腦膜炎奈瑟菌核酸檢測試劑國家參考品的研制

李江姣，劉茹鳳，李康，黃洋，徐瀟，石繼春，王春娥，梁麗，陳馳，葉強

·技術(shù)與方法·

腦膜炎奈瑟菌核酸檢測試劑國家參考品的研制

李江姣*，劉茹鳳*，李康，黃洋，徐瀟，石繼春，王春娥，梁麗，陳馳，葉強

腦膜炎奈瑟菌（，Nm），又名腦膜炎雙球菌或腦脊髓膜炎雙球菌，是一種革蘭氏陰性菌，根據(jù)莢膜多糖可分為 A、B、C、D、X、Y、Z、29E、W135、L、H、I、K 等 13 個血清群，主要寄居在人體鼻咽部，可通過飛沫傳播。人感染腦膜炎奈瑟菌可引起敗血癥或流行性腦脊髓膜炎（簡稱流腦）等急性呼吸道傳染病，常伴隨著較高的死亡率[1-3]。建立高效的 Nm 檢測方法對流腦的臨床診斷有重要的意義。

流腦的常規(guī)診斷方法是從腦脊液和血液中分離出病原菌，而傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法檢測時間較長，Nm 易在標(biāo)本運輸過程中死亡，當(dāng)患者接受抗菌藥物治療以及受其他非特異性因素的影響時，會引起細(xì)菌分離的失敗，降低細(xì)菌培養(yǎng)法的準(zhǔn)確性，因此采用敏感性更高的檢測方法變得十分重要。近年來，核酸檢測技術(shù)因其快速、靈敏等特點被廣泛應(yīng)用于臨床檢測。利用核酸檢測技術(shù)檢測 Nm 的敏感性和特異性高，經(jīng)濟成本低，為 Nm 的檢測提供了重要的技術(shù)手段[4-6]。因各種檢測試劑的取樣量及選取的目的基因片段不同，其檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性及靈敏度等存在差異。由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一的國家參考品，使得該類檢測試劑的質(zhì)量控制和評價成為難題。本研究擬研制一套腦膜炎奈瑟菌國家參考品，提升對腦膜炎奈瑟菌核酸檢測試劑的質(zhì)量控制和評價水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑及儀器 GC 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血紅蛋白粉均購自美國 BD 公司；中國細(xì)菌濁度國家標(biāo)準(zhǔn)品來源于中國食品藥品檢定研究院；腦膜炎奈瑟菌核酸檢測試劑盒 A（批號：20200501）、試劑盒 B（批號：P20200701）和試劑盒 C（批號：20200601）分別來自 3 家腦膜炎奈瑟菌核酸檢測試劑生產(chǎn)企業(yè)；培養(yǎng)箱 5810E 購自美國 Nuaire 公司；ABI 7500 實時熒光定量 PCR 儀購自美國 ABI 公司。

1.1.2 菌株 10 株陽性參考品菌株腦膜炎奈瑟菌均來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，編號分別為：CMCC(B)29015、CMCC(B)29016、CMCC(B)29031、CMCC(B)29050、CMCC(B)29051、CMCC(B)29052、CMCC(B)29055、CMCC(B)29043、CMCC(B)29046、CMCC(B)29028；10 株陰性參考品菌株也來源于中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心，分別為：流感嗜血桿菌 CMCC(B)58561、肺炎克雷伯 CMCC(B)46117、銅綠假單胞菌 CMCC(B)10104、金黃色葡萄球菌 CMCC(B)26001、肺炎鏈球菌 CMCC(B)31001、A 族鏈球菌 CMCC(B)32067、白喉棒桿菌 CMCC(B)38102、卡他布朗漢姆氏菌 CMCC(B)29118、百日咳 CMCC(B)58039、大腸桿菌 CMCC(B)44113。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將各菌株接種于適宜生長的培養(yǎng)基上，于最適溫度條件下進行培養(yǎng)和傳代。取新鮮的固體培養(yǎng)物或液體培養(yǎng)物沉淀，用無菌生理鹽水重懸制成菌懸液，采用比濁法或平皿計數(shù)法測定濃度，采用適宜溫度進行熱滅活，并對滅活效果進行驗證。

1.2.2 參考品制備

1.2.2.1 陽性參考品 將 10 株腦膜炎奈瑟菌原菌液稀釋至 1 × 106個/ml，定量分裝，0.5 ml/管，–20 ℃以下保存，標(biāo)記為 P1 ～ P10。

1.2.2.2 陰性參考品 流感嗜血桿菌原菌液稀釋至1 × 106個/ml，其余 9 株陰性參考品原菌液稀釋至 1 × 107個/ml，定量分裝 0.5 ml/管，–20 ℃以下保存，標(biāo)記為 N1 ～ N10。

1.2.2.3 重復(fù)性參考品和最低檢出限參考品 將腦膜炎奈瑟菌原菌液（CMCC 29052）稀釋至 1 × 106個/ml，定量分裝，0.8 ml/管，–20 ℃以下保存，分別標(biāo)記為 R 和 S。

1.2.3 均勻性檢測 隨機抽取陽性參考品、最低檢出限參考品各 10 支，重復(fù)性參考品 15 支，用腦膜炎奈瑟菌核酸檢測試劑盒 B 進行檢測，計算 Ct 值的 CV 值。

1.2.4 穩(wěn)定性檢測 將陽性參考品、精密性參考品、最低檢出限參考品分別于2 ～ 8 ℃、25 ℃、37 ℃放置 3、7 和 14 d，反復(fù)凍融 3 次、5 次，以–20 ℃冰箱中保存的參考品作為對照，用試劑盒 A 進行檢測，考察參考品于不同溫度下放置不同時間及反復(fù)凍融的穩(wěn)定性。

1.2.5 參考品驗證

1.2.5.1 準(zhǔn)確性驗證 將陽性參考品分別用滅菌生理鹽水進行 10 倍稀釋，標(biāo)記為 P1 ～ P10，分別用試劑盒 A、試劑盒 B 和試劑盒 C 進行檢測，每份樣本平行檢測 2 次。每個試劑盒進行 2 次獨立實驗。

1.2.5.2 特異性驗證 將陰性參考品分別用滅菌生理鹽水 10 倍稀釋，標(biāo)記為N1 ～ N10，分別用試劑盒 A、試劑盒 B 和試劑盒 C 進行檢測，每份樣本平行檢測 2 次。每個試劑盒進行 2 次獨立實驗。

1.2.5.3 重復(fù)性驗證 將重復(fù)性參考品（10 支）分別用滅菌生理鹽水 10 倍稀釋，標(biāo)記為 R，分別用試劑盒 A、試劑盒 B 和試劑盒 C 進行檢測，每份樣本平行檢測 2 次，重復(fù)檢測 10 次。每個試劑盒進行 2 次獨立實驗。

1.2.5.4 最低檢出限驗證 取最低檢出限參考品（1 ×106個/ml），用滅菌生理鹽水進行系列稀釋，檢測試劑盒 A、B、C 的最低檢出限。

2 結(jié)果

2.1 參考品的分裝均勻性評估

試驗結(jié)果（表1）顯示，各陽性參考品、最低檢出限參考品 Ct 值的 CV（n = 10）、重復(fù)性參考品 Ct 值的 CV（n = 15）均在 5.0% 以內(nèi)，說明參考品的分裝均勻度良好。

2.2 參考品的穩(wěn)定性評估

2.2.1 凍融穩(wěn)定性評估 經(jīng)反復(fù)凍融 3、5 次處理后，與–20 ℃保存對照參考相比，Ct 值變化不大，表明本參考品具有較好的凍融穩(wěn)定性（圖1）。

表1 參考品分裝均勻性評估

樣品CtSDCV（%） P126.290.240.93 P225.100.351.39 P326.380.230.86 P428.050.321.14 P525.100.250.98 P623.530.301.27 P724.750.150.59 P824.190.291.18 P925.810.773.00 P1025.010.311.23 S25.450.150.58 R25.650.210.81

2.2.2 加速穩(wěn)定性評估 將參考品分別于 2 ～ 8 ℃、25 ℃、37 ℃放置 3、7、14 d 后，與–20 ℃保存對照參考相比，Ct 值變化不大，表明本參考品具有較好的加速穩(wěn)定性，可以滿足運輸、使用等的穩(wěn)定性要求（圖2）。

2.3 參考品的適用性驗證

采用 3 家企業(yè)的試劑盒對制備參考品進行驗證。結(jié)果顯示，各試劑盒的準(zhǔn)確性、特異性及重復(fù)性檢測結(jié)果均符合要求。試劑盒 A、試劑盒 B 和試劑盒 C 的陽性參考品符合率均為 10/10；陰性參考品符合率均為 10/10；重復(fù)性參考品 10 次檢測的 Ct 值的 CV 值均小于 5%。試劑盒 A和 B 的最低檢出限為 1.0 × 103個/ml，試劑盒 C 的最低檢出限為 1.0 × 104個/ml（表2）。

圖1 凍融穩(wěn)定性評估結(jié)果（1 × 104和 1 × 103分別表示將最低檢出限參考品稀釋為 1 × 104個/ml 和 1 × 103個/ml）

圖2 加速穩(wěn)定性評估結(jié)果（1 × 104和 1 × 103分別表示將最低檢出限參考品稀釋為 1 × 104個/ml 和 1 × 103個/ml）

表2 參考品適用性檢測

試劑盒P1 ～ P10N1 ～ N10CV（%）1.0 × 104（個/ml）1.0 × 103（個/ml）1.0 × 102（個/ml） A10/1010/101.49++- B10/1010/100.70++- C10/1010/100.50+--

注：“+”表示檢出；“-”表示未檢出。

3 討論

核酸診斷試劑的質(zhì)量關(guān)乎病原體的檢測效率和準(zhǔn)確性，而其質(zhì)量評價依賴于科學(xué)、公正的國家參考品[7]。因相關(guān)參考品的缺乏，本研究研制了腦膜炎奈瑟菌核酸檢測試劑國家參考品。在菌株篩選方面，從中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心選擇 10 種不同血清型的腦膜炎奈瑟菌作為 10 個陽性參考菌株，使各陽性菌株具有充分多樣性。陰性菌株在選擇時，充分考慮與腦膜炎奈瑟菌感染部位相同或感染癥狀相似的病原菌，以及一些常見的其他病原體，從而排除非腦膜炎奈瑟菌的干擾。

本研究建立的腦膜炎奈瑟菌核酸檢測試劑國家參考品由滅活菌懸液制成，一套參考品包括 10 個陽性參考品、10 個陰性參考品、1 個最低檢出限參考品和 3 個重復(fù)性參考品。參考品的均勻性檢測結(jié)果顯示，各陽性參考品、重復(fù)性參考品和最低檢出限參考品 Ct 值的 CV 均在 5.0% 以內(nèi)，說明參考品的分裝均勻度良好。穩(wěn)定性檢測結(jié)果表明，參考品經(jīng)反復(fù)凍融 3、5 次處理，以及 2 ～ 8 ℃、25 ℃、37 ℃放置 3、7、14 d，具有較好的穩(wěn)定性，可以滿足運輸、使用等的穩(wěn)定性要求。使用 3 家企業(yè)生產(chǎn)的試劑盒對參考品進行適用性驗證，結(jié)果表明其準(zhǔn)確性、特異性和重復(fù)性均滿足要求，最低檢出限檢測結(jié)果顯示各企業(yè)試劑盒的最低檢出限存在差異。

綜上所述，本研究制備的腦膜炎奈瑟菌核酸檢測試劑國家參考品具有良好的均勻性和穩(wěn)定性，經(jīng)驗證具有良好的準(zhǔn)確性、特異性和重復(fù)性，能夠用于腦膜炎奈瑟菌核酸檢測試劑的質(zhì)量控制和性能評價。

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10.3969/j.issn.1673-713X.2022.03.013

“十三五”國家科技重大專項（2018ZX10102-001-002、2018ZX09738006-006）；國家科技基礎(chǔ)條件平臺——國家菌種資源庫課題（NMRC-2020-2）

102629 北京，中國食品藥品檢定研究院中國醫(yī)學(xué)細(xì)菌保藏管理中心

葉強，Email：qiangyee@nifdc.org.cn

2021-09-27

*同為第一作者