參與植物非生物逆境響應(yīng)的DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子研究進(jìn)展

劉坤 李國(guó)婧 楊杞

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，呼和浩特 010019；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010019）

植物生長(zhǎng)和發(fā)育的環(huán)境十分復(fù)雜，常常遭受如干旱、澇害、高鹽堿、重金屬（鉛、Al3+、Cd2+、Fe2+）、極端溫度以及對(duì)流層臭氧等逆境脅迫，嚴(yán)重時(shí)甚至?xí)?dǎo)致植物死亡，造成農(nóng)作物大量減產(chǎn)，從而嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)效益和生態(tài)環(huán)境。因此，提高植物抗逆性，降低逆境對(duì)植物的傷害，闡明植物抗逆機(jī)理意義重大。為應(yīng)對(duì)外界不利環(huán)境，提高對(duì)逆境的適應(yīng)性，在進(jìn)化過(guò)程中，植物通過(guò)調(diào)節(jié)相關(guān)基因和功能蛋白的表達(dá)，激活體內(nèi)免疫防御應(yīng)答機(jī)制，提高自身對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性［1］。轉(zhuǎn)錄因子（反式作用因子）是植物中最重要的一類(lèi)DNA結(jié)合蛋白，能夠與啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件（即特定的DNA序列）特異性結(jié)合，在時(shí)間和空間上協(xié)同調(diào)控下游基因的表達(dá)；或者通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子之間以及與其他相關(guān)蛋白之間的相互作用，激活或抑制基因轉(zhuǎn)錄［2］。近幾十年來(lái)，科學(xué)家們已經(jīng)相繼從許多種植物中分離出一系列調(diào)控生物以及非生物脅迫基因表達(dá)的轉(zhuǎn) 錄 因 子，包 括AP2/ERF、bHLH、bZIP、MYB、WRKY、NAC、TCP等，其中，AP2/ERF是植物中廣泛存在的一類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子超家族，含有AP2/ERF結(jié)構(gòu)域，具有DNA結(jié)合功能，與植物的生長(zhǎng)發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)［3］。DREB轉(zhuǎn)錄因子屬于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族的一個(gè)亞家族，能夠與DRE/CRT（dehydration responsive element/C-repeat）順式作用元件或具有DRE元件的核心序列（CCGAC）特異結(jié)合，故DREB轉(zhuǎn)錄因子又被稱(chēng)作CBF（C-repeat binding factor）轉(zhuǎn)錄因子。已有研究表明，DREB轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控逆境響應(yīng)基因表達(dá)，介導(dǎo)非生物脅迫信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)［4］。本文將從DREB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)特征、分類(lèi)以及逆境脅迫應(yīng)答等多個(gè)角度，對(duì)近幾十年特別是近5年來(lái)國(guó)內(nèi)外有關(guān)DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在植物抗逆領(lǐng)域中的作用及研究進(jìn)行綜述，以期為全面了解植物抗逆分子機(jī)制提供參考。

1 AP2/EREBP轉(zhuǎn)錄因子家族的結(jié)構(gòu)特征

AP2/EREBP（APETALA2/ethylene responsive element binding protein）或AP2/ERF（APETALA2/ethylene responsive factor）參與植物的生長(zhǎng)發(fā)育、激素調(diào)控、病原反應(yīng)、逆境脅迫應(yīng)答等相關(guān)生物學(xué)過(guò)程，這類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域均為保守的AP2/EREBP結(jié)構(gòu)域（簡(jiǎn)稱(chēng)AP2結(jié)構(gòu)域），因而統(tǒng)稱(chēng)為AP2/EREBP或者AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子［5-6］。AP2結(jié)構(gòu)域長(zhǎng)度為57-70個(gè)氨基酸殘基，其典型的三維結(jié)構(gòu)是由1個(gè)雙親性的α-螺旋和3個(gè)反向平行的β-折疊所構(gòu) 成［7-8］。此外，在AP2結(jié)構(gòu)域的N-末端和C-末端上還分別含有YRG和RAYD保守元件，長(zhǎng)度分別為19-22個(gè)和43個(gè)氨基酸殘基。這兩個(gè)元件對(duì)于AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別下游特異性DNA序列非常重要［8］。Sakuma等［9］依據(jù)AP2結(jié)構(gòu)域的相似性以及數(shù)量將擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族分為5個(gè)亞家族，包括AP2、DREB（dehydration responsive element binding protein）、ERF（ethylene response factor）、RAV（related to ABI3/VP1）和Soloist類(lèi)。AP2亞家族含有2個(gè)相似度很高的且串聯(lián)的AP2結(jié)構(gòu)域，DREB和ERF亞家族均含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，其中DREB亞家族AP2結(jié)構(gòu)域第14位和第19位氨基酸為Val和Glu，而ERF亞家族AP2結(jié)構(gòu)域第14位和第19位氨基酸為Ala和Asp，序列的細(xì)微差別直接影響到轉(zhuǎn)錄因子與下游DNA序列結(jié)合的特異性［10-12］。 DREB轉(zhuǎn)錄因子能夠與啟動(dòng)子區(qū)域DRE/CRT元件結(jié)合，參與植物逆境脅迫應(yīng)答過(guò)程。DRE/CRT基序含有6 bp的保守核心序列：A/GCCGAC，該序列在干旱響應(yīng)基因RD29A（responsive to desiccation 29A）的啟動(dòng)子上首次被發(fā)現(xiàn)，并且已有研究表明，RD29A能夠在干旱、高鹽和低溫的誘導(dǎo)下表達(dá)水平升高［13］。而ERF亞家族能夠特異性識(shí)別GCC-box（A/GCCGCC），從而調(diào)控植物對(duì)乙烯、病菌侵害以及非生物脅迫的應(yīng)答反應(yīng)［14］。另外，DREB和ERF亞家族又各進(jìn)一步分別細(xì)分為6個(gè)組，A1-A6組和B1-B6組［9］。RAV亞家族包含1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域和1個(gè)B3結(jié)構(gòu)域，Soloist類(lèi)中也含有1個(gè)AP2結(jié)構(gòu)域，但是其氨基酸序列和結(jié)構(gòu)與其他亞組相差甚遠(yuǎn)，且Soloist類(lèi)的AP2結(jié)構(gòu)域中不含有WLG基序［15］。

2 DREB轉(zhuǎn)錄因子的特點(diǎn)與分類(lèi)

不同物種間DREB轉(zhuǎn)錄因子的AP2結(jié)構(gòu)域具有較高的相似性，尤其是在序列的中間位置相似性較高，而在結(jié)構(gòu)域的兩端相似性較差。DREB A1組轉(zhuǎn)錄因子羧基末端包含高度保守的LWSY序列，在AP2結(jié)構(gòu)域的上游具有核定位信號(hào)（NLS）PKK/RPAGRxK -FxETRHP，在結(jié)構(gòu)域的下游包含DSAWR基序［16］。DREBA2組與A1組相比略有不同，在序列的羧基端包含保守GDDGFSLFxY序列，在AP2結(jié)構(gòu)域上游包含保守PKK-like核定位信號(hào)，序列為RKxPAKGSKKGCMxGKGGP ENxx，結(jié)構(gòu)域下游沒(méi)有出現(xiàn)特異性序列。DREB A3組轉(zhuǎn)錄因子在序列的羧基端包含高度保守的GSIWDxxDPFF序列，同時(shí)在AP2結(jié)構(gòu)域上游包含RKxxxxKGGPxNxKF保守序列。DREB A4和A5組結(jié)構(gòu)域中無(wú)特異性序列出現(xiàn)。DREB A6組轉(zhuǎn)錄因子在羧基末端包含保守KYPSxEIDW序列［17-18］，在基因結(jié)構(gòu)中間位置富含絲氨酸和蘇氨酸，并且與AP2結(jié)構(gòu)域相鄰，在特定條件下可被磷酸化［17，19］。

不同組的DREB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)于識(shí)別下游DRE/CRT基序核心序列A/GCCGAC的特異性不同，有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，將序列中第二個(gè)A突變?yōu)镃或者T時(shí)，或者將第3位C突變?yōu)門(mén)時(shí)，DREB1A依然可以結(jié)合DRE核心序列，而DREB2A則失去結(jié)合能力［9］。此外，將DREB1A AP2結(jié)構(gòu)域上的谷氨酸（E）突變?yōu)楣劝滨０罚―）后，其依然能夠結(jié)合DRE/ CRT元件，但不能識(shí)別GCC-box；如果將纈氨酸（V）突變?yōu)楸彼幔ˋ），則不能特異性識(shí)別DRE/CRT元件和GCC-box。結(jié)果表明，DREB 1A轉(zhuǎn)錄因子第14位纈氨酸（V）在識(shí)別下游啟動(dòng)子作用元件中具有十分重要的作用。然而，如果將DREB2A中第14位的V和第19位的E任意突變一個(gè)，DREB2A就失去了與DRE/CRT元件結(jié)合的能力，表明這兩個(gè)氨基酸在調(diào)控DREB2A基因特異性結(jié)合下游DNA序列上均具有重要的作用［9］。

有學(xué)者根據(jù)DREB轉(zhuǎn)錄因子序列的結(jié)構(gòu)與特點(diǎn)，對(duì)擬南芥中DREB A1組成員進(jìn)行了更為細(xì)致的分類(lèi)，其中，DREB A1組共包含6個(gè)成員，分別為CBF1（C-repeat-binding factor 1）/DREB1C、CBF2/ DREB1B、CBF3/DREB1A、CBF4/DREB1D、DDF1（dwarf and delayed-flowering 1）/DREB1E和DDF2/DREB1F。根據(jù)基因功能的不同，這6個(gè)成員又被分為兩組：其中一組CBF1/DREB1C、CBF2/DREB1B、CBF3/DREB1A為第1類(lèi)，另一組CBF4/DREB1D、DDF1/DREB1F和DDF2/DREB1E為 第2類(lèi)［20-23］。DREB A2組有8個(gè)成員，按照基因間親緣關(guān)系可以被分為3小組，第1小組為DREB2A、DREB2B、DREB 2C、DREB 2E和DREB 2H，第2小 組 為DREB2D和DREB2G，第3小組為DREB2F。與擬南芥相比，水稻（Oryzae sativa）DREB A2組包含6個(gè)成員，其中，OsDREB2A和OsDREB2B為第1類(lèi)，OsDREB2C為第2類(lèi)，OsDREB2E為第3類(lèi)，OsABI4為第4類(lèi)，而OsDREB2D基因的序列明顯不同于其他OsDREB2s基因序列，故未將其進(jìn)行分類(lèi)［24-25］。擬南芥DREB A3組只有一個(gè)成員ABI4，但由于其與水稻DREB A2組中第4類(lèi)成員OsABI4相似性較高，有人也將其歸為DREB A2組的第4類(lèi)［24］。擬南芥DREB A4組有16個(gè)成員，包括TINY和TINY2等［26］。DREB A5組也有16個(gè)成員，包括RAP2.1（related to AP2 1）、RAP2.9（related to AP2 9）和RAP2.10（related to AP2 10）等［8］。DREB A6組有9個(gè)成員，其中包括RAP2.4（related to AP2 4）等［9］。

3 DREB轉(zhuǎn)錄因子家族鑒定與分析

早在2002年，Sakuma等［9］就報(bào)道擬南芥中含有145個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，其中，DREB亞家族共56個(gè)成員，占總數(shù)的38.6%，其中A1-A6組成員數(shù)量分別為6、8、1、16、16和9個(gè)。另外，ERF亞家族共有65個(gè)成員，AP2亞家族共有17個(gè)成員，RAV亞家族共有6個(gè)，以及1個(gè)Soloist成員：AL079349。2006年，Nakano等［15］又在Sakuma的研究基礎(chǔ)上進(jìn)行了更進(jìn)一步分析，發(fā)現(xiàn)在擬南芥中共有147個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子成員，其中包含在Sakuma等研究中未發(fā)現(xiàn)的AP2亞家族成員At5g60120以及ERF亞家族成員At1g22190。Soloist亞家族基因?yàn)锳t4g13040，這與Sakuma等［9］的研究結(jié)果一致。另外，Nakano等［15］將Sakuma等分類(lèi)中的DREB和ERF 2個(gè)亞家族分為1個(gè)家族，命名為ERF家族，其中Group I-Group IV為DREB亞家族成員，數(shù)量為57個(gè)，Group I（A6）、Group II（A5）、Group III（A1、A4、A5）、Group IV（A2、A3） 組成員數(shù)量分別為10、15、23和9個(gè)。

目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)DREB轉(zhuǎn)錄因子家族的報(bào)道較多，涉及的植物種類(lèi)較為廣泛，涵蓋了禾本科、豆科、十字花科、楊柳科等。然而，對(duì)于同一種植物，不同學(xué)者可能有不同的看法，例如Song等［27］研究發(fā)現(xiàn)，油菜（Brassica rapa）中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族成員的數(shù)量為291個(gè)，其中DREB轉(zhuǎn)錄因子的數(shù)量為107個(gè)，占36.77%；而其他學(xué)者則認(rèn)為，油菜中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子超家族成員的數(shù)量是281個(gè)，其中DREB轉(zhuǎn)錄因子為105個(gè)，占37.37%［28］。茍艷麗等［1］、邵文靖等［29］和張麟等［3］認(rèn)為茄科作物馬鈴薯含有246個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，其中DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子為58個(gè)，占23.58%；番茄中共含有190個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子占23.16%，數(shù)量為44個(gè)。而Charfeddine等［30］和Sharma等［31］研究表明，馬鈴薯和番茄中分別含有181和112個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，其中DREB類(lèi)分別為65和25個(gè)，占比為35.91%和22.32%。Nakano等［15］研究表明，在水稻中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因共有157個(gè)，其中DREB轉(zhuǎn)錄因子共有56個(gè)，占35.67%；而Sharnoi等［32］持不同觀點(diǎn)，他認(rèn)為水稻中有163個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，其中DREB轉(zhuǎn)錄因子共有57個(gè)，占34.97%（表1）。另外，二穗短柄草（Brachypodium distachyon）、毛竹（Phyllostachys edulis）等植物中也存在類(lèi)似問(wèn)題，究其原因可能是：第一，存在可變剪接。有學(xué)者認(rèn)為，雖然來(lái)源相同，但是可變剪接體在DNA序列上就存在差異，每一種剪接體都應(yīng)該被認(rèn)為是單獨(dú)的一個(gè)基因家族成員，而有的學(xué)者則認(rèn)為只要可變剪接體的來(lái)源是相同的，就認(rèn)為是家族中的一個(gè)基因。第二，AP2結(jié)構(gòu)域的差異。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因結(jié)構(gòu)上含有典型的AP2結(jié)構(gòu)域，對(duì)于只含有AP2結(jié)構(gòu)域的基因均歸為AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族成員，但一些人認(rèn)為，基因結(jié)構(gòu)上除了含有AP2結(jié)構(gòu)域之外，如果還具有其他的結(jié)構(gòu)域，那么也要?dú)w為AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族中。第三，AP2結(jié)構(gòu)域的完整性。對(duì)于一些AP2/ERF結(jié)構(gòu)域完整性較低的基因，一些學(xué)者認(rèn)為也可以歸為家族成員中，而有的學(xué)者只對(duì)具有完整AP2結(jié)構(gòu)域的基因進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)。

表1 不同植物AP2/ERF類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子總結(jié)Table 1 Summary of AP2/ERF transcription factors in different plants

4 DREB轉(zhuǎn)錄因子在非生物脅迫中的功能

植物DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子能夠響應(yīng)非生物脅迫，能夠在逆境條件下提高植物的抗逆性。同時(shí)，DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子對(duì)植物激素信號(hào)也非常敏感，在植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中具有重要作用［13］。

4.1 低溫及冷脅迫響應(yīng)機(jī)理及功能

農(nóng)作物遭受低溫及冷害后會(huì)大幅減產(chǎn)，作物的品質(zhì)也會(huì)受到影響，如何提高植物在冷害脅迫條件下的抗性一直以來(lái)備受人們關(guān)注。近幾年，人們對(duì)于植物冷脅迫耐受調(diào)控機(jī)理也進(jìn)行了深入研究。外界冷信號(hào)刺激質(zhì)膜上鈣離子通道（Ca2+channel）、蛋白激酶（protein kinases）以及COLD1（cold sensor chilling-tolerance divergence 1）冷響應(yīng)受體。蛋白激酶OST1（open stomata 1）、MPK3/6（mitogen-activated protein kinase 3/6）以及BIN2（brassinosteroid-insensitive 2），E3連接酶HOS1（high expression of osmotically responsive genes）、PUB25/26（U-box type E3 ubiquitin ligases 25/26）和SUMO E3（small ubiquitinrelated modifier E3）連接酶SIZ1（SAP and MiZ1）等在翻譯后水平參與調(diào)控ICE1（inducer of CBF expression 1）和MYB15（myeloblastosis 15）等關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的活性。ICE1屬于bHLH轉(zhuǎn)錄因子家族，能夠識(shí)別CBFs基因啟動(dòng)子區(qū)域的MYC元件［48］，激活CBFs基因的表達(dá)，激活后的CBFs可以直接與冷防御基因如CORs（Cold regulated）上的DRE/CRT元件結(jié)合，激活CORs基因的表達(dá)，最終通過(guò)激活抗冷蛋白或ROS清除系統(tǒng)，增強(qiáng)植物的抗冷性［49］。MYB15是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族中的一個(gè)抑制子，其可以與ICE1相互作用，進(jìn)而識(shí)別CBF基因啟動(dòng)子區(qū)域的Myb識(shí)別元件，抑制CBFs基因表達(dá)［50］。

在冷脅迫下，COLD1能夠與RGA1（rice G-pro- tein α subunit 1）亞基互作，激活下游第二信使，如Ca2+信號(hào)等，隨后將信號(hào)級(jí)聯(lián)傳遞給蛋白激酶，如OST1等。OST1磷酸化ICE1，使ICE1變?yōu)榧せ顟B(tài)，最終激活CBFs基因表達(dá)［51］。除了ICE1外，近期研 究 發(fā) 現(xiàn)，BTF3（basic transcription factor 3）和BTF3L（BTF3-like）也是OST1的催化底物。BTF3蛋白是新生多肽相關(guān)復(fù)合物的β亞基，能夠提高植物的抗冷性。OST1能夠磷酸化BTF3和BTF3L，促使BTF3蛋白與CBFs轉(zhuǎn)錄因子互作，使CBFs蛋白在冷脅迫下更穩(wěn)定［52］。另外，在外界冷信號(hào)到來(lái)時(shí)，OST1也同樣受到ERG2（clade E growth regulating 2）的調(diào)控。ERG2屬于PP2C（type 2C（clade E）protein phosphatase）蛋白家族，該蛋白家族在植物響應(yīng)非生物脅迫以及激素調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，但其行使功能不依賴(lài)于ABA［51］。

研究發(fā)現(xiàn)，冷信號(hào)途徑中的一些重要組分可能會(huì)被E3泛素連接酶識(shí)別，進(jìn)而使其泛素化并且通過(guò)26S蛋白酶體途徑降解。然而最近有研究報(bào)道，CBF轉(zhuǎn)錄因子同樣也會(huì)經(jīng)過(guò)26S蛋白酶體途徑而降解。在冷脅迫下，CRPK1（cold-responsive protein kinase 1）磷酸化14-3-3蛋白使其從質(zhì)膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，進(jìn)入細(xì)胞核的14-3-3蛋白與不穩(wěn)定的CBFs轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，從而減弱CBF通路的表達(dá)，避免對(duì)冷脅迫產(chǎn)生過(guò)度響應(yīng)［53］。此外，在冷脅迫下，有活性的OST1可以磷酸化2個(gè)U-box型E3泛素連接酶PUB25和PUB26，增強(qiáng)其泛素連接酶活性，激活MYB15的泛素化降解途徑，從而正調(diào)控冷脅迫［54］。

植物DREB轉(zhuǎn)錄因子的6個(gè)亞家族中，A1亞家族成員（CBF/DREB1s）對(duì)冷脅迫敏感，幾乎都能夠受到冷脅迫的誘導(dǎo)，能夠調(diào)控冷脅迫相關(guān)基因的表達(dá)，如COR47和COR15a等［55-57］。研究表明A1亞家族成員在擬南芥4號(hào)染色體上是串聯(lián)排列 的［20，58］，為闡明DREB/CBF轉(zhuǎn)錄因子抗冷機(jī)理提供了思路。有學(xué)者通過(guò)CRISPR-Cas9技術(shù)獲得擬南芥cbf123三突變體株系，經(jīng)冷凍脅迫后證實(shí)cbf123株系不耐受冷凍脅迫［59］，而CBFs雙突變體的表型則略有差異。擬南芥cbf23雙突變體對(duì)冷脅迫十分敏感，而cbf13雙突變體對(duì)冷脅迫沒(méi)有響應(yīng)。Jia等［60］利用相同技術(shù)獲得擬南芥CBFs三突變體幼苗，也命名為cbf123，并發(fā)現(xiàn)三突變體cbf123在低溫冷馴化后對(duì)冷凍脅迫的敏感性要比單突變體cbf2、cbf3以及雙突變體cbf13強(qiáng)，以上結(jié)果表明，擬南芥DREB A1家族CBF/DREB1s參與植物應(yīng)對(duì)冷脅迫信號(hào)，且由于CBF1、CBF2、CBF3在染色體上屬于串聯(lián)排列，所以在冷脅迫信號(hào)響應(yīng)過(guò)程中存在一定的功能冗余，且CBF2要比CBF1和CBF3在冷馴化依賴(lài)的冷凍耐受方面發(fā)揮更重要的作用。但是，目前對(duì)于CBFs基因功能的研究存在不同的觀點(diǎn)，如Novillo等［61］結(jié)果表明，將擬南芥CBF2突變掉后，植株對(duì)冷脅迫的耐受力增強(qiáng)，而將擬南芥CBF1和CBF3一起突變后，植株對(duì)冷脅迫的耐受力減弱［62］，該結(jié)果與Jia等［60］結(jié)果一致。Zhao等［59］則認(rèn)為cbf2突變體對(duì)冷脅迫稍有敏感，而擬南芥雙突變體cbf1cbf3對(duì)冷脅迫不敏感。作者對(duì)可能的原因進(jìn)行了分析，擬南芥CBFs基因在染色體上的排列方式是串聯(lián)的，對(duì)其中1或2個(gè)基因進(jìn)行突變時(shí)，其他基因可能會(huì)受到影響。另外，在CBFs基因的周?chē)性S多基因表達(dá)調(diào)控的關(guān)鍵元件，基因的突變會(huì)影響關(guān)鍵調(diào)控元件的激活，進(jìn)而影響擬南芥突變體的表型。所以，CBFs基因間復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系還有待進(jìn)一步的研究和驗(yàn)證［51，63］。

除了DREB A1組外，其他組DREB轉(zhuǎn)錄因子則對(duì)冷脅迫不十分敏感。DREB 2A不受低溫誘導(dǎo)，但受干旱和高鹽誘導(dǎo)［19］。過(guò)表達(dá)DREB 2A轉(zhuǎn)基因擬南芥輕微提高對(duì)冷害的抗性，顯著提高對(duì)干旱的耐受性［64］。狼尾草（Pennisetum glaucum）中DREB A2型轉(zhuǎn)錄因子PgDREB2A在冷脅迫下的表達(dá)水平明顯比鹽和干旱處理后要高，在處理12 h時(shí)表達(dá)量最高，是對(duì)照組的3倍［65］。水稻OsDREB2B受冷脅迫快速誘導(dǎo)，而OsDREB2A受熱、干旱和高鹽的誘導(dǎo)，卻不受冷誘導(dǎo)［24］。胡楊（Populus euphratica）DREB A2組成員PeDREB2受冷、干旱和高鹽的誘導(dǎo)［66］。另外，狗牙根（Cynodon dactylon）BeDREB1和BeDREB2、銀 新 楊（Populus alba×P. alba var. pyramidalis）PaDREB2、小 麥TaWDREB2以 及 玉米ZmDREB2A等多種DREB A2組基因均能夠受到冷脅迫的誘導(dǎo)［67-70］。擬南芥AtTINY屬于DREB A3型，受到干旱脅迫、冷脅迫、乙烯、ABA的強(qiáng)烈誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)AtTINY后，擬南芥植株矮小且發(fā)育遲緩，冷脅迫相關(guān)基因COR6.6、COR15A和COR78等上調(diào)表達(dá)［71］。大豆GmDREB2和GmDREB3均屬于DREB A5組成員，均受低溫脅迫的誘導(dǎo)，其中，GmDREB3對(duì)冷脅迫響應(yīng)較為迅速，處理0.5 h后即有明顯響應(yīng)，且不受干旱，高鹽和ABA的誘導(dǎo)，與DREB A1組基因的表達(dá)模式較為相似。過(guò)表達(dá)GmDREB3擬南芥在冷脅迫下的存活率高于野生型［72-73］。Figueroa-Ya?ez等［74］研究發(fā)現(xiàn)，番木瓜（Carica papaya）CpRap2.1、CpRap2.4a、CpRap2.4b和CpRap2.10受冷脅迫快速誘導(dǎo)，冷脅迫15 min后，基因表達(dá)量即有明顯提升，將這4個(gè)基因轉(zhuǎn)化煙草發(fā)現(xiàn)，在冷脅迫處理下，轉(zhuǎn)基因煙草的耐冷性明顯優(yōu)于野生型。以上結(jié)果表明，DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子在植物響應(yīng)冷脅迫信號(hào)應(yīng)答途徑中具有十分重要的功能。

4.2 干旱、鹽和熱響應(yīng)機(jī)理及功能

DREB轉(zhuǎn)錄因子在響應(yīng)干旱、鹽及熱脅迫的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用，尤其是DREB A2組成員，如DREB2A對(duì)干旱和高鹽誘導(dǎo)較為敏感，而對(duì)低溫誘導(dǎo)不敏感，過(guò)表達(dá)DREB2A擬南芥顯著提高植株對(duì)干旱的耐受性［64］。DREBA2組轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平在PI-PLC/PA阻遏途徑或DRIP1/2參與的泛素化途徑的作用下能夠維持在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的水平［75］，當(dāng)遭遇干旱、鹽以及熱脅迫時(shí)，核內(nèi)AREB（ABAresponsive element-binding proteins）、HSF（heat shock transcription factor）及GRF（growth regulation factor）等相關(guān)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子與DREB2s調(diào)控元件相結(jié)合，啟動(dòng)其轉(zhuǎn)錄并翻譯成無(wú)活性的蛋白，同時(shí)被運(yùn)出細(xì)胞核。無(wú)活性的蛋白在去磷酸化或者是將PEST序列移除后變成有活性的蛋白。PEST是脯氨酸（proline，P）、谷氨酸（glutamic acid，E）、絲氨酸（serine，S）、蘇氨酸（threonine，T）的縮寫(xiě)［76］，該序列存在于AP2結(jié)構(gòu)域周?chē)^為保守，是一種負(fù)調(diào)控因子（negative regulatory domain，NRD）［64］，富含絲/蘇氨酸和磷酸化位點(diǎn)，可被蛋白激酶C或酪蛋白激酶2磷酸化［76］。當(dāng)NRD上的絲/蘇氨酸位點(diǎn)被磷酸化后［77］，其可充當(dāng)DREB2類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子降解的信號(hào)肽，蛋白將被迅速降解［78］。相反，有研究發(fā)現(xiàn)，從擬南芥DREB2A蛋白上移除NRD，該蛋白變成一種穩(wěn)定且激活的狀態(tài)，能夠與下游多種調(diào)控因子如HSF、AREB等相結(jié)合，調(diào)控植物的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，提高植物的抗逆性。由于是組成型過(guò)表達(dá)，所以轉(zhuǎn)基因擬南芥植株出現(xiàn)生長(zhǎng)退化的表型［79］。

在干旱脅迫方面，東京大學(xué)Kazuko Yamaguchi-Shinozaki教授團(tuán)隊(duì)做出了重要貢獻(xiàn)。在正常生長(zhǎng)條件下，擬南芥DREB2A蛋白穩(wěn)定性較差，而干旱和熱脅迫下，BPM（BTB/POZ AND MATH DOMAIN proteins）敲除株系中DREB2A蛋白明顯積累，且其靶基因表達(dá)量明顯升高，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)BMP能夠識(shí)別DREB2A蛋白上的NRD（negative regulatory domain）結(jié)構(gòu)域，從而通過(guò)E3泛素連接酶途徑降解DREB2A，該結(jié)果探明了擬南芥DREB2A依賴(lài)于NRD降解的主要原因［80］。Kudo等［81］研究表明，過(guò)表達(dá)DREB1A和OsPIL1擬南芥抗旱性明顯提高，表型類(lèi)似于過(guò)表達(dá)DREB1A植株，且轉(zhuǎn)錄組和代謝組數(shù)據(jù)表明，雙過(guò)表達(dá)株系中非生物脅迫相關(guān)基因（如RD29A、COR15A等）表達(dá)量明顯升高，可溶性固形物如糖類(lèi)、氨基酸等均有明顯積累。Kidokoro等［82］分析了大豆基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，鑒定出14個(gè)DREB1型轉(zhuǎn)錄因子（GmDREB1s），結(jié)果表明，多數(shù)GmDREB1受多種非生物脅迫（包括冷、干旱、高鹽和熱等）誘導(dǎo)，另外，通過(guò)分析轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，過(guò)表達(dá)GmDREB1B、GmDREB1C、GmDREB1F擬南芥RD29A、RD17、COR15A等表達(dá)量明顯上調(diào)，這與過(guò)表達(dá)GmDREB1A轉(zhuǎn)基因擬南芥的結(jié)果類(lèi)似，且干旱脅迫處理下，轉(zhuǎn)GmDREB1F擬南芥存活率明顯高于對(duì)照。在水分缺乏條件下，轉(zhuǎn)擬南芥AtDREB2A大豆中，AtDREB2A表達(dá)量明顯升高，尤其是在大豆根部，基因表達(dá)量最高，且穩(wěn)定性最強(qiáng)［83］。Mizoi 等［84］發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的大豆DREB A2組基因GmDREB2A；2，其受到干旱、熱和低溫脅迫的誘導(dǎo)，干旱脅迫下轉(zhuǎn)GmDREB2A；2擬南芥存活率明顯高于轉(zhuǎn)空載體擬南芥。Reis等［85］和Souza等［86］在甘蔗中過(guò)表達(dá)AtDREB2A，并在溫室和大田條件下進(jìn)行干旱脅迫處理，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因甘蔗下游干旱脅迫相關(guān)基因表達(dá)量升高，且葉片相對(duì)含水量、水勢(shì)以及光合速率也顯著高于對(duì)照，植株蔗糖含量和出芽率也明顯提高，大田試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因甘蔗表現(xiàn)出更高的產(chǎn)量和生產(chǎn)力。綜上所述，室內(nèi)和室外田間試驗(yàn)結(jié)果均證實(shí)，DREB1型和DREB2型轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物響應(yīng)干旱脅迫應(yīng)答。

在鹽脅迫下，水稻根特異性誘導(dǎo)DREB轉(zhuǎn)錄因子SERF1（salt responsive ERF1）通過(guò)MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)通路介導(dǎo)植物對(duì)高鹽脅迫的響應(yīng)，過(guò)表達(dá)OsSERF1后，植株耐鹽性明顯提高［87］。水稻Os- DREB1A和OsDREB1B能夠被冷脅迫誘導(dǎo)，且Os-DREB1B也受甘露醇、NaCl和PEG的誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)水稻OsDREB1A能夠提高擬南芥的耐鹽性和抗旱性，同時(shí)，過(guò)表達(dá)OsDREB1B能夠顯著提高轉(zhuǎn)基因煙草的抗逆性［88-89］。轉(zhuǎn)擬南芥AtDREB1C丹參與野生型相比抗旱性更強(qiáng)，SOD、POD、葉綠素含量顯著升高，MDA含量顯著降低［90］。木薯MeDREB1B受鹽、PEG強(qiáng)烈誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)MeCBF1/DREB1B明顯增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因木薯對(duì)于冷害、氧化脅迫以及干旱脅迫的耐受性［91］。馬鈴薯StDREB1和StDREB2分別屬于DREB A4和A5組，受干旱、鹽及滲透脅迫誘導(dǎo)，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)StDREB1和StDREB2馬鈴薯具有更強(qiáng)的耐鹽性，且轉(zhuǎn)StDREB1的馬鈴薯抗旱性更強(qiáng)，同時(shí)，兩種轉(zhuǎn)基因馬鈴薯中脅迫相關(guān)基因表達(dá)水平明顯升高［92-93］。除了DREB 1型轉(zhuǎn)錄因子外，棉花DREB A4組成員GhDPB3與擬南芥AtTINY2的表達(dá)模式類(lèi)似，受到干旱和鹽脅迫的快速誘導(dǎo)［94］。Liang等［95］在真蘚（Bryum argenteum）中發(fā)現(xiàn)一種苔蘚類(lèi)物種中特有的DREB轉(zhuǎn)錄因子，命名為BaDBL1。從結(jié)構(gòu)分類(lèi)上看，BaDBL1不屬于DREB A1-A6組。BaDBL1受干旱、鹽、冷、ABA的誘導(dǎo)。鹽脅迫下，轉(zhuǎn)BaDBL1基因擬南芥耐鹽性、抗氧化酶系統(tǒng)（SOD、POD、CAT）以及下游脅迫相關(guān)基因（AtRD29A、AtCOR15A和AtLEA）表達(dá)水平明顯上調(diào)。此外，Liang等［96］和Li等［97］發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)真蘚DREB A5組基因ScDREB8和ScDREB10能增強(qiáng)擬南芥種子萌發(fā)率和耐鹽性，究其原因主要是下游脅迫相關(guān)基因的表達(dá)水平升高以及ROS清除系統(tǒng)酶活性的增強(qiáng)。

此外，DREB轉(zhuǎn)錄因子對(duì)熱脅迫也有明顯的響應(yīng)，大豆GmDREB2A、苜蓿MtDREB2A和擬南芥AtDREB2A受干旱、鹽和熱脅迫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因植株對(duì)干旱、鹽以及熱脅迫的耐受性明顯增強(qiáng)［64，84，98］。玉米ZmDREB2A受熱脅迫誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)基因株系耐熱性明顯提升［68］。轉(zhuǎn)基因擬南芥中超表達(dá)DREB2C后，熱響應(yīng)相關(guān)基因表達(dá)量升高，說(shuō)明DREB2C參與植株熱脅迫應(yīng)答途徑［99］。木瓜CpRap2.1、CpRap2.10、CpRap2.4a和CpRap2.4b均對(duì)熱脅迫敏感，其中CpRap2.4a和CpRap2.4b也受到冷脅迫的誘導(dǎo)。在熱脅迫下，轉(zhuǎn)CpRap2.4a、CpRap2.4b、CpRap2.1和CpRap2.10煙草幼苗存活率明顯高于野生型［74］。將禾本科植物穇子（Eleusine coracana）DREB2A轉(zhuǎn)入煙草中發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草耐42℃高溫，不耐鹽和滲透脅迫，其耐熱機(jī)制主要是通過(guò)增強(qiáng)體內(nèi)抗氧化酶（SOD、CAT、GR和POD等）活性，從而提高植株耐熱性。此外，在熱脅迫下，轉(zhuǎn)基因煙草生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)以及生理生化指標(biāo)都優(yōu)于野生型［100］。過(guò)表達(dá)和基因沉默番茄（Solanum lycopersicum）DREB A4組基因SiDREBA4后，轉(zhuǎn)基因微型番茄通過(guò)調(diào)節(jié)滲透物質(zhì)含量、耐逆激素水平和抗氧化酶活性，從而改變植物的耐熱性，且SiDREBA4還能夠參與調(diào)控下游許多熱激蛋白（Hsp）的表達(dá)［101］。與番茄類(lèi)似，同源過(guò)表達(dá)菊花（Chrysanthemum morifolium）DREB A6組基因CiDREB6后，與野生型相比，植株耐熱性和存活率顯著提高，下游CmHsfA4、CmHSP90以及活性氧清除基因CmSOD和CmCAT表達(dá)水平明顯提高［102］。這些結(jié)果表明，DREB轉(zhuǎn)錄因子家族參與植物響應(yīng)干旱、鹽以及熱脅迫應(yīng)答過(guò)程，并發(fā)揮重要作用。

4.3 其他逆境脅迫響應(yīng)

除上述逆境脅迫之外，DREB轉(zhuǎn)錄因子還能夠調(diào)控植物對(duì)其他逆境脅迫的響應(yīng)。植物葉片衰老過(guò)程受到內(nèi)源因素以及外界環(huán)境的影響，DREB轉(zhuǎn)錄因子也參與植物葉片衰老途徑。擬南芥DREB A1組成員DEAR4受黑暗脅迫誘導(dǎo)，過(guò)表達(dá)AtDEAR4擬南芥在正常以及黑暗條件下均能夠明顯延緩葉片的衰老，說(shuō)明其參與到植株衰老響應(yīng)途徑中。另外，通過(guò)研究發(fā)現(xiàn)，DEAR4是通過(guò)誘導(dǎo)ROS的產(chǎn)生，最終減輕衰老以及其他脅迫對(duì)植物產(chǎn)生的毒害［103］。Liu等［104］在煙草中異源表達(dá)川桑（Morus notalilis）MnDREB4A，Schwager等［105］在擬南芥中過(guò)表達(dá)AtDREB1C后也得到類(lèi)似的結(jié)果，說(shuō)明DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子參與植物衰老調(diào)控途徑并發(fā)揮重要功能。DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子也參與到植物應(yīng)對(duì)氧化脅迫過(guò)程。在H2O2和百草枯等處理下，轉(zhuǎn)AtCBF2擬南芥抗氧化性顯著提高，對(duì)AtCBF2擬南芥進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析表明，下游WRKY、NAC等轉(zhuǎn)錄因子差異表達(dá)，而SOD和CAT等基因表達(dá)量不變，說(shuō)明DREB結(jié)合下游NAC等轉(zhuǎn)錄因子，參與植株的抗氧化過(guò)程［106］。另外，擬南芥DREB轉(zhuǎn)錄因子CRF6也受到氧化脅迫的快速誘導(dǎo)［107］。二色補(bǔ)血草（Limonium bicolor）LbDREB受到鹽、滲透以及堿脅迫的誘導(dǎo)，在CuSO4脅迫下，轉(zhuǎn)LbDREB煙草與對(duì)照相比可溶性蛋白和脯氨酸含量升高，且K/Na值升高，同時(shí)脅迫相關(guān)基因包括Cu/Zn超氧化物歧化酶（Cu/Zn SOD）、過(guò)氧化物酶（POD）、晚期胚胎發(fā)育富集蛋白（LEA）以及脂轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（LTP）等表達(dá)升高，說(shuō)明LbDREB增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)重金屬離子脅迫的耐受性［108］。辣椒（Capsicum annuum）DREB A1組 成 員CaDREBLP1受干旱、高鹽以及機(jī)械損傷的不同程度的誘導(dǎo)［109］。此外，水稻OsDREB1A受機(jī)械損傷短暫而迅速地誘導(dǎo)［89］。水對(duì)于植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要，但是過(guò)多的水分比如水淹或者洪水等則會(huì)導(dǎo)致植物低氧脅迫，影響植物正常的生理過(guò)程。Du等［110］在基因組水平上分析了玉米AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的表達(dá)模式發(fā)現(xiàn)，在不同水淹時(shí)間脅迫下，有38個(gè)AP2/ERF家族基因響應(yīng)較為顯著，其中包含10個(gè)DREB類(lèi)亞家族基因，大部分DREB類(lèi)基因響應(yīng)較為迅速，在水淹脅迫1 h后，表達(dá)量即有明顯升高，且隨著水淹脅迫處理時(shí)間的延長(zhǎng)，DREB A1組成員表達(dá)量越高，說(shuō)明DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子參與植物應(yīng)對(duì)多種非生物脅迫過(guò)程。

5 展望

目前，已對(duì)DREB轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)、類(lèi)型、表達(dá)特性、逆境脅迫下的功能進(jìn)行了大量的研究工作，為闡明植物抗逆分子機(jī)制，進(jìn)行農(nóng)林草抗逆新品種的培育提供理論依據(jù)。但是，依然存在許多問(wèn)題，有待進(jìn)一步研究。

DREB類(lèi)轉(zhuǎn)錄因子的抗逆性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控的研究大部分還只能依賴(lài)于異源表達(dá)模式植物擬南芥或者煙草，跨物種的異源表達(dá)在一定程度上會(huì)影響試驗(yàn)結(jié)果，導(dǎo)致規(guī)律不一致。如果能實(shí)現(xiàn)DREB轉(zhuǎn)錄因子同源基因表達(dá)，將對(duì)揭示植物抗逆分子機(jī)制，篩選優(yōu)質(zhì)農(nóng)林草資源，完善DREB轉(zhuǎn)錄因子在木本植物中的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)具有十分重要的意義。另外，對(duì)于多年生、體型高大、生命周期長(zhǎng)、自身結(jié)構(gòu)復(fù)雜、難以進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化的木本植物來(lái)說(shuō)，大部分根、莖屬多年生，而葉為一年生，還有少部分木本植物的根、莖、葉均為多年生，而大部分草本植物均為一年生，木本和草本植物生命特征和周期截然不同，抗逆機(jī)制必然存在差異，且與草本植物相比，木本植物的進(jìn)化程度更高，分子機(jī)制也更為復(fù)雜。

轉(zhuǎn)入DREB轉(zhuǎn)錄因子受體植物不夠廣泛，所研究的對(duì)象主要集中在擬南芥、油菜、甘藍(lán)、蒺藜苜蓿、小立碗蘚等植物上，對(duì)于大田作物如馬鈴薯、甜菜、番茄等研究相對(duì)較少。如何將植物抗逆基因工程技術(shù)有效地應(yīng)用于田間種植推廣，并且被大眾普遍接受，還是一個(gè)十分漫長(zhǎng)的過(guò)程。另外，對(duì)于一些親緣關(guān)系較遠(yuǎn)的植物是否有效，還有待深入研究。

植物對(duì)脅迫應(yīng)答的反應(yīng)是由多基因協(xié)同控制的，在整個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)中，從感知脅迫信號(hào)到脅迫應(yīng)答基因表達(dá)都需要各種轉(zhuǎn)錄因子與順式元件間互作與調(diào)控才能完成，DREB轉(zhuǎn)錄因子所介導(dǎo)的基因表達(dá)調(diào)控在植物抵御各種環(huán)境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要功能，然而目前的研究方向主要集中在對(duì)DREB轉(zhuǎn)錄因子家族成員的功能研究上，對(duì)其上下游基因的挖掘還有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

總之，對(duì)DREB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)、功能以及作用機(jī)理研究的逐步深入，為利用DREB轉(zhuǎn)錄因子改良植物抗逆性的基因工程技術(shù)，篩選優(yōu)質(zhì)抗逆林木和牧草資源，培育抗逆農(nóng)林草新品種提供了理論依據(jù)。