番石榴葉和果實(shí)揮發(fā)油化學(xué)成分的GC×GC/TOF MS分析

梁海玲，尹本濤，周 靜，劉 劍，邱樹毅，姬厚偉，徐楊斌，張長云

(1.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，貴州 貴陽 550009；2.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550025；3.貴州中煙工業(yè)有限責(zé)任公司遵義卷煙廠，貴州 遵義 563000;4.貴州省煙草科學(xué)研究院，貴州 貴陽 550081)

0 引言

番石榴(PsidiumguajavaL.)為桃金娘科番石榴屬植物，是熱帶常綠小喬木或灌木，又名芭樂、喇叭果、雞矢果、香稔、長稔、番桃樹，原產(chǎn)于熱帶美洲，17世紀(jì)隨西班牙、葡萄牙殖民者傳至全球熱帶和亞熱帶各個角落[1-3]。近年來，我國廣西、福建、臺灣、海南、廣東等地從臺灣地區(qū)引種種植。番石榴甘、澀、平，可用于治療收斂止瀉，消炎止血。葉、果用于治療急、慢性腸炎、痢疾、小兒消化不良；鮮葉治用治跌打損傷、外傷出血、臁瘡久不愈合[4-7]。

在國內(nèi)外諸多文獻(xiàn)報道中，對其化學(xué)成分的研究主要集中于番石榴的葉的化學(xué)成分、功能成分、提取分離、抗氧化性、藥理作用等方面[8-16]。國內(nèi)外對番石榴葉與果實(shí)的化學(xué)成分對比研究鮮有報道，也未見運(yùn)用全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜(GC×GC/TOF MS)方法對番石榴葉和果實(shí)的揮發(fā)油進(jìn)行研究。因此，本文采用固相微萃取法分別提取番石榴葉和果實(shí)的揮發(fā)油，建立一種GC×GC/TOF MS方法對提取到的揮發(fā)油進(jìn)行化學(xué)成分分析與比較，旨在為番石榴葉和果實(shí)揮發(fā)油資源的開發(fā)利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑、材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

本實(shí)驗(yàn)收集了番石榴的鮮葉和新鮮果實(shí)，均為臺灣珍珠品種(芭樂)購于廣東澄海隆都鎮(zhèn)(澄海隆都鎮(zhèn)為最早引進(jìn)臺灣珍珠番石榴的種植基地)。丙酮，色譜純，購天津市登科化學(xué)試劑有限公司；液氮，購貴州申建氣體有限公司；高純氦氣(99.999 5%)，購貴州申建氣體有限公司；高純氮?dú)?99.999 5%)，購貴州申建氣體有限公司；壓縮空氣，由HYG-30氣源發(fā)生器提供，淄博宏潤工貿(mào)有限公司制造。

1.1.2 儀器設(shè)備

全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜聯(lián)用儀(PEGASUS 4D GC×GC TOF MS)，美國LECO公司；氣相色譜部分采用Agilent公司的7890A GC SYSTEM；調(diào)制器部分：雙階段四噴口調(diào)制器；液位控制器：AMI model 186；冷卻劑：液氮；熱調(diào)制氣：壓縮空氣；冷調(diào)制氣：高純氮?dú)猓粩?shù)據(jù)處理：LECO Chroma TOF 工作站，版本：version 4.32 optimizaed for Pegasus。

手動固相微萃取裝置，萃取纖維頭為：65 μm PDMS/DVB(聚二甲基硅氧烷/二乙烯苯)，美國Supelco公司；電子天平，AG-104 量感0.000 1 g，Mettler Toledo公司；小型中草藥粉碎機(jī)，XFB-200，長沙雨花中誠制藥機(jī)械廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 固相微萃取法提取番石榴葉和果實(shí)的揮發(fā)油

將番石榴葉自然陰干，使用小型中草藥粉碎機(jī)進(jìn)行研磨，控制研磨時間，以免研磨時間過長造成的溫度升高。粉碎后過40目篩，粉末裝入棕色瓶中密封備用。用電子天平準(zhǔn)確稱取0.8 g番石榴葉粉末，加入10 mL的頂空瓶中；將番石榴果實(shí)洗凈去籽后均勻切片，自然陰干，裝入棕色瓶中密封備用，將陰干的番石榴果片切至碎丁，用電子天平準(zhǔn)確稱取0.6 g，加入10 mL的頂空瓶中，萃取溫度80 ℃，平衡時間15 min，采用65 μm PDMS/DVB纖維頭頂空萃取，萃取時間30 min，然后取出萃取頭直接插入全二維氣相色譜進(jìn)樣口，進(jìn)行脫附解析，進(jìn)樣口溫度250 ℃，脫附時間2 min。

1.2.2 GC×GC/TOF MS條件

GC×GC條件：1)一維色譜柱：Rxi-5sil MS(30 m×0.25 mmi.d.×0.25 μmd.f.)，美國RESTEK公司；2)二維色譜柱：Rtx-200(1.6 m×0.18 mmi.d.×0.2 μmd.f.)，美國RESTEK公司；載氣：高純氦氣(99.999 5%)；載氣流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；進(jìn)樣方式：手動進(jìn)樣，分流比100∶1；升溫程序：一維色譜柱爐箱：初始溫度80 ℃，保持0.2 min，以3 ℃/min的速率升至260 ℃，再保持10 min；二維色譜柱爐箱：初始溫度95 ℃，保持0.2 min，以3 ℃/min的速率升至275 ℃，再保持10 min；調(diào)制器溫度補(bǔ)償：30 ℃；調(diào)制周期：4.0 s(其中兩次熱調(diào)制時間各占0.8 s，兩次冷調(diào)制時間各占1.2 s)。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源(EI)，電離能量：70 eV；離子源溫度：220 ℃，傳輸線溫度：250 ℃；掃描范圍：m/z35～500；檢測器電壓：1 450 V；數(shù)據(jù)采集頻率：100 spetra/s；調(diào)諧方式：系統(tǒng)自動調(diào)諧。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理方法

數(shù)據(jù)處理采用LECO公司的Chroma TOF 工作站軟件(version 4.32)，譜圖由軟件自動生成，軟件自動識別信噪比(S/N)大于100的色譜峰，質(zhì)譜閥值為20，合峰匹配度為600，采用Nist08譜庫檢索進(jìn)行定性，所得的質(zhì)譜峰表數(shù)據(jù)經(jīng)Microsoft Office Excel軟件(2007版)進(jìn)一步處理后得到定性結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 全二維氣相色譜分析方法的建立

氣相色譜的優(yōu)化涉及到色譜熱力學(xué)和動力學(xué)等方面，只有優(yōu)化過的色譜柱系統(tǒng)才能在實(shí)際應(yīng)用中獲得真正的最佳操作條件。在全二維氣相色譜(GC×GC)中需要優(yōu)化到的參數(shù)主要包括色譜柱系統(tǒng)、初始溫度和升溫程序、調(diào)制器參數(shù)等。但在給定的柱系統(tǒng)條件下，在實(shí)際分析中最常用的優(yōu)化因素是柱溫。線性程序升溫是被普遍采用的柱溫形式，程序升溫速度一般不超過5 ℃/min。

2.1.1 柱系統(tǒng)的選擇

在GC×GC中，兩根柱子分離機(jī)理的正交性很重要。因?yàn)檎环蛛x不僅可以有效地利用分離空間，得到比非正交分離更快的速度或更大的峰容量，而且如果能實(shí)現(xiàn)正交分離，其二維的保留值是由兩個不同的、相互獨(dú)立的分離機(jī)理決定，能提供相互獨(dú)立的分子性質(zhì)如分子的揮發(fā)性或極性等。因此，第一維色譜柱選擇了非極性或弱極性柱，第二維色譜柱選擇了中等極性或極性柱，通過對兩組色譜柱(見表1)進(jìn)行試驗(yàn)比較，第一套色譜柱系統(tǒng)能夠較好的把樣品的各種組分比較均勻地分布在二維平面上，而第二套色譜柱系統(tǒng)則主要沿第一維分布，在第二維上沒有很好的分開，不能夠充分利用全二維氣相色譜峰容量大的優(yōu)勢，所以最后決定采用第一套色譜柱系統(tǒng)來進(jìn)行分析樣品。

2.1.2 初始溫度的選擇

初始溫度的高低，會影響先流出組分的分離，但初始溫度的高低對后流出組分的分離幾乎沒有影響。如果選用較低的初始溫度時，樣品的分析時間會較長。由于先流出組分并不復(fù)雜，全二維氣相色譜GC×GC比普通的一維氣相色譜分離效果要好，所以在保證分離效果的前提下，應(yīng)該盡量提高初始溫度以縮短整個分析過程的時間。通過采用60 ℃、80 ℃ 2種初始溫度分別進(jìn)行了試驗(yàn)，得到2種初始溫度對先流出組分的分離效果影響不大，并不影響先流出組分的分離。初始溫度選擇在80 ℃時仍然可以滿足本次實(shí)驗(yàn)的分離要求，所以最后決定選用80 ℃作為初始溫度。

2.1.3 升溫程序的優(yōu)化

在全二維氣相色譜中，待測物組分在第二維色譜柱中的保留時間只有幾秒鐘，因此幾乎可以認(rèn)為是在恒溫的狀態(tài)下進(jìn)行的，所以第一維色譜柱的流出溫度決定了第二維色譜柱的保留時間。全二維氣相色譜調(diào)制要求一維色譜柱產(chǎn)生一個比二維色譜柱相對較寬的峰，因此升溫速率不能太快，不然會降低一維色譜柱的分辨率。為了找到一個比較合適的升溫速率，以下實(shí)驗(yàn)是在其它參數(shù)保持不變的情況下，分別設(shè)置3種不同的升溫速率：3 ℃/min、4 ℃/min、5 ℃/min，來觀察同一樣品中各個組分的分離情況。當(dāng)升溫速率設(shè)置在3 ℃/min時，樣品中的各個組分已經(jīng)可以得到很好的分離，因此，選擇了3 ℃/min作為一維色譜柱爐箱和二維色譜柱爐箱的升溫速率。

2.1.4 調(diào)制器參數(shù)優(yōu)化

全二維氣相色譜的調(diào)制器中，冷調(diào)制氣和熱調(diào)制氣分別起吸附和脫附作用。調(diào)制時間一般在2～10 s，2股冷調(diào)制氣各占30%，2股熱調(diào)制氣各占20%。如果分析的樣品不太復(fù)雜，應(yīng)該選擇盡可能短的調(diào)制時間，但是必須保證化學(xué)性質(zhì)相近的各種組分能夠在調(diào)制周期內(nèi)流出第二維色譜柱，否則前一周期的后流出組分可能會與后一周期的先流出組分重疊，不能得到較好的正交分離結(jié)果。通過分別設(shè)置3種不同的調(diào)制周期：4 s、6 s、8 s，來觀察同一樣品中各種組分在分離平面上的分布情況。當(dāng)調(diào)制器的調(diào)制周期設(shè)定在4 s的時候，樣品中的各種組分在分離平面上分布均勻、清晰，更加適合用于定性分析。因此，選擇4 s作為調(diào)制器的調(diào)制周期。

2.2 番石榴葉和果實(shí)的揮發(fā)油成分

通過對以上幾個全二維氣相色譜的重要條件參數(shù)進(jìn)行試驗(yàn)并優(yōu)化選擇后，建立了用于分析番石榴葉和果實(shí)揮發(fā)油的全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜法。采用該方法分別對番石榴葉和果實(shí)樣品中揮發(fā)油的化學(xué)成分進(jìn)行了分析，番石榴葉揮發(fā)油中化學(xué)成分的全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜法的總離子流圖、等高線氣泡圖、三維立體圖，如圖1、圖2、圖3所示；番石榴果實(shí)揮發(fā)油中化學(xué)成分的全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜法的總離子流圖、等高線氣泡圖、三維立體圖，如圖4、圖5、圖6所示。

圖1 番石榴葉揮發(fā)油中化學(xué)成分的總離子流色譜圖

圖2 番石榴葉揮發(fā)油中化學(xué)成分的等高線氣泡圖

圖3 番石榴葉揮發(fā)油中化學(xué)成分的三維立體圖

圖4 番石榴果實(shí)揮發(fā)油中化學(xué)成分的總離子流色譜圖

圖5 番石榴果實(shí)揮發(fā)油中化學(xué)成分的等高線氣泡圖

圖6 番石榴果實(shí)揮發(fā)油中化學(xué)成分的三維立體圖

從番石榴葉揮發(fā)油中總共鑒定出193個組分峰，鑒定出匹配度大于800的組分有139個，匹配度大于850的組分有100個，匹配度大于900的組分有50個。在匹配度大于800的139個組分中(占總峰面積的93.47%)，分別有醇類有26個，烯類有38個，酯類有9個，醛類有6個，酮類有15個，酸類有5個，其它類有40個。在這193種組分中，相對百分含量大于0.1%的組分共有81種，分析顯示石竹烯(18.06%)、去氫白菖烯(10.08%)、α-蒎烯(6.07%)、雙戊烯(5.41%)、α-石竹烯(4.27%)、桉樹醇(3.30%)、蘭桉醇(2.75%)、苯甲醛(2.72%)等，化學(xué)成分相對含量較高。

從番石榴果實(shí)揮發(fā)油中總共鑒定出149個組分峰，鑒定出匹配度大于800的組分有114個，匹配度大于850的組分有93個，匹配度大于900的組分有45個。在匹配度大于800的114個組分中(占總峰面積的98.31%)，分別有醇類有17個，烯類有21個，酮類有15個，醛類有10個，醚類有3個，酸類有7個，酯類有14個，其它類有27個。在這149種組分中，相對百分含量大于0.1%的組分共有59種，分析顯示糠醛(21.14%)、乙醛(12.61%)、5-甲基糠醛(7.64%)、石竹烯(7.43%)、六甲基環(huán)三硅氧烷(7.09%)、醋酸(4.25%)、亞油酸(3.34%)等，幾種化學(xué)成分相對含量較高。本文研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)番石榴果實(shí)中含有角鯊烯、α-亞麻酸、亞油酸等生理活性物質(zhì)。

2.3 番石榴葉和果實(shí)揮發(fā)油中共同化學(xué)成分分析

從番石榴葉和果實(shí)的揮發(fā)油中鑒定出匹配度大于800的組分中，有54種共有化學(xué)成分(見表2)。

表2 番石榴葉和果實(shí)揮發(fā)油中的共有化學(xué)成分

通過分析番石榴葉和果實(shí)中的共同化學(xué)成分，得到以下結(jié)論：1)在番石榴葉和果實(shí)揮發(fā)油中部分成分主要為萜烯類及其衍生物，是植物中一類重要的生理活性物質(zhì)，其中共同含有且相對百分含量較高的有，石竹烯分別為18.06%和7.43%，α-蒎烯分別為6.07%和2.61%，香橙烯分別為1.94%和1.32%，去氫白菖烯分別為10.08%和1.23%，角鯊烯分別為0.68%和%0.17%；石竹烯是中國GB 2760-1996批準(zhǔn)為允許使用的食品香料，也可用于合成其它香料；α-蒎烯可用于矯正一些工業(yè)產(chǎn)品的香味，其藥化作用是作為抗菌劑抗真菌等；香橙烯可作為醫(yī)藥中間體或材料中間體；角鯊烯具有提高體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性、增強(qiáng)機(jī)體免疫能力等多種生理功能。2)番石榴葉中相對含量較高的桉樹醇為3.30%、苯甲醛為2.72%，但在果實(shí)中僅為0.12%、0.07%；桉樹醇是一種萜醇，天然香料，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、配置牙膏香精等；苯甲醛是最簡單的芳香醛，俗稱苦杏仁油，是一種重要的有機(jī)化工原料。3)番石榴果實(shí)中相對含量較高的糠醛為21.14%，但在番石榴葉中僅為0.61%，5-甲基糠醛在果實(shí)中相對含量為7.64%明顯高于葉中的0.16%，糠醛是制備多種藥物和工業(yè)產(chǎn)品的原料；5-甲基糠醛具有濃的甜香、辛香氣味。4)另外還有很多共同成分都是重要的香味物質(zhì)，如：2-乙?；秽?，具有杏仁、堅(jiān)果、酵香，乙酸異丙烯酯具有水果香氣，2-甲基四氫呋喃-3-酮具有焦甜香，3-羥基-2-丁酮具有強(qiáng)烈的奶油和脂肪香氣，2-甲基吡嗪具有類似牛肉加熱時發(fā)生的香味和果仁及可可的香氣。

2.4 香氣分析

番石榴葉中的苯乙酮有山楂的氣味，苯甲酸芐酯具有弱花香味，香葉基丙酮具有熱帶水果香韻，月桂烯具有香脂氣味，順式-3-己烯醇苯甲酸脂具有青香、藥草香和水果香氣，R-(-)-香芹烯具有葛縷子的香氣，水芹烯具有黑胡椒和藹荷似的香氣；番石榴果實(shí)中的2-乙?；?5-甲基呋喃具有強(qiáng)烈的天象、堅(jiān)果和焦糖樣的香氣，α-當(dāng)歸內(nèi)酯具有奶油、椰子、藥草香氣并有煙草香韻，法呢醇具有特有的青香韻的鈴蘭花香氣，并有木香香韻。

3 結(jié)論

本研究建立了一種全二維氣相色譜/飛行時間質(zhì)譜法用于分析番石榴葉和果實(shí)的揮發(fā)油化學(xué)成分，實(shí)現(xiàn)了番石榴葉和果實(shí)揮發(fā)油單個組分的分析，在此之前未見該方法應(yīng)用于番石榴葉和果實(shí)的揮發(fā)油成分分析報道，相對于傳統(tǒng)的一維色譜而言，全二維氣相色譜技術(shù)在對揮發(fā)油組分復(fù)雜的植物進(jìn)行分析鑒定時，優(yōu)勢在于具有更大的峰容量、更高的分辨率和靈敏度，全二維氣相色譜與飛行時間質(zhì)譜儀的聯(lián)用為植物等復(fù)雜體系的成分分析提供了良好手段，將來隨著全二維氣相色譜的進(jìn)一步發(fā)展，該技術(shù)將在天然植物中復(fù)雜組分的分析方面發(fā)揮更加重要的作用。

從番石榴葉揮發(fā)油中鑒定出匹配度大于800的組分有139個，占到峰總面積的93.47%，這些組分中相對百分含量大于0.1%的組分有81個；從果實(shí)的揮發(fā)油中鑒定出匹配度大于800的組分有114個，占到峰總面積的98.31%，這些組分中相對百分含量大于0.1%的組分有58個。這些組分中有54種化學(xué)成分同時存在于葉和果實(shí)的揮發(fā)油中。本研究為番石榴的葉和果實(shí)在食品添加、香料、化妝品、醫(yī)藥等領(lǐng)域的資源利用提供一定的基礎(chǔ)，也為其香氣成分開發(fā)提供參考依據(jù)。