靶向模擬Bt Cry1C蛋白抗蟲功能的人源化基因工程抗體篩選及鑒定

徐重新 張霄 劉媛 仲建鋒 謝雅晶 盧莉娜 高美靜 劉賢金

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全與營(yíng)養(yǎng)研究所 江蘇省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南京 210014）

Bt Cry蛋白是蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）在代謝過程中產(chǎn)生的蛋白質(zhì)類伴胞晶體次生代謝產(chǎn)物，對(duì)多種農(nóng)林害蟲具有廣譜特異性毒殺作用，是目前研究最成熟、應(yīng)用最廣的微生物農(nóng)藥［1］?，F(xiàn)已報(bào)道的Bt Cry蛋白多達(dá)數(shù)百種，其中Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1B、Cry1C和Cry1F等在應(yīng)用上最為常見，特別是用于轉(zhuǎn)基因抗蟲作物改造，品種涉及水稻、玉米、大豆、馬鈴薯、番茄、棉花、煙草等全球主要大宗農(nóng)作物［2］。據(jù)國際農(nóng)業(yè)生物技術(shù)應(yīng)用服務(wù)組織最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，轉(zhuǎn)Bt Cry蛋白基因作物推廣應(yīng)用范圍幾乎涵蓋了五大洲所有農(nóng)業(yè)生產(chǎn)大國，為全世界減少化學(xué)農(nóng)藥投入使用和保障農(nóng)產(chǎn)品穩(wěn)定生產(chǎn)作了重要貢獻(xiàn)，蘊(yùn)藏著巨大的商業(yè)價(jià)值［3］。然而，隨著轉(zhuǎn)Bt Cry蛋白基因作物長(zhǎng)時(shí)間、大范圍推廣應(yīng)用，其加速害蟲抗藥性以及可能存在的生態(tài)安全風(fēng)險(xiǎn)等問題飽受非議，一直是社會(huì)輿論關(guān)注的熱點(diǎn)［4-5］。挖掘新型安全生物源性抗蟲材料，特別是探索可替代Bt Cry蛋白抗蟲功能的生物活性材料是當(dāng)今綠色生物農(nóng)藥領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

丹麥免疫學(xué)家Jerne教授在1974年提出“免疫網(wǎng)絡(luò)學(xué)說”并首次定義抗獨(dú)特型抗體（anti-idiotype antibody，Anti-Id）的概念，指出機(jī)體免疫級(jí)聯(lián)反應(yīng)過程中可以針對(duì)抗體可變區(qū)特定區(qū)域產(chǎn)生抗體的抗體（即抗獨(dú)特型抗體），后經(jīng)血清反應(yīng)分型鑒定劃分為α、β、γ和ε四種類型，其中β類型的抗獨(dú)特型抗體因具有“內(nèi)影像”的特性，從而展示出與抗原相同的抗原決定簇，因而具備模擬抗原部分結(jié)構(gòu)或生物學(xué)功能的特性［6］。目前在生物醫(yī)藥領(lǐng)域和農(nóng)業(yè)免疫檢測(cè)領(lǐng)域已經(jīng)有采用抗獨(dú)特型抗體技術(shù)制備可替代抗原結(jié)構(gòu)或功能的生物安全類似物等方面研究的報(bào)道。Hanoux等［7］獲得了可模擬人朊蛋白抗原關(guān)鍵功能表位的抗獨(dú)特型多克隆抗體，可用于替代人朊蛋白用于疾病治療。Lan等［8］獲得了可模擬生長(zhǎng)激素與受體結(jié)合的鼠源抗獨(dú)特型單克隆抗體，其能對(duì)生長(zhǎng)激素起到明顯的拮抗抑制作用，可用于生長(zhǎng)激素類疾病治療。Shu等［9］和Qiu等［10］依托抗獨(dú)特型抗體技術(shù)分別成功制備獲得了伏馬毒素和Bt Cry1Ab蛋白的抗獨(dú)特型基因工程納米抗體，均能替代Bt Cry全長(zhǎng)蛋白用于相應(yīng)農(nóng)產(chǎn)品樣品檢測(cè)。

目前國內(nèi)外尚無采用抗獨(dú)特型抗體技術(shù)制備可模擬Bt Cry蛋白抗蟲功能類似物的研究報(bào)道。Cry 1C作為Bt Cry蛋白家族較為典型的代表性成員，特別對(duì)鱗翅目害蟲具有良好的殺蟲效果，是轉(zhuǎn)Bt基因水稻較為常見的類型，因此探索具備模擬Cry 1C蛋白抗蟲活性的新型蛋白類生物材料用于替代Cry 1C蛋白應(yīng)對(duì)稻作農(nóng)業(yè)靶標(biāo)害蟲具有重要意義。英國劍橋大學(xué)構(gòu)建的人源化噬菌體展示單鏈抗體庫庫容量和多樣性高達(dá)108，是目前商品化應(yīng)用較廣的庫源材料，因其單鏈抗體基因來源于人類，理論上對(duì)人類免疫系統(tǒng)不會(huì)造成明顯的異源排斥反應(yīng)，因此如果能從該庫中獲得具有模擬Bt Cry抗蟲功能的人源化單鏈抗體，那么其作為生物農(nóng)藥制劑或轉(zhuǎn)基因材料用在食用農(nóng)作物靶標(biāo)害蟲防控上，對(duì)人類健康來說更加具備潛在的安全優(yōu)勢(shì)?；诖耍芯恳訠t Cry1C抗蟲蛋白為模擬對(duì)象，采用抗獨(dú)特型抗體制備技術(shù)，以Bt Cry1C蛋白多克隆抗體作為包被靶點(diǎn)抗原，以劍橋大學(xué)研發(fā)的優(yōu)質(zhì)商品化大容量人源化噬菌體展示抗體庫為庫源材料，通過抗原特異性抗體高通量靶向篩選與分析鑒定，從供試庫源中靶向淘篩具有可模擬Bt Cry1C蛋白抗蟲功能的抗獨(dú)特型基因工程抗體材料，為新型安全生物抗蟲蛋白人工定向創(chuàng)制探索全新路徑。

1 材料與方法

1.1 材料

Bt Cry1C蛋白購于上海佑隆生物科技有限公司。Bt Cry1C蛋白多克隆抗體由省部共建國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地-江蘇省食品質(zhì)量安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期制備［11］。人源化噬菌體展示單鏈抗體庫（庫容量為108CFU/mL）、KM13輔助噬菌體和E. coli TG1均購于購自英國劍橋大學(xué)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室和蛋白質(zhì)基因工程中心。稻縱卷葉螟（三齡幼蟲）由揚(yáng)州綠源生物化工有限公司提供，小菜蛾（三齡幼蟲）由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全控制技術(shù)與標(biāo)準(zhǔn)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。全自動(dòng)酶標(biāo)儀購于美國Thermo公司，96孔酶標(biāo)板和細(xì)胞培養(yǎng)瓶購于美國Corning 公司。Anti-M13［HRP］單克隆抗體、羊抗兔IgG［HRP］單克隆抗體、超微量分光光度計(jì)購于北京Sigma-Aldrich 公司?？敲顾?、氨芐青霉素購自美國Sigma 公司。DNA marker購于北京全式金生物技術(shù)有限公司。其他試劑均購于北京GE Healthcare Life Sciences China公司。

1.2 方法

1.2.1 擴(kuò)增人源化噬菌體展示單鏈抗體庫 取人源化噬菌體展示單鏈抗體庫菌種母液加入到2×TY-AG培養(yǎng)基（含終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素和1%的葡萄糖）中培養(yǎng)，直至菌液OD600值達(dá)到0.4。從中取50 mL菌液，并向其加入5 μL 滴度為1×1012CFU /mL的KM13輔助噬菌體，在37℃水浴鍋中孵育30 min，以3 300×g離心10 min，棄掉上清液，沉淀的菌種以100 mL 2×TY-AKG培養(yǎng)基（含終濃度為100 μg /mL的氨芐青霉素、50 μg /mL的卡那霉素，以及1%的葡萄糖）重懸，隨即置于30℃搖床中培養(yǎng)過夜。次日將培養(yǎng)物以3 300× g離心30 min，取上清液預(yù)冷后，加入20 mL PEG/NaCl溶液，再以3 300× g離心30 min，棄掉上清液，沉淀物以4 mL PBS溶液重懸。最后重懸液以11 600×g離心10 min，收集上清液即為擴(kuò)增的人源化噬菌體展示單鏈抗體庫。擴(kuò)增后的人源化噬菌體展示單鏈抗體庫滴度參照Lee等［12］報(bào)道方法執(zhí)行。

1.2.2 Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體富集淘篩 取3 mL濃度為100 μg/mL的Bt Cry1C多克隆抗體蛋白溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中并于4℃靜置過夜。次日以PBS溶液洗瓶。取1 mL擴(kuò)增后的人源化噬菌體展示單鏈抗體庫（滴度定量為1010CFU /mL）溶液與4 mL MPBS溶液（含3%的脫脂奶粉）充分混勻，隨后加入到經(jīng)洗滌的細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，以25 r/min緩慢搖動(dòng)1 h，接著再靜置1 h。以PBST溶液（含0. 05%的吐溫-20）洗瓶后，加入1 mL胰蛋白酶溶液用于洗脫與瓶?jī)?nèi)吸附的Bt Cry1C多克隆抗體蛋白特異性結(jié)合的人源化噬菌體單鏈抗體。收集洗脫液即為第一輪富集的Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體次庫，經(jīng)侵染E.coli TG1宿主菌后即可用于次級(jí)庫擴(kuò)增和投入下一輪富集淘篩。按照上述步驟再進(jìn)行3輪Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體的富集淘篩過程，上一輪富集庫經(jīng)擴(kuò)增后用于投入下一輪富集淘篩，包被的Bt Cry1C多克隆抗體蛋白濃度分別遞減為50、25和10 μg/mL。各輪次富集淘篩效果參照Zhang等［13］報(bào)道的多克隆噬菌體ELISA法和庫噬菌體投入/產(chǎn)出比法進(jìn)行分析。

1.2.3 Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體分離與鑒定 將最后一輪富集的噬菌體單鏈抗體庫溶液加入到處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的E.coli TG1中并于37℃水浴鍋中孵育1 h，隨即將菌液涂布到TYEAG固體培養(yǎng)基（含終濃度為100 μg/mL的氨芐青霉素和1%的葡萄糖）上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日，隨機(jī)挑取單菌落接種到每孔含有100 μL 2×TY-AG培養(yǎng)基的96孔板中并于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日每孔取2 μL菌液轉(zhuǎn)接到新的每孔含有100 μL 2×TY-AG培養(yǎng)基的96孔板中，經(jīng)37℃水浴鍋中孵育2 h，接著向每孔菌液中加入25 μL滴度為1×1012CFU /mL的KM13輔助噬菌體，然后轉(zhuǎn)移到30℃水浴鍋中孵育2 h。隨即以1 800× g離心10 min，棄掉上清液，每孔沉淀的菌種以150 μL 2×TY-AK培養(yǎng)基重懸，并置于30℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜，再以1 800×g離心30 min，上清液即含有與單菌落對(duì)應(yīng)的擴(kuò)增的噬菌體展示抗體顆粒。各孔上清液中抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體與Bt Cry1C蛋白多克隆抗體的結(jié)合活性參照Xu等［14］報(bào)道的單克隆噬菌體ELISA法和PCR擴(kuò)增及序列分析進(jìn)行鑒定。

1.2.4 Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體分型鑒定 取經(jīng)鑒定為陽性的Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體單菌落培養(yǎng)物按1.2.1方法進(jìn)行擴(kuò)增并將滴度定量到1010CFU/mL備用。

①抗體間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法（IC-ELISA）。取96孔板，每孔加入100 μL濃度為2 μg/mL 的Bt Cry1C蛋白溶液并于4℃靜置過夜。次日以PBST溶液洗板后，然后以MPBS溶液封閉2 h。洗板后，加入50 μL濃度為10 μg/mL的Bt Cry1C多克隆抗體蛋白溶液和系列體積梯度（0、5、10、20、30、40、50 μL）的上述擴(kuò)增的Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體溶液混合物并于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h。洗板后，每孔加入100 μL羊抗兔IgG［HRP］單克隆抗體稀釋溶液（母液以PBS溶液按1∶5 000稀釋）并于37℃水浴鍋中孵育1 h。洗板后，每孔加入100 μL TMB顯色液并于37℃培養(yǎng)箱中避光反應(yīng)15 min，隨即每孔加入50 μL 2 mol/L的H2SO4溶液終止反應(yīng)，最后測(cè)定OD450值。對(duì)照組為50 μL濃度為10 μg/mL的Bt Cry1C多克隆抗體蛋白溶液和系列體積梯度（0、5、10、20、30、40、50 μL）與Bt Cry1C蛋白不相關(guān)的抗獨(dú)特型單鏈抗體混合物。

②受體間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法（IC-ELISA）。取96孔板，每孔加入100 μL濃度為5 μg/mL 的小菜蛾BBMV（稻縱卷葉螟BBMV）蛋白溶液并于4℃靜置過夜。按上述步驟進(jìn)行“洗板-封閉-再洗板”過程，接著加入50 μL濃度為2 μg/mL的Bt Cry1C蛋白溶液和系列體積梯度（0、5、10、20、30、40、50 μL）的上述擴(kuò)增的Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體溶液混合物并于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h。洗板后，每孔加入100 μL濃度為10 μg/mL的Bt Cry1C多克隆抗體蛋白溶液并于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。按上述步驟進(jìn)行“洗板-封閉-洗板-加羊抗兔IgG［HRP］-再洗板-顯色-終止-測(cè)OD450值”。對(duì)照組為50 μL濃度為2 μg/mL的Bt Cry1C蛋白溶液和系列體積梯度（0、5、10、20、30、40、50 μL）與Bt Cry1C蛋白不相關(guān)的抗獨(dú)特型單鏈抗體混合物。

1.2.5 靶標(biāo)蛋白對(duì)Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體的抑制活性測(cè)定 采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法（IC-ELISA）測(cè)定Bt Cry1C蛋白多克隆抗體（Bt Cry1C pAbs）、稻縱卷葉螟BBMV和小菜蛾BBMV對(duì)經(jīng)鑒定為Bt Cry1C蛋白β類型抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體（命名為E8-Anti-Id scFv）的抑制活性。取96孔板，每孔加入100 μL濃度為10 μg/mL 的Bt Cry1C蛋白多克隆抗體溶液并于4℃靜置過夜。次日將96孔板按1.2.4描述步驟進(jìn)行“洗板-封閉-再洗板”過程，然后加入50 μL滴度定量為1010CFU /mL的E8-Anti-Id scFv溶液和50 μL系列濃度梯度（0.1、0.5、1、2、4、8、10、100 μg/mL）的靶標(biāo)蛋白（Bt Cry1C pAbs、C.medinalis BBMV、P.xylostella BBMV）溶液并于37℃培養(yǎng)箱中孵育2 h。洗板后，每孔加入100 μL anti-M13［HRP］單克隆抗體稀釋溶液（1∶3 000稀釋）并于37℃水浴鍋中孵育2 h。洗板后，按照1.2.4描述步驟進(jìn)行“顯色-終止-測(cè)OD450值”過程。以［（P-S-N）］/（P-N）］×100%計(jì)算公式繪制上述3種供試靶標(biāo)蛋白對(duì)E8-Anti-Id scFv的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。其中P代表陽性對(duì)照的OD450值（測(cè)試樣品為50 μL滴度定量為1010CFU/mL的E8-Anti-Id scFv溶液+50 μL PBS溶液），S代表各標(biāo)準(zhǔn)的OD450值（測(cè)試樣品為50 μL滴度定量為1010PFU的E8-Anti-Id scFv溶液和50 μL系列濃度梯度的靶標(biāo)蛋白溶液），N代表陰性對(duì)照的OD450值（測(cè)試樣品為50 μL PBS溶液）。

1.2.6 Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體抗蟲活性測(cè)定 采用制劑浸葉法測(cè)定Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體展示單鏈抗體抗（E8-Anti-Id scFv）對(duì)稻縱卷葉螟和小菜蛾的殺蟲活性。供試的E8-Anti-Id scFv樣品為溶于PBS溶液中的噬菌體展示單鏈抗體（滴度為1.2×108CFU/mL），陽性對(duì)照為溶于PBS溶液中的Bt Cry1C蛋白（濃度為20 μg/mL），陰性對(duì)照為PBS溶液。取新鮮水稻葉片和甘藍(lán)葉片分別投入到上述3種供試的樣品中浸漬15 min，取出葉片晾干，然后分別置于培養(yǎng)皿中。挑取處于三齡幼蟲階段的稻縱卷葉螟和小菜蛾，按每個(gè)培養(yǎng)皿20頭的蟲子數(shù)分別投入到經(jīng)過浸藥處理的水稻葉片和甘藍(lán)葉片上進(jìn)行生測(cè)飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。每24 h記錄一次培養(yǎng)皿中供試蟲子的狀態(tài)，每個(gè)處理組重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。供試蟲子校正死亡率計(jì)算方法和誤差分析均參照仲建鋒等［15］報(bào)道方法執(zhí)行。

2 結(jié)果

2.1 Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體基因工程抗體富集

通過多輪 “投入-吸附-洗脫-擴(kuò)增-再投入”過程，原始庫中能與靶標(biāo)抗原結(jié)合的噬菌體抗體即可被逐漸捕獲并得到富集。如表1所示，以梯度濃度的Bt Cry1C蛋白多克隆抗體為包被抗原，將各輪次投入庫滴度定量在1010CFU /mL的同等水平條件下，經(jīng)過4輪次的富集淘篩過程，最后一輪產(chǎn)出的噬菌體滴度由第一輪的3.32×106CFU /mL逐漸上升到了3.12×109CFU/mL，投入產(chǎn)出比提高了近750倍。進(jìn)一步采用多克隆噬菌體ELISA法測(cè)定各輪次富集的噬菌體展示抗體顆粒與Bt Cry1C蛋白多克隆抗體的結(jié)合活性，結(jié)果如圖1所示，各輪富集后的噬菌體展示抗體對(duì)Bt Cry1C蛋白多克隆抗體的ELISA結(jié)合活性的平均值分別為0.316、0.541、0.649和0.716，而原始庫為0.209。最后一輪富集庫中的噬菌體多克隆抗體顆粒對(duì)Bt Cry1C蛋白多克隆抗體的ELISA結(jié)合活性較原始庫提高了近3.4倍。兩種不同測(cè)定方法均顯示經(jīng)過4輪次生物淘篩，原始庫中能與Bt Cry1C蛋白多克隆抗體結(jié)合的噬菌體展示抗體顆粒（即含Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體基因工程抗體）得到了有效富集，這為下一步靶標(biāo)單克隆噬菌體抗體高效篩選創(chuàng)造了條件。

表1 各輪次生物淘篩過程中噬菌體顆粒的投入和產(chǎn)出Table 1 Input and output of phage particles in each round of biopanning

圖1 各輪次富集噬菌體顆粒對(duì)Bt Cry1C蛋白多克隆抗體的多克隆噬菌體ELISA Fig. 1 Polyclonal phage ELISA of each round of enriched library phage particles for Bt Cry1C pAbs（Polyclonal antibodies）

2.2 陽性Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型基因工程抗體篩選與鑒定

以陽性反應(yīng)OD450值/陰性反應(yīng)OD450值（P/N）＞2.1為陽性克隆的判定標(biāo)準(zhǔn)，如圖2所示，從第4輪富集庫中共淘篩獲得了9個(gè)陽性克隆。其中ELISA值最高的是編號(hào)為E8的陽性克?。麨镋8-Anti-Id scFv），OD450值達(dá)到0.968，陰性為0.118，P/N值=8.2。采用特異性PCR擴(kuò)增分析，結(jié)果顯示，上述9個(gè)陽性克隆均含有與人源化單鏈抗體基因大小相符的目的條帶（圖3）。經(jīng)過測(cè)序及其核酸比對(duì)，均存在典型人源特征的4個(gè)重鏈骨架區(qū)（H-FR1-4）、3個(gè)重鏈可變區(qū)（H-CDR1-3）和4個(gè)輕鏈骨架區(qū)（H-FR1-4）、3個(gè)輕鏈可變區(qū)（H-CDR1-3）（圖4）。由此確證，陽性Bt Cry1C毒素抗獨(dú)特型人源單鏈抗體獲得成功篩選，可供后續(xù)進(jìn)一步抗體特性和生物活性分析。

圖2 陽性克隆對(duì)Bt Cry1C蛋白多克隆抗體的單克隆噬菌體ELISA Fig. 2 Monoclonal phage ELISA of positive clones for Bt Cry1C pAbs

圖3 陽性單克隆人源單鏈抗體基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig. 3 PCR amplified products of positive monoclonal human scFvs genes

圖4 陽性單克隆人源單鏈抗體基因?qū)?yīng)氨基酸序列比對(duì)Fig. 4 Amino acid sequences aligment of positive monoclonal human scFvs genes

2.3 Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體基因工程抗體分型及其靶標(biāo)蛋白結(jié)合能力

如圖5-A所示，以Bt Cry1C蛋白作為固相包被原，供試的Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體基因工程抗體（E8-Anti-Id scFv）能明顯競(jìng)爭(zhēng)Bt Cry1C蛋白多克隆抗體與Bt Cry1C蛋白結(jié)合，而對(duì)照組中Bt Cry1C蛋白不相關(guān)的抗獨(dú)特型單鏈抗體則沒有表現(xiàn)出任何抑制活性。與此同時(shí)，分別以Bt Cry1C蛋白靶標(biāo)受體稻縱卷葉螟BBMV（圖5-B）和小菜蛾BBMV（圖5-C）作為固相包被原，供試的E8-Anti-Id scFv能明顯競(jìng)爭(zhēng)Bt Cry1C蛋白與其靶標(biāo)受體稻縱卷葉螟BBMV和小菜蛾BBMV結(jié)合，而對(duì)照組中Bt Cry1C蛋白不相關(guān)的抗獨(dú)特型單鏈抗體對(duì)這兩種受體均沒有表現(xiàn)出任何抑制活性。由此證實(shí)供試的E8-Anti-Id scFv確實(shí)屬于β類型抗獨(dú)特型抗體，具備模擬Bt Cry1C蛋白部分結(jié)構(gòu)或生物活性特性。采用間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法（圖6），測(cè)得E8-Anti-Id scFv靶標(biāo)蛋白Bt Cry1C蛋白多克隆抗體、小菜蛾BBMV和稻縱卷葉螟BBMV對(duì)其抑制中濃度（IC50）分別為2.625、3.638和4.605 μg/mL，符合高結(jié)合活性特征。

圖5 基于間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的E8-Anti-Id scFv分型測(cè)定Fig. 5 Determination of the type of E8 -Anti-Id scFv based on IC-ELISA

圖6 基于間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA法的E8-Anti-Id scFv競(jìng)爭(zhēng)抑制率測(cè)定Fig. 6 Determination of the competitive inhibition of E8 -Anti-Id scFv based on IC-ELISA

2.4 Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體基因工程抗體室內(nèi)生測(cè)

稻縱卷葉螟和小菜蛾分別以PBS溶液（CK-）、Bt Cry1C蛋白溶液（CK+）和Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體基因工程抗體（E8-Anti-Id scFv）溶液浸漬處理過后的水稻葉片和甘藍(lán)葉片為食，飼養(yǎng)效果如圖7所示，CK-組飼養(yǎng)的蟲子生長(zhǎng)狀態(tài)正常，CK+組飼養(yǎng)的蟲子發(fā)生大量死亡現(xiàn)象，而以E8-Anti-Id scFv溶液處理的蟲子同樣出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，但死亡量均達(dá)不到CK+組程度。經(jīng)多組實(shí)驗(yàn)科學(xué)測(cè)算（表2），以滴度為1.2×108CFU /mL濃度條件下的噬菌體展示形式的E8-Anti-Id scFv溶液處理后的水稻葉片為食，稻縱卷葉螟在24 h、48 h和72 h內(nèi)的校正死亡率為29.83%、44.32%和52.82%，其中72 h內(nèi)對(duì)稻縱卷葉螟的殺蟲活性達(dá)到供試濃度為20 μg/mL的原Bt Cry1C蛋白（校正死亡率為72.15%）溶液的73.21%；而以同樣滴度濃度條件下的噬菌體展示形式的E8-Anti-Id scFv溶液處理后的甘藍(lán)葉片為食，小菜蛾在24 h、48 h和72 h內(nèi)的校正死亡率為26.38%、48.99%和58.69%，其中72 h內(nèi)對(duì)小菜蛾的殺蟲活性達(dá)到供試濃度為20 μg/mL的原Bt Cry1C蛋白（校正死亡率為75.36%）溶液的77.87%。由此說明，采用抗獨(dú)特型抗體技術(shù)靶向制備的Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型噬菌體基因工程抗體（E8-Anti-Id scFv）在一定程度上具備模擬Bt Cry1C蛋白部分結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性的功能。

表2 E8-Anti-Id scFv對(duì)小菜蛾和稻縱卷葉螟室內(nèi)殺蟲活性Table 2 Insecticidal activities of E8-Anti-Id scFv to C. medinalis and P. xylostella indoor

圖7 E8-Anti-Id scFv在48 h內(nèi)對(duì)稻縱卷葉螟和小菜蛾室內(nèi)殺蟲效果Fig. 7 Insecticidal effects of E8-Anti-Id scFv to C. medinalis and P. xylostella at 48 h indoor

3 討論

英國劍橋大學(xué)構(gòu)建的人源化噬菌體展示單鏈抗體庫是目前商品化應(yīng)用較為廣泛的大容量?jī)?yōu)質(zhì)基因工程抗體庫源材料，應(yīng)用范圍已涉及生物醫(yī)藥和分子診斷以及農(nóng)業(yè)危害物免疫檢測(cè)等領(lǐng)域［16-18］。研究選取該庫作為優(yōu)質(zhì)庫源材料，一方面寄希望于該庫的大容量和多樣性為富集淘篩獲得到Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型抗體，特別是捕獲β類型的具備模擬Bt Cry1C蛋白抗蟲功能的抗獨(dú)特型基因工程抗體提供了更大的可能性；另一方也希望得利于該庫單鏈抗體的人源化屬性特征，從中淘篩獲得的可模擬Bt Cry1C蛋白抗蟲功能的抗體材料在后期應(yīng)用上對(duì)人類更為安全，因?yàn)槿嗽椿贵w理論上對(duì)人體免疫系統(tǒng)幾乎不存在異源免疫排斥反應(yīng)。

商品化的噬菌體抗體庫主要優(yōu)勢(shì)在于可供篩選的對(duì)象廣，只要庫容量足夠大，多樣性足夠豐富，理論上就可以適用于所有抗原特異性抗體的篩選，這也意味著能成功篩選到靶標(biāo)抗體的難度會(huì)很大、效率也會(huì)較低。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，通過4輪富集淘篩，在大規(guī)模分離單克隆和高通量分析過后，只獲得9個(gè)具備Bt Cry1C蛋白抗獨(dú)特型抗體特征的陽性克隆，且僅有1個(gè)陽性克隆符合β類型，這也從側(cè)面印證了商品化抗體庫的不足之處。因此，為了更為精準(zhǔn)地靶向淘篩具有模擬抗原結(jié)構(gòu)和生物活性的抗獨(dú)特型抗體，優(yōu)化庫源材料和篩選策略極為必要。從庫源材料來看，以抗原的抗體為免疫原，通過免疫動(dòng)物然后構(gòu)建抗原偏向性免疫噬菌體抗體庫作為庫源材料，這樣相當(dāng)于借助動(dòng)物機(jī)體免疫反應(yīng)在動(dòng)物體內(nèi)進(jìn)行了靶標(biāo)抗獨(dú)特型抗體及其基因的富集，這樣的庫再投入淘篩過程，在篩選概率和效率上顯然較非免疫的隨機(jī)庫要更高，這種策略在免疫檢測(cè)用抗體篩選上已有報(bào)道可供借鑒［19］。從篩選策略來看，貫穿富集篩選整個(gè)過程的各個(gè)步驟都可能影響篩選效率。首先固相包被的抗體材料，通過酶切方式將非抗原結(jié)合片段去掉，以F（ab）2活性片段作為包被靶點(diǎn)，使抗獨(dú)特型抗體更容易被捕獲，可以提高富集篩選效率［20］；其次富集篩選和鑒定過程中的蛋白封閉液，通過交替使用不同類型的蛋白封閉液，能極大減少庫中非靶標(biāo)抗體殘留，從而有效的將靶標(biāo)抗體捕獲，進(jìn)而提高陽性率［21］。

研究中靶向淘篩獲得的具有模擬Bt Cry1C蛋白抗蟲功能的噬菌體展示形式的抗獨(dú)特型噬菌體基因工程抗體（E8-Anti-Id scFv），在噬菌體滴度為1.2×108CFU/mL濃度條件下，對(duì)供試的水稻常見靶標(biāo)害蟲稻縱卷葉螟和葉菜類常見靶標(biāo)害蟲小菜蛾展示出較為明顯的殺蟲活性，初步具備進(jìn)一步研究的價(jià)值和深入挖掘應(yīng)用的潛力。但其對(duì)供試的兩種典型的靶標(biāo)害蟲致死率均低于60%，且抗蟲活性只能達(dá)到濃度為20 μg/mL的原Bt Cry1C蛋白的75%左右，因此就目前呈現(xiàn)效果來看，該材料到可替代原Cry1C蛋白進(jìn)行示范應(yīng)用仍然可能存在很大差距。因供測(cè)試的E8-Anti-Id scFv是以噬菌體展示形式存在，其濃度只能采用噬菌體滴度進(jìn)行初步定量，而供試的Cry1C是以其蛋白質(zhì)量濃度進(jìn)行定量的，兩者定量方式不一樣，因此兩種供試的材料所呈現(xiàn)出的抗蟲效果在各自濃度方式上并沒有太直接的可比性，僅僅只是作為初步參照對(duì)比。就E8-Anti-Id scFv材料本身價(jià)值來說，還有待后續(xù)進(jìn)一步深入研究，特別是有必要對(duì)該抗體材料進(jìn)行克隆表達(dá)制備出具有穩(wěn)定活性的純單鏈抗體蛋白，以便用于分析其具體的抗蟲譜、抗蟲活性值以及與其他Bt Cry蛋白是否存在交互抗性等關(guān)鍵性評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究采用抗獨(dú)特型抗體創(chuàng)制路徑，首次從人源化噬菌體展示抗體庫中成功靶向淘篩得到了具備可初步模擬Cry1C蛋白抗蟲功能的單鏈抗體材料，無論是技術(shù)路徑還是抗蟲材料本身都是極大的創(chuàng)新，為綠色生物農(nóng)藥創(chuàng)新發(fā)展提供了潛在可行的實(shí)例依據(jù)。此外，由于噬菌體展示形式的基因工程抗體因其表型與基因型一致，獲得靶標(biāo)抗體的同時(shí)也捕獲了其對(duì)應(yīng)基因［22］，因此E8-Anti-Id scFv即便是存在抗蟲活性不強(qiáng)的問題，在后續(xù)研究中仍然可以借助諸如定點(diǎn)飽和突變技術(shù)［15］、鏈置換技術(shù)［23］、易錯(cuò)PCR技術(shù)［24］等目前較為成熟的抗體體外親和成熟技術(shù)在基因水平上對(duì)其進(jìn)行定向改造，有望大幅度提高其殺蟲活性，從而進(jìn)一步推進(jìn)其應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

基于抗獨(dú)特型抗體理論和技術(shù)，成功獲得了具備初步模擬Bt Cry1C蛋白抗蟲功能的人源單鏈抗體，實(shí)現(xiàn)了靶向創(chuàng)制可模擬Bt Cry蛋白殺蟲功能的新型抗體材料，可作為優(yōu)質(zhì)的抗蟲基因工程抗體模板，為后續(xù)改造研究創(chuàng)造了可能。