的最優(yōu)配方為A2B2C3D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、發(fā)酵時間13 d。正交試驗的最優(yōu)配方在正交試驗組中，其PCA綜合得分為0.94。對正交試驗結(jié)果進行方差分析（表6）得到糖度、酵母添加量、料液比對檸檬果酒的PCA綜合得分的影響極顯著（p＜0.05）。表7顯示不同發(fā)酵組的總酸、總糖和酒精度存在差異。

表5 PCA正交試驗綜合得分

表6 方差分析表

表7 檸檬酒感官指標和理化指標結(jié)果

2.4 試驗驗證結(jié)果分析

根據(jù)正交試驗中k值的大小得到檸檬果酒的最優(yōu)比為A2B2C2D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.2 g/mL、發(fā)酵時間13 d，通過主成分分析正交試驗樣品得到的檸檬果酒的綜合得分最佳比為A2B2C3D1，即糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、發(fā)酵時間13 d，由于2組試驗的基本條件不同，進行驗證性試驗每組做平行試驗3次。經(jīng)過感官評定，A2B2C3D1果酒色澤呈橙黃色、澄清透明，有明顯的檸檬清香和酒香，香氣協(xié)調(diào)怡人，酸甜適口、醇厚純凈、無異味，酒體協(xié)調(diào)，典型極佳風格良好，模糊數(shù)學感官評分82.63±0.09分，酒精度11.8%±0.2%vol；A2B2C2D1果酒色澤呈橙黃色、澄清透明，檸檬清香和酒香協(xié)調(diào)性一般，口感醇厚純凈，酒體協(xié)調(diào)，風格良好，模糊數(shù)學感官評分80.12±0.12分，酒精度9.5%±0.1%vol。經(jīng)過驗證性試驗A2B2C3D1組從感官以及酒精度都優(yōu)于A2B2C2D1組。

2.5 有效成分含量測定

將最優(yōu)工藝發(fā)酵的檸檬果酒置于10 ℃條件下陳釀120 d，使用超高效液相色譜法測定發(fā)酵檸檬果酒中含有圣草次苷455.685 mg/L、蕓香苷4.566 mg/L、柚皮苷12.365 mg/L、橙皮苷6.483 mg/L、新橙皮苷42.411 mg/L、地奧司明11.077 mg/L和柚皮素2.882 mg/L。

3 結(jié)論

由主成分綜合評價模型和正交試驗獲得最優(yōu)配方為糖度20%、酵母添加量0.13%、料液比1∶0.3 g/mL、發(fā)酵時間13 d，其感官和酒精度較好，顏色呈橙黃色，澄清透明，具有檸檬清香和酒香，酒精度為11.8%±0.2%vol，且含有圣草次苷455.685 mg/L、蕓香苷4.566 mg/L、柚皮苷12.365 mg/L、橙皮苷6.483 mg/L、新橙皮苷42.411 mg/L、地奧司明11.077 mg/L和柚皮素2.882 mg/L，具有較好的食用及保健價值。