miR-665在奶牛乳腺上皮細胞炎癥中的表達及功能分析

李宇航 王興平 楊箭 羅仍卓么 任倩倩 魏大為 馬云

（1. 寧夏大學農(nóng)學院，銀川 750021；2. 寧夏回族自治區(qū)反芻動物分子細胞育種重點實驗室，銀川 750021）

奶牛乳腺炎發(fā)病率很高，是奶牛最常見的疾病之一，難以根除，對牧場的經(jīng)濟效益造成了巨大影響［1］。引起乳腺炎的原因復雜，主要與遺傳、病原微生物感染和飼養(yǎng)管理等多個因素有關［2］，其中遺傳因素與乳腺炎的易感性和抗病性密切相關。研究表明，奶牛乳腺炎的發(fā)生和發(fā)展過程受多個基因調節(jié)［3-4］，其分子調控機制尚未完全闡明。

microRNA（miRNA）是一類廣泛存在于真核細胞中的內源性非編碼小RNA，長度約20-25個核苷酸，可通過靶向mRNA的3'UTR來調節(jié)mRNA的轉錄和翻譯，從而參與調節(jié)多種生理及病理過程的發(fā)生和發(fā)展［5］。研究發(fā)現(xiàn)，miRNA是涉及炎癥、癌癥等多種疾病的重要調控因子［6-7］。就奶牛乳腺炎而言，學者們篩選了大量的乳腺炎差異表達miRNA［8-11］，但是僅有少數(shù)的miRNA進行了功能研究。如miR-146a可通過下調Toll樣受體4（toll-like receptor 4，TLR4）/腫瘤壞死因子受體相關因子6（tumor necrosis factor receptor related factor 6，TRAF6）/核轉位因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）通路減輕奶牛乳腺炎癥［12］，miR-23a通過靶向磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3 kinases，PI3K）抑制乳腺炎癥反應［13］，仍有大量的差異表達miRNA有待于進一步探索。

MiR-665是miRNA家族成員之一。在人類的炎癥性疾病中，miR-665在結腸炎中顯著上調，通過抑制X盒結合蛋白1（X-box binding protein-1，XBP1）和血清類黏蛋白1樣蛋白質3（Orosomucoid 1-like 3，ORMDL3）而誘導細胞凋亡和結腸炎［14］。miR-665通過靶向髓樣細胞觸發(fā)受體2（triggering receptor expressed on myeloid cells 2，TREM2）基因抑制人脊髓損傷后的炎癥反應［15］。在小鼠中，miR-665在真菌引起的角膜炎中表達上調，通過靶向自噬相關基因5（autophagy-related gene 5，ATG5）加重角膜炎癥［16］。在奶牛乳腺炎中，前期通過乳腺組織的轉錄組測序分析，發(fā)現(xiàn)miR-665在大腸桿菌（E. coli）型乳腺炎奶牛的乳腺組織中的表達顯著上調［8］，但是，miR-665在奶牛乳腺炎中的分子作用機制尚不清楚。因此，本實驗研究了miR-665在奶牛乳腺炎上皮細胞炎癥反應中的表達水平和調控作用，以期為奶牛乳腺炎的分子調控機制解析和分子育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究以實驗室凍存的、經(jīng)鑒定的奶牛乳腺上皮細胞作為實驗材料。

PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒和Trizol試劑購自寶日醫(yī)生物技術（北京）有限公司，2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（withTli RNaseH）熒光定量檢測試劑盒購自北京聚合美生物科技有限公司，胰酶消化液、DMEM/F12培養(yǎng)基和PBS緩沖液購自Hyclone公司（美國），胎牛血清購自BI公司（以色列），LPS購自Sigma-Aldrich公司（美國），引物由通用生物系統(tǒng)（安徽）有限公司 合成。

厲新建（1973— ），男，浙江東陽人，博士，北京第二外國語學院教授，研究方向：旅游經(jīng)濟發(fā)展戰(zhàn)略、旅游企業(yè)跨國（境）經(jīng)營等。通訊作者。

1.2 方法

1.2.1 乳腺上皮細胞的培養(yǎng)及炎癥誘導 將乳腺上皮細胞解凍后，采用10%胎牛血清的DFEM/F12培養(yǎng)基，在37℃、5% CO2濃度和100%飽和濕度的條件下，接種培養(yǎng)于6孔細胞培養(yǎng)板中。待細胞融合至60%-70%時，利用50 ng/μL LPS誘導細 胞［17-18］，分別在誘導的0（未處理對照組）、3、6和12 h收集細胞，用于RNA提取。通過細胞炎癥因子的qPCR檢測確定炎癥誘導是否成功。

通過不同時期的三顏色通道分布圖可以看出該菌體不同生長時期渾濁度的不同帶來的HSV顏色平均值的變化滿足一定的曲線變化規(guī)律，也符合菌體繁殖生長所經(jīng)歷的的遲緩期，對數(shù)期，穩(wěn)定期三個時期的變化.能給客觀的通過顏色特征值的改變的反應培養(yǎng)孔菌體不同生長時期菌體數(shù)量的變化，能為菌體生長情況的篩選提供依據(jù).

表1 miR-665的逆轉錄及qPCR引物Table 1 Reverse transcription and qPCR primers of miR-665

越來越多的研究表明，miRNA是炎癥的重要調節(jié)因子。在奶牛乳腺炎中許多miRNA已被發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生不同的作用［12-13，22-23］。同樣，miR-665被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥疾病中發(fā)揮著重要的作用，但其在不同的癌癥中作用不一致，如在人胃癌和卵巢癌中分別靶向蛋白磷酸酶2調節(jié)亞基（protein phosphatase 2 regulatory subunit Balpha，PPP2R2A）和同源框基因A10（homeobox A10，HOXA10），起到抑制癌癥的作用［24-25］。然而，在乳腺癌中miR-665通過靶向核受體亞家族4A組成員3（nuclear receptor subfamily 4 group A member 3，NR4A3）激活促進人乳腺癌細胞的侵襲和轉移［26］。

使用DAVID Bioinformatics Resources 6.8（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）數(shù)據(jù)庫對潛在靶基因的分子功能（molecular function，MF）、生物學過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）進 行gene ontology（GO）功 能注釋，并進行京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路分析，以篩選P＜0.05為閾值，綜合確定miR-665的生物學功能。

1.2.4 miR-665潛在關鍵靶基因的篩選及其在奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應中的表達檢測 根據(jù)miR-665的靶基因預測和KEGG及GO功能注釋結果，結合細胞炎癥相關信號通路上的關鍵基因，篩選出絲裂原活化蛋白激酶14（mitogen-activated protein kinase 14，MAPK14）、絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶2（mitogen-activated protein kinase kinase kinase 2，MAP3K2）、SMAD家族成員2（SMAD family member 2，SMAD2）、特 異 性 蛋 白1（specificity protein 1，SP1）共4個炎癥相關基因。

布萊德先生說：“當給予適當?shù)臈l件的時候，人們是很愿意討論死亡的，特別是當死亡迫在眉睫的時候。剛來的人，大都比較緊張，對死亡不了解，不知道自己將怎樣邁向死亡。我們讓他接受冥想訓練。其核心就是當生命的最后一瞬間，只有你一個人，你將如何走向死亡。這真是一個很有效的訓練。當反復訓練終于完成之后，病人就不再害怕死亡了。我們把最后的時刻簡稱為‘在床邊’，因為死神是在床邊帶走我們的。那種時候，往往是你一個人。當然，我們這里是24小時都有人值班的，但我們不能保證你‘在床邊’的時候，旁邊一定會有人。所以，每個人都要練習獨自一個人‘在床邊’，在那種時刻，保持最后的平靜?！?/p>

分別以奶牛乳腺上皮細胞炎癥誘導0、3、6和12 h的cDNA為模板，用表2中的引物進行上述4個潛在關鍵靶基因的qPCR檢測，反應體系和反應條件同1.2.2。

表2 miR-665潛在關鍵靶基因的qPCR引物Table 2 qPCR primers for potential key target genes of miR-665

為探討miR-665在LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞中的表達情況，采用qPCR技術檢測了miR-665在LPS誘導乳腺上皮細胞0、3、6和12 h的表達情況。結果表明，與對照組0 h相比，miR-665在LPS誘導炎癥反應的3、6和12h的表達量均極顯著上調（P＜0.01）（圖2）。

2 結果

2.1 LPS誘導奶牛乳腺上皮細胞產(chǎn)生炎癥反應

為進一步探討miR-665在乳腺上皮細胞炎癥反應中的作用，根據(jù)靶基因預測、KEGG通路、GO功能注釋，結合主要細胞炎癥與機體免疫關鍵信號通路，初步得到了MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1共4個基因與炎癥和機體免疫密切相關。隨后采用qPCR技術檢測了上述4個基因在LPS誘導的炎性乳腺上皮細胞中的表達量，結果表明，與對照組（0 h）相比，MAPK14、SMAD2和SP1基因在LPS誘導細胞3、6和12h的表達均極顯著下調（P＜0.01），MAP3K2基因在LPS誘導細胞6和12 h的表達極顯著下調（P＜0.01）（圖7）。值得注意的是，這4個基因與miR-665表達變化呈相反趨勢。

圖1 主要炎癥因子在LPS誘導的乳腺上皮細胞炎癥中的表達Fig.1 Expression of major inflammatory factors in the LPSinduced inflammation of mammary epithelial cells

2.2 miR-665在LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞中的表達規(guī)律

1.2.5 基因表達量的統(tǒng)計分析 以GAPDH和RPS18為雙內參，采用2-ΔΔCt法［19］分析相對表達量計算，以均數(shù)±標準差（±s）表示。每個處理進行了3個生物學重復試驗。采用SPSS 25.0軟件，通過獨立樣本t檢驗進行組間的差異表達顯著性檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1）實驗組和對照組總體情況比較。實驗組實際參與測試的人數(shù)為33名；對照組實際參與測試的人數(shù)為29名（病假四名）。測試題目有問答題目、聽力測試、認讀卡片、背誦兒歌，共100分。從表1可以看出，實驗組在聽說訓練等方面的均分均高于測試組。

圖2 miR-665在LPS誘導的乳腺上皮細胞中的表達量檢測Fig.2 Expression detection of miR-665 in the LPS-induced mammary epithelial cells

2.3 miR-665的基因定位及保守性分析

應用miRBase可知奶牛miR-665位于21號染色體上。另外，對奶牛、人和小鼠等物種的miR-665序列進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-665在物種間高度保守（圖3），說明牛miR-665可能具有與人、小鼠等其他動物相似的功能。

由于拱棚栽培升溫快，土壤水分蒸發(fā)量大，因此播種時如底墑不足，最好先澆水再播種，澆水時應逐溝、分段進行，注意控制水量和水流速度。

圖3 牛與人、小鼠miR-665的序列對比圖Fig.3 Sequence comparison of miR-665 from bovine，human and mouse

2.4 miR-665靶基因的預測、GO功能注釋及KEGG通路分析

為探討miR-665的生物學功能，預測了miR-665的靶基因。結果顯示，Target Scan在線工具預測出2 127個靶基因，miRWalk預測出1 019個靶基因。二者取交集后共得到了201個潛在靶基因（圖4）。

圖4 miR-665差異表達的潛在靶基因篩選的韋恩圖Fig.4 Venn diagram for screening potential target genes differentially expressed by miR-665

對MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因 進 行保守性分析（表3）。結果表明，牛MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1與小鼠和人的序列相似性達84.34%-93.96%，具有較高的保守性，說明以上4個基因在牛與小鼠和人之間具有相似的生物學功能。

圖5 miR-665潛在靶基因的GO功能注釋結果Fig.5 GO functional annotation results of miR-665 potential target genes

圖6 miR-665潛在靶基因的KEGG通路分析結果Fig.6 Results of KEGG pathway analysis of miR-665 potential target genes

2.5 miR-665相關基因在奶牛乳腺上皮細胞炎癥中的表達分析

為證實炎癥誘導是否成功，本研究采用qPCR技術，檢測了用LPS誘導奶牛乳腺上皮細胞中主要炎癥因子IL-1β和IL-8的表達量，結果表明，與對照組0 h相比，IL-1β和IL-8在LPS誘導的3 h、6 h和12 h的細胞中的表達水平均顯著上調（圖1）。上述結果證明，LPS成功誘導了奶牛乳腺上皮細胞產(chǎn)生炎癥反應。

圖7 miR-665相關基因在奶牛乳腺上皮細胞炎癥中的表 達量Fig.7 Expression of miR-665 related genes in the bovine mammary epithelial cell inflammation

2.6 物種間MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因的保守性分析

201個潛在靶基因的GO功能富集發(fā)現(xiàn)，這些基因分子功能主要包含泛素蛋白連接酶活性、G蛋白結合、泛素樣蛋白連接酶活性，主要富集在突觸囊泡膜、胞外囊泡膜、細胞器膜的內在成分、突觸小泡、突觸囊泡等，生物學過程主要為對脂肪酸的反應、蛋白質去磷酸化負調節(jié)、突觸囊泡周期調節(jié)、去磷酸化負調節(jié)等（圖5）。KEGG通路分析結果表明，上述基因參與MAPK、心肌細胞的腎上腺素能信號、癌癥中的蛋白多糖、黏附連接、白細胞跨內皮遷移、上皮細胞的細菌入侵等炎癥反應或機體免疫相關的信號通路（圖6）。

“共享單車”首例觸犯刑案即是“私藏共享單車”。2016年，上海市閔行區(qū)人民法院對首例共享單車刑案做出一審判決，以盜竊罪判處犯罪人韓某某拘役三個月，緩刑三個月，并處罰金一千元。本案的具體案情為：五十二歲的韓某某因見門口的共享單車幾日無人使用，便想自己占有一輛，于是趁無人注意時，將車直接搬入自己家中，但因無法開鎖，便擱置家中。

表3 牛與人、小鼠相關基因的同源性分析結果Table 3 Homology analysis of related genes in the bovine，human and mouse

3 討論

奶牛乳腺炎是乳腺組織產(chǎn)生的炎癥反應，可導致牛奶的產(chǎn)量和質量下降［20］。在缺乏有效治療的情況下，使牛奶繁殖力下降，利用年限減少，對牧場造成極大的經(jīng)濟損失［21］。E. coli是引起奶牛臨床型乳腺炎最常見的病原微生物之一。LPS是E. coli外膜的主要成分，能夠促使IL-1β和IL-8等炎癥細胞因子分泌，啟動炎癥反應和機體免疫［20］。乳腺上皮細胞是識別病原體入侵的第一道防線，是奶牛乳腺免疫系統(tǒng)的重要組成部分，在LPS誘導后，常常作為乳腺炎研究的細胞模型［12］。

1.2.2 細胞RNA提取、主要炎癥因子mRNA及miR-665的RT-qPCR檢測 采用TriZol試劑盒，按照產(chǎn)品說明書提取上述經(jīng)LPS誘導的乳腺上皮細胞的總RNA。用電泳和紫外微量分光光度計檢測RNA的濃度與質量。采用Primer Permier 5.0軟件設計白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）和白介素-8（interleukin-8，IL-8）炎癥因子基因和miR-665的頸環(huán)逆轉錄引物（表1），使用PrimeScriptTMRT Reagent Kit with gDNA Eraser逆轉錄試劑盒分別進行miR-665，IL-1β和IL-8炎癥因子mRNA的cDNA合成。以此cDNA為模板，用2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（withTli RNaseH）熒光定量檢測試劑盒，在伯樂CFX-96熒光定量PCR儀上檢測miR-665和相關mRNA在細胞中的表達量。反應體系為：2×M5 HiPer SYBR Premix EsTaq（withTli RNaseH）10 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA模板1.0 μL，加滅菌去離子水至20 μL。反應條件為：預變性95℃ 30 s，95℃ 5 s、60℃ 30 s共40個循環(huán)，95℃ 10 s，65℃ 5 s。

1.2.3 miR-665的靶基因預測及生物信息學分析 通 過miRBase（http：//www.mirbase.org/）和NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）在 線 工 具 獲 得miR-665的序列、染色體定位等基本信息，并利用DNAman軟件分析物種進化保守性。使用Target Scan（http：//www.targetscan.org/vert_72/）和miRWalk （http：//mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/）兩種在線軟件預測miR-665的靶基因，再利用VENNY 2.1在線軟件（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取交集，最終確定miR-665的潛在靶基因范圍，用于后續(xù)分析。

在奶牛乳腺炎的研究中，迄今為止未見miR-665調控作用的研究報道。因此，本研究以LPS誘導的乳腺上皮細胞為炎癥模型，發(fā)現(xiàn)miR-665在奶牛乳腺上皮細胞炎癥反應不同時間的表達量均顯著上調，與LPS誘導的奶牛乳腺組織炎癥中的測序結果一致［8］，提示miR-665在奶牛乳腺炎中發(fā)揮著重要的作用。此外，通過生物信息學分析，發(fā)現(xiàn)miR-665可能調節(jié)201個潛在靶基因，其中部分靶基因參與的MAPK信號通路、上皮細胞的細菌入侵、Th17細胞分化、腫瘤壞死因子信號通路、PPAR信號通路、ErbB信號通路等與炎癥的發(fā)生、發(fā)展，細胞的周期和凋亡等具有密切關系［27-30］。

這樣的生活化操作方式有效激發(fā)了學生的學習熱情，在學生剪紙完成后教師再加以適當?shù)膯栴}引導。比如說計算學生這次剪紙過程中所用去的剪紙總量，然后學生便會運用到本課分數(shù)加減法的知識點列出算式1/9+1/9+2/9+1/9等于5/9。然后讓學生利用分數(shù)減法對剪紙剩余部分進行分數(shù)計算，學生便會列出1-5/9等于4/9這樣的分數(shù)算式。通過這樣的實踐操作能力，使學生通過實踐獲得對知識的深層次理解，學生在操作過程中便能進行對數(shù)學問題的構建，加強對知識的深入思考。在進行計算時學生有效地通過實踐獲得準確的算式組合，從而得到正確的探究結論。

值得注意的是，通過生物信息學和qPCR聯(lián)合分析發(fā)現(xiàn)，miR-665可能靶向或間接調控4個基因，分別為MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1。其中，MAPK14是MAPK蛋白激酶的成員，在炎癥、癌癥及自身免疫中起著關鍵作用［31］。它可以被趨化因子、氧化應激、白介素-1（interleukin-1，IL-1）、細菌LPS和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）等多種因子激活［31］。LPS誘導的急性肺損傷小鼠肺組織中，抑制MAPK14能阻斷MAPK信號通路，阻斷促炎細胞因子的上調，從而減輕LPS誘導的小鼠急性肺損傷［32］。在LPS誘導的人心肌細胞炎癥反應中，上調MAPK14的表達，能夠加重心肌炎癥和心肌損傷［33］。同樣，MAP3K2也是MAPK信號通路中的上游基因，在炎癥中發(fā)揮著促進作用［34］。如在大鼠的心肌梗死中，MAP3K2能夠促進炎癥和細胞凋亡，加重心肌損傷［35］。Wu等［36］發(fā)現(xiàn)MAP3K2能夠通過腸內的輔助性T細胞1（T helper cell 1，Th1）的介導而加重小鼠結腸炎；反之，阻斷T細胞特異性IL-18R-MAP3K2信號通路可以通過抑制Th1細胞的增殖來減輕小鼠腸道炎癥。本研究中，MAPK14和MAP3K2在乳腺上皮細胞炎癥中的表達量顯著下調，與miR-665的表達呈負相關，發(fā)現(xiàn)miR-665、MAPK14和MAP3K2在物種間的高度保守，推測miR-665可能通過抑制MAPK14與MAP3K2基因的表達而緩解乳腺上皮細胞的炎癥并抑制乳腺上皮細胞的凋亡。此外，我們還發(fā)現(xiàn)MAP3K2在LPS誘導3 h的乳腺上皮細胞中表達極顯著上調，推測MAP3K2的表達量升高可能是LPS刺激細胞初期的應激反應，而在后期表達量降低，進而發(fā)揮對細胞炎癥的調節(jié)作用。

SMAD2是轉化生長因子β（transforming growth factor β，TGF-β）信號通路中的下游分子，能夠調節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡及自噬等多種生物學過程，在炎癥的不同時期發(fā)揮著重要的作用［37-38］。研究表明，在大鼠肝損傷模型中，激活TGF-β1/Smad2信號通路可促進敗血癥性肝損傷的發(fā)生［39］。在炎癥引起的肺纖維化中，抑制基質金屬蛋白酶9（matrix metallopeptidase 9，MMP-9）和TGF-β/Smad2/3通路的激活能夠阻斷EMT的發(fā)生［40］。此外，Smad2和Smad3在腎臟疾病中被激活，通過TGF-β/Smad和NF-κB的激活加劇腎纖維化和炎癥［41］。Qin等［42］發(fā)現(xiàn)SMAD2基因的敲除對腎毒性和缺血性急性腎損傷小鼠模型的腎損傷、程序化細胞死亡和腎炎癥均有保護作用。因此，推測miR-665可能通過負調節(jié)SMAD2進而減輕奶牛乳腺炎癥。

SP1在乳腺癌、胃癌和肺癌等多種癌癥中過度表達［43-45］，調節(jié)腫瘤細胞的增殖及凋亡。在炎癥中SP1也發(fā)揮著重要的作用。Wang等［46］發(fā)現(xiàn)miR-29c可能通過直接靶向SP1而減輕帕金森病的炎癥反應。此外，通過抑制SP1和NF-κB信號通路的基因治療可能為調控脂質代謝及動脈粥樣硬化相關炎癥性疾病提供了一個新的靶點［47-48］，表明在奶牛乳腺上皮細胞炎癥中，miR-665也可能靶向SP1發(fā)揮抑炎作用。

綜上所述，miR-665在炎性乳腺上皮細胞中的表達量顯著上調，與潛在靶基因的MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1的表達量呈相反趨勢，說明miR-665可能靶向或間接調控MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因而緩解乳腺上皮細胞的炎癥反應并抑制乳腺上皮細胞的凋亡。

4 結論

奶牛miR-665在LPS誘導炎癥的奶牛乳腺上皮細胞中的表達上調，與潛在靶基因MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1的表達量呈顯著相反趨勢；上述基因在牛、人和小鼠中高度保守。miR-665可能靶向或間接調控MAPK14、MAP3K2、SMAD2和SP1基因而抑制LPS誘導的奶牛乳腺上皮細胞凋亡和炎癥反應。