羊精漿生化指標(biāo)與精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)相關(guān)性分析

張 彥，李春艷，孫智鵬，王詩(shī)佳，陳亞樂，孟 祝，張子軍

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，安徽合肥 230036）

正常精液約含5% 精子（以及伴隨細(xì)胞）和95%精漿。精漿作為精液非細(xì)胞液體部分，主要由精囊腺（貢獻(xiàn)65% 的精漿）以及睪丸、附睪、前列腺、尿道球囊腺和尿道周圍腺和輸精管壺腹部的分泌物形成，精漿富含蛋白質(zhì)、糖類、脂質(zhì)、無機(jī)離子（如Ca、Mg、K、Zn、Na）以及小分子代謝物等，保障精子存活、運(yùn)動(dòng)和受精。精漿也可通過修飾排卵前卵泡內(nèi)分泌-免疫-細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，縮短LH 峰值和排卵時(shí)間點(diǎn)之間的間隔，促進(jìn)排卵，促進(jìn)子宮-輸卵管連接處以及子宮中與精子運(yùn)輸和保護(hù)相關(guān)基因的表達(dá)變化。精液成分評(píng)估常被用于表征與雄性不育相關(guān)的精子質(zhì)量和病理狀態(tài)，如精漿Fe過量或不足會(huì)導(dǎo)致精子形成缺陷和男性生育障礙。精漿酶如-谷酰基轉(zhuǎn)移酶（GGT）、肌酸激酶（CK）和堿性磷酸酶（ALP）參與精子成熟過程中的各種代謝。GGT 主要通過降低氧化應(yīng)激來保護(hù)精子，CK 通過肌酸和磷酸肌酸之間化學(xué)轉(zhuǎn)換催化ATP再生；在病理狀態(tài)下如感染、炎癥或精索靜脈曲張，精漿酶濃度變化，引起氧化應(yīng)激，影響膜流動(dòng)性、滲透性，從而對(duì)精液成分和精子功能產(chǎn)生不利影響。精液尤其是精漿成分和性質(zhì)存在物種、品種和個(gè)體差異。研究顯示，不同品種的公豬精漿酶活（ALP、GGT、CK 以及乳酸脫氫酶LDH）和Ca濃度有顯著差異?；诖?，本研究檢測(cè)綿、山羊精漿14 項(xiàng)常規(guī)生化指標(biāo)和精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)，分析羊精漿生化指標(biāo)與精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)之間的關(guān)聯(lián)性，為羊精液質(zhì)量評(píng)價(jià)及繁殖潛力評(píng)估與監(jiān)測(cè)提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 樣本來源及采集處理 試驗(yàn)羊來自安徽省皇竹牧業(yè)科技有限公司種羊場(chǎng)，以放牧為主、補(bǔ)飼為輔，平均年齡2～3 歲，健康狀況良好，性欲旺盛。通過人工假陰道法分別采集13 只山羊精液和10 只綿羊精液。

1.2 精子質(zhì)量參數(shù)測(cè)定 精液液化后借助江淮分水嶺綜合試驗(yàn)站實(shí)驗(yàn)室的精子質(zhì)量輔助分析儀（CASA，SCAV-P-01 E200，西班牙Hamilton Thorne 公司）進(jìn)行精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)分析，并按照WHO 標(biāo)準(zhǔn)分析精子數(shù)、濃度、活力、曲線速率（VCL）、直線速率（VSL）、平均速率（VAP）、線性指數(shù)（LIN）、直線指數(shù)（STR）和擺動(dòng)指數(shù)（WOB）。

1.3 精漿生化指標(biāo)測(cè)定 精液樣本采用高速離心機(jī)（Xiangzhi TGL16M，長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）在4 ℃下4 000 r/min 離心10～15 min，取上清液，存于-80℃冰箱，用于檢測(cè)各項(xiàng)生化指標(biāo)。利用全自動(dòng)生化分析儀（Mindray BS-180VET，深圳邁瑞醫(yī)療國(guó)際有限公司）檢測(cè)羊精漿生化指標(biāo)。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、總蛋白（TP）、白蛋白（ALB）、球蛋白（GLB）、白蛋白/球蛋白（A/G）、肌酐（CREA-S）、鈣（Ca）、磷（P）、總膽固醇（TC）、甘油三酯（TG）、肌酸激酶（CK）、乳酸脫氫酶（LDH）和果糖胺（FUN）檢測(cè)試劑盒均為深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司（Mindray）產(chǎn)品。

1.4 統(tǒng)計(jì)統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)采用Excel 整理，利用IBM SPSS Statistics 26.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。羊精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)和相應(yīng)的精漿生化指標(biāo)值均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，使用經(jīng)典相關(guān)性分析，<0.05 表示相關(guān)性顯著，<0.01表示相關(guān)性極顯著。

2 結(jié)果

2.1 羊精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)檢測(cè) 表1 結(jié)果顯示，羊精子平均濃度達(dá)1 205.02×10/mL 及以上，平均活力在78%以上，山羊精子運(yùn)動(dòng)速率、運(yùn)動(dòng)指數(shù)與綿羊相似，其中直線速率達(dá)26.00 mm/s 以上。

表1 羊精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)檢測(cè)結(jié)果

2.2 羊精漿生化指標(biāo)檢測(cè) 表2 結(jié)果顯示，山羊精漿蛋白質(zhì)含量豐富，TP 為56.72 g/L，其中GLB 占76%以上，ALB 占TP 不到24%；此外，精漿含多種酶如ALT、AST、LDH 和CK，其中LDH 和CK 活性較高，分別為962.01 U/L 和 1 880.02 U/L，以及其他成分如TC、TG 和豐富的FUN。綿羊精漿TP 達(dá)28.04 g/L，其中GLB 含量占78%以上，ALB 占比不到22%；精漿也含ALT、AST、LDH 和CK 等多種酶，其中LDH 和CK活性較高，分別為1 957.30 U/L 和944.35 U/L；此外，精漿中還包含Ca、P 等微量元素以及TC、TG 和FUN等其他成分。

表2 羊精漿14 項(xiàng)生化指標(biāo)結(jié)果

另外，山羊與綿羊精漿生化指標(biāo)差異性比較結(jié)果顯示，山羊精漿TP、GLB、ALB、FUN、CK、CREA-S（<0.01）以及TC（<0.05）高于綿羊，而綿羊精漿LDH、TG、Ca、P 和ALT 高于山羊（<0.01）；精漿A/G 和AST 值無顯著差異。

2.3 山羊精漿生化指標(biāo)與精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)相關(guān)性 表3 結(jié)果顯示，山羊精漿TP 與精子數(shù)呈正相關(guān)、與精子濃度和活力呈負(fù)相關(guān)。其中，ALB、A/G 與精子數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與精子活力呈極顯著負(fù)相關(guān)，與VCL 呈顯著負(fù)相關(guān)，與精子濃度呈正相關(guān)；GLB 和精子數(shù)、濃度、活力、運(yùn)動(dòng)速率的相關(guān)性趨勢(shì)則與ALB 或A/G 相反。精漿Ca和精子數(shù)、濃度、活力、運(yùn)動(dòng)速率的相關(guān)性趨勢(shì)與P 的亦相反。FUN 與精子活力及運(yùn)動(dòng)速率呈正相關(guān)，F(xiàn)UN與VCL 或VAP 相關(guān)性顯著（<0.05）。精漿中不同酶與精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)相關(guān)性各異。

表3 山羊精漿生化指標(biāo)與精子質(zhì)量參數(shù)相關(guān)性

2.4 綿羊精漿生化指標(biāo)與精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)相關(guān)性 表4 結(jié)果顯示，綿羊精漿TP 和ALB 與精子數(shù)量、濃度和活力呈正相關(guān)，與精子運(yùn)動(dòng)速率呈負(fù)相關(guān)，GLB 則與精子運(yùn)動(dòng)速率呈正相關(guān)。精漿Ca 和精子運(yùn)動(dòng)速率相關(guān)性趨勢(shì)與P 的相反。FUN 或LDH 與精子活力呈正相關(guān)。精漿酶ALT 與精子VCL 呈正相關(guān)（<0.05），AST 與LIN 呈正相關(guān)（<0.05）；CREA-S 則與各項(xiàng)精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)均呈負(fù)相關(guān)。

表4 綿羊精漿生化指標(biāo)與精子質(zhì)量參數(shù)相關(guān)性

3 討論

睪丸中生成的精子雖然形態(tài)完整，但其必須經(jīng)歷附睪成熟過程才能獲得活力和受精能力。精子活力是精子功能的基本參數(shù)之一，對(duì)雄性生育力至關(guān)重要。低振幅對(duì)稱尾部運(yùn)動(dòng)表明精子具活力，驅(qū)使精子在非黏性介質(zhì)（精漿）中沿直線運(yùn)動(dòng)；精子進(jìn)入輸卵管后，高振幅和不對(duì)稱鞭毛彎曲即超激活運(yùn)動(dòng)使精子克服黏稠液體，脫離輸卵管上皮和穿透卵母細(xì)胞透明帶。精子運(yùn)動(dòng)的動(dòng)力來源主要依靠其中段線粒體氧化磷酸化以及軸絲動(dòng)力蛋白ATP 酶轉(zhuǎn)化ATP 供能。此外，微環(huán)境pH、特殊分子、離子濃度等變化也會(huì)刺激精子超激活運(yùn)動(dòng)。本實(shí)驗(yàn)借助CASA 系統(tǒng)并按WHO 標(biāo)準(zhǔn)分析羊精子活力，發(fā)現(xiàn)綿、山羊鮮精的活力均達(dá)78% 以上，符合羊鮮精活力基本要求。

哺乳動(dòng)物精漿作為精子載體，其包含一系列蛋白/酶和非酶成分，表征精子代謝和功能。附睪管分泌蛋白質(zhì)、連同磷脂質(zhì)一起包被于精子表面，形成脂蛋白膜以保護(hù)精子；附睪體分泌前動(dòng)蛋白以促進(jìn)精子直線運(yùn)動(dòng)，雄激素依賴蛋白則使精子獲得與透明帶結(jié)合能力，附睪上皮分泌蛋白有助于吸收來自睪丸精子懸浮液中水分和電解質(zhì)，從而提高精子濃度等。近期研究表明，精漿蛋白質(zhì)如膜結(jié)合G 蛋白偶聯(lián)受體影響附睪精子成熟過程，精漿G 蛋白偶聯(lián)受體水平與精子總數(shù)、精子濃度、活力以及精子形態(tài)等常規(guī)質(zhì)量參數(shù)呈現(xiàn)正相關(guān)。精漿超氧化物歧化酶（SOD）亞型如錳超氧化物歧化酶（MnSOD）、銅鋅超氧化物歧化酶（CuZnSOD）與精子活力呈正相關(guān)，MnSOD 表達(dá)與精子數(shù)呈正相關(guān)；相反，精漿谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）表達(dá)與精子形態(tài)和活力呈負(fù)相關(guān)。本研究表明，綿羊精漿TP 與精子數(shù)、精子活力呈正相關(guān)；山羊精漿TP 與精子數(shù)呈正相關(guān)，而與精子活力呈負(fù)相關(guān)。精子形成受協(xié)同和部分重疊機(jī)制調(diào)控，涉及睪丸內(nèi)睪酮、FSH 及LH。FSH影響支持細(xì)胞分化，睪丸FSH 誘導(dǎo)支持細(xì)胞分泌抗凋亡存活因子和黏附分子，這大部分分泌物進(jìn)入管腔室（Adluminal Space），促進(jìn)精細(xì)胞存活及成熟。Collodel 等對(duì)不同家畜（馬、豬）的精漿生化成分分析，結(jié)果顯示ALP 和LDH 為精子存活、運(yùn)動(dòng)以及生育提供能量，GGT、CK 和ALP 與精子質(zhì)量和精膜功能相關(guān)：GGT 通過應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激保護(hù)附睪精子運(yùn)動(dòng)，CK催化磷酸肌酸和促進(jìn)ATP 再生，ALP 能防止精子過早獲能。FUN 是葡萄糖和蛋白質(zhì)賴氨酸殘基-氨基之間非酶反應(yīng)的穩(wěn)定產(chǎn)物，血清FUN 主要反映血糖水平，可維持滲透壓及減少氧化損傷，也間接反映血脂狀況；精漿FUN 涉及精子獲能、頂體反應(yīng)和配子互作，濃度降低引起雄性不育。精漿FUN 濃度通常比血清中低2～3 倍，正常人精漿FUN 濃度范圍為0.15～0.75 mmol/L，牛精漿FUN 濃度達(dá)0.77 mmol/L，而本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)到綿、山羊精漿FUN 分別為0.21、0.32 mmol/L，提示精漿FUN 濃度具有物種差異性。此外，精漿含有許多蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)似乎對(duì)精子生存和功能提供適宜微環(huán)境很重要。ALB 作為一種重要的非酶蛋白，通過其多重結(jié)合位點(diǎn)和自由基捕獲特性發(fā)揮作用。人體組織間隙液中ALB 濃度范圍為7.00～30.00 mg/mL，血漿中ALB濃度為34.00～54.00 mg/mL，而精液中ALB 濃度僅為1.00 mg/mL。ALB 被認(rèn)為是運(yùn)輸激素、代謝物和藥物，是一種循環(huán)抗氧化劑，中性粒（白）細(xì)胞及精子中ALB 直接結(jié)合hHv1 來激活離子通道，增強(qiáng)H外流和促進(jìn)獲能；精漿ALB 主要由支持細(xì)胞產(chǎn)生，其與生精狀態(tài)、精子數(shù)、形態(tài)正常精子百分比及精子濃度呈正相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果表明，綿、山羊精漿ALB 濃度分別達(dá)5.92、13.23 g/L，其與精子濃度及WOB 呈正相關(guān)，而豬精子WOB 比值隨獲能時(shí)間依賴性增大。這些結(jié)果提示動(dòng)物精漿ALB 對(duì)精子產(chǎn)生和獲能具有重要的間接作用。

精漿微量元素對(duì)精子正常功能必不可少。研究表明，精漿含Ca、Mg、Zn、K 和Na 等多種微量元素。Ca 主要通過誘導(dǎo)頂體反應(yīng)參與受精過程，同時(shí)刺激睪丸間質(zhì)細(xì)胞類固醇生成。細(xì)胞Ca 通過調(diào)節(jié)ATP 可用率來調(diào)節(jié)精子獲能和超活化，胞內(nèi)Ca水平過高引起頂體胞吐和生育力下降。相關(guān)性研究表明，馬精漿Ca 水平為1.78～6.27 mmol/L，與精液量、pH 及精子濃度呈正相關(guān)；精子正常和其活力異常的男性精漿Ca水平分別達(dá)0.29、0.17 mmol/L，二者差異水平顯著，精漿Ca水平下降可引起精子活力下降；然而也有研究發(fā)現(xiàn)精子正常和其活力異常的精漿Ca 水平無顯著差異，其范圍在4.95～6.12 mmol/L，且與精子質(zhì)量不相關(guān)。綿羊、山羊精漿Ca 水平分別達(dá)2.54、1.61 mmol/L，差異顯著，與精子活力及運(yùn)動(dòng)速率呈負(fù)相關(guān)；山羊精漿Ca 與精子數(shù)量及濃度呈正相關(guān)。P 在雄性動(dòng)物繁殖方面具有多種有益作用，其磷酸鹽離子形式對(duì)前列腺酸性磷酸酶活性至關(guān)重要，與精液液化過程及腺苷酸環(huán)化酶相關(guān)，是精子活力的初級(jí)調(diào)控者。綿羊精漿P 水平大致為5.85 mmol/L，山羊?yàn)?.64 mmol/L；都與精子數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與精子運(yùn)動(dòng)速率呈正相關(guān)。而正常男性精液P水平達(dá)466.26 mmol/L，病變精液（畸形精子癥）中P水平顯著下降，且與凋亡標(biāo)記Caspases 呈正相關(guān)，提示精漿P 水平的物種差異及其對(duì)維持精子正常形態(tài)的重要性。

4 結(jié)論

綜合上述結(jié)果，羊精漿含有蛋白質(zhì)、酶、膽固醇、甘油三酯、微量元素等多種生化成分，部分成分與精子質(zhì)量常規(guī)參數(shù)緊密相關(guān)，表明這些成分可能在活化、稀釋、營(yíng)養(yǎng)和保護(hù)精子過程中起作用，為羊精液質(zhì)量評(píng)價(jià)及繁殖潛力評(píng)估與監(jiān)測(cè)奠定一定的理論基礎(chǔ)。