Lon1蛋白酶參與耐輻射異常球菌高溫脅迫及細胞分裂的功能研究

趙明明 唐殷 郭磊周 韓佳慧 葛佳茗 孟勇 平淑珍 周正富 王勁

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術研究所，北京 100081；2. 綿陽禾本生物工程有限公司，綿陽 621011）

細菌面對外界環(huán)境刺激如干旱、高低溫、鹽脅迫以及營養(yǎng)物質匱乏時，細胞內的蛋白會遭受損傷，發(fā)生錯誤折疊以及變性聚集，最終造成蛋白質穩(wěn)態(tài)失衡，對細胞造成不可逆的傷害［1］。為了維持脅迫條件下的生長和繁殖，細胞的首要任務即高效的去除錯誤折疊及變性的蛋白，或者幫助錯誤折疊蛋白恢復至天然構象，最終使蛋白水平恢復穩(wěn)態(tài)。在這一過程中，與多種細胞活性相關的（ATPases associated with various cellular activities，AAA+）胞內水解酶發(fā)揮著重要作用［2］。

Lon蛋白酶是第一個被純化和研究的AAA+蛋白酶，廣泛存在于細菌、古菌、真菌以及真核生物的細胞器中［3］。根據(jù)Lon蛋白酶氨基酸序列的同源性和結構特征，可將Lon蛋白分為兩類，即存在于大部分細菌中的LonA和主要存在于古細菌中的LonB。LonA類蛋白酶主要由3個結構域組成，分別為參與底物識別的N端結構域、負責ATP結合與水解的ATP酶結構域以及含有Ser-Lys二聯(lián)體的酶活中心。其中ATP酶結構域為Lon蛋白酶發(fā)揮酶活性提供能量，酶活性中心使Lon具有蛋白水解能力。LonB缺少N端結構域，但是在ATP酶結構域中插入了一段跨膜區(qū)［4］。在水解蛋白質的過程中，Lon蛋白酶首先識別并結合底物蛋白，再通過ATP的水解使得底物蛋白打開二級結構，最終底物蛋白以一級結構的方式被運輸?shù)降鞍姿馇恢羞M行水解［5］。

Lon蛋白酶的主要功能是水解損傷蛋白。有研究顯示，大腸桿菌中約50%的異常蛋白由Lon負責水解，Lon蛋白酶還能通過水解多種調節(jié)蛋白參與DNA修復、細菌毒力、耐藥性、脅迫抗性、形態(tài)等多個生理學過程［6］。例如，Jonas等［7］發(fā)現(xiàn)高溫脅迫可誘導新月柄桿菌（Caulobacter crescentus）Lon蛋白酶的合成，從而水解負責DNA復制的啟動蛋白DnaA，抑制細菌的DNA復制，最終提高菌株的高溫脅迫抗性；Lon的缺失使大腸桿菌形成長線型、不可分裂的細絲狀表型［8-9］。而Breidenstein等［10］發(fā)現(xiàn)lon基因的突變可影響銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）三型分泌系統(tǒng)相關基因的表達，從而使其毒力減弱。Kim等［11］的研究表明Lon蛋白酶可水解沙門氏菌（Salmonella enterica）鐵離子輸入蛋白FeoC，調控細菌在脅迫環(huán)境下鐵離子平衡。

耐輻射異常球菌作為迄今為止發(fā)現(xiàn)的最具輻射抗性的微生物之一，具有超強的抵御極端環(huán)境的能力，因此往往作為研究非生物脅迫抗性機制的模式生物［12-13］。有研究顯示耐輻射異常球菌的極端抗性可歸因于其擁有功能強大的胞內蛋白質穩(wěn)態(tài)系統(tǒng)［14］。前期分析發(fā)現(xiàn)高溫脅迫2 h后，耐輻射異常球菌中的編碼Lon蛋白酶同源物的基因dr_1974（lon1）轉錄水平顯著上調，可能在菌株高溫脅迫中發(fā)揮重要作用。本研究以耐輻射異常球菌的Lon1蛋白酶為研究對象，通過突變株構建、抗逆功能比較、蛋白質組分析對耐輻射異常球菌的Lon1功能進行探討，為解析耐輻射異常球菌的極端抗逆機制提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、質粒及培養(yǎng)條件 供試菌株和質粒見表1。耐輻射異常球菌于TGY培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)，大腸桿菌于LB培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)。突變株和回補株分別添加相應抗生素。

表1 菌株與質粒Table 1 Strains and Plasmids

1.1.2 主要試劑 本實驗使用的細菌基因組提取試劑盒購自北京聚合美有限公司，常規(guī)質粒提取試劑盒和膠回收純化試劑盒購自Magen公司，RNA提取試劑盒購自Pronega公司，RNA反轉試劑盒購自TaKaRa公司，熒光定量PCR試劑及高保真酶2×Phanta Max Master Mix購自南京諾唯贊公司，其它生化試劑均為分析純。實驗涉及的引物合成由生工生物完成，測序由華大生物技術公司完成。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 從NCBI數(shù)據(jù)庫中獲取lon1的氨基酸序列，使用功能域預測網(wǎng)站http：//smart.embl-heidelberg.de/對Lon1蛋白進行功能域分析。通過NCBI進行耐輻射異常球菌Lon1同源蛋白的查找，利用ClustalW對耐輻射異常球菌Lon蛋白進行氨基酸序列比對，用NJ法建立系統(tǒng)發(fā)育樹。并用bootstrap法（重復1 000次）評估系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.2 lon1的轉錄水平分析 高溫、氧化、UV和鹽脅迫處理及菌體收集參考劉盈盈［15］方法。提取上述菌體的RNA，并消化反轉為cDNA，利用qRTPCR分析lon1在不同非生物脅迫條件下的轉錄水平。RNA的提取步驟參考RNA提取試劑盒TRIzolTMPlus RNA Purification Kit說明書，RNA中DNA的去除及反轉參考TaKaRa公司的試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書進行，qRT-PCR程序參考劉盈盈［15］。

1.2.3 lon1突變株及回補株的構建 本研究利用同源重組方法在靶標基因中插入抗性基因，完成lon1功能缺失突變株構建，所用引物如表2。以D. radiodurans R1基因組為模板，用lon1-Up-F/R引物擴增lon1的上游序列，用lon1-Down-F/R引物擴增lon1的下游序列，以pKatA PH3為模板，用Kan-F/R引物擴增帶有啟動子的卡納霉素抗性基因片段。通過同源重組將3個片段進行連接，構建融合片段Ulon1-Km-Dlon1。利用同源重組的方法轉化到D. radiodurans R1野生型中獲得突變株△lon1［16］。擴增lon1及上游啟動子區(qū)連接pRADZ3載體構建重組載體pZ3-lon1，轉化至△lon1中，構建lon1基因的回補菌株comlon1，同樣的方法將pRADZ3質粒轉化△lon1獲得Z3-△lon1。

表2 引物序列Table 2 Sequences of Primers

1.2.4 正常培養(yǎng)條件下生長曲線測定 活化D. radiodurans R1野 生 型、突 變 株△lon1、回 補株comlon1以及Z3-△lon1，將種子液按照起始OD600=0.1分別轉接于20 mL新鮮的TGY液體培養(yǎng)基中，于30℃ 220 r/min連續(xù)震蕩培養(yǎng)，期間每隔4 h取樣1次，測定樣品在OD600時的吸光值，連續(xù)測定至細菌生長穩(wěn)定后期（約48 h）。以培養(yǎng)時間為橫坐標，OD600為縱坐標繪制正常培養(yǎng)條件下的生長曲線，每個菌株設3個重復。

1.2.5 蛋白質組測定 活化耐輻射異常球菌野生型WT、△lon1，按1%轉接到300 mL新鮮TGY液體培養(yǎng)基中，30℃搖床培養(yǎng)至對數(shù)初期（菌液OD600=2）。各取150 mL菌液8 000×g離心10 min收集菌體作為對照組（CK），將剩余的菌液置于48℃的搖床中220 r/min培養(yǎng)2 h后離心收集菌體作為脅迫處理組。將收集的菌體液氮速凍，利用非標定量法（label-free）技術進行蛋白組學測定分析。

1.2.6 掃描電鏡與透射電鏡觀察lon1缺失對細胞形態(tài)的影響 離心收集50 mL OD600=0.6-0.8的菌體，將菌體重懸在2.5%的戊二醛中并室溫固定24 h，然后經(jīng)過一系列漂洗與脫水，最終將菌體包埋在2%的樹脂中并切片，然后用透射電鏡和掃描電鏡觀察不同菌株的形態(tài)。其中透射電鏡為日本HITACH公司的H-7500，掃描電鏡為日本HITACH公司的S-570。

1.2.7 耐輻射異常球菌非生物脅迫實驗 脅迫方法參考1.2.2，脅迫處理完成后用滅菌磷酸緩沖液PBS（pH 7.0）對進行倍比稀釋（10-1-10-5），每個稀釋度各取8 μL點在固體TGY培養(yǎng)基表面，經(jīng)30℃培養(yǎng)約2-3 d后，觀察菌落形成情況。

2 結果

2.1 Lon1的生物信息學分析

Lon1（DR_1974）位于D. radiodurans的I號染色體上（NC_001263.1），堿基全長為2 442 bp，編碼 813個氨基酸，預測蛋白分子量約為93 kD。功能域預測發(fā)現(xiàn)，耐輻射異常球菌的Lon1蛋白酶具有負責底物識別的N端結構域，而無跨膜區(qū)，具有A類Lon蛋白酶的典型特征（圖1-A），表明耐輻射異常球菌的Lon1蛋白為A類Lon蛋白酶。

將Lon1的氨基酸序列在GenBank中進行比對BlastP搜索，并選取具有代表性的細菌的Lon氨基酸序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹。結果如圖1-B所示，除Deinococcus屬以外，耐輻射異常球菌Lon1與Marinithermus hydrothermalis的親緣關系較近。

圖1 Lon1結構域及系統(tǒng)發(fā)育分析Fig. 1 Structural domain and phylogenetic analysis of Lon1

2.2 lon1的轉錄受高溫誘導

為了研究不同非生物脅迫條件下耐輻射異常球菌野生型菌株中l(wèi)on1基因的表達情況，本研究通過qRT-PCR分析了在高溫脅迫（48℃）、UV輻射、鹽脅迫以及過氧化氫脅迫條件下lon1轉錄水平的變化。結果如圖2所示，48℃高溫沖擊不同時間（1、2、3、4和5 h），lon1（dr_1974）的轉錄水平量均顯著提高，其中在沖擊3 h時轉錄水平上調倍數(shù)最高，約上調了27倍，隨著沖擊時間的延長，lon1的轉錄水平逐漸下降直至恢復至沖擊前水平（圖2-A）。同時分析了lon1在UV、H2O2以及0.2 mol/L NaCl脅迫條件下的轉錄變化，結果顯示相較于高溫脅迫，lon1在UV、H2O2以及0.2 mol/L NaCl脅迫條件下的轉錄水平變化倍數(shù)較?。▓D2-B、C、D）。以上結果說明lon1受高溫脅迫誘導，可能在耐輻射常球菌的高溫脅迫適應中發(fā)揮重要作用。

圖2 熒光定量PCR分析不同脅迫條件下lon1基因的轉錄變化Fig. 2 Transcriptional analysis of lon1 gene under different stress conditions by qRT-PCR

2.3 lon1突變株及回補株的構建及驗證

通過同源重組技術獲得lon1基因上游、卡那霉素抗性盒及l(fā)on1基因下游3個片段的融合產(chǎn)物lon1 U-Kan-D，經(jīng)測序驗證后熱擊轉化至耐輻射異常球菌野生型中。在含有卡那霉素的平板上篩選陽性克隆，并利用PCR擴增與測序驗證獲得正確的突變株△lon1，通過qRT-PCR測定了lon1基因缺失對上下游基因轉錄的影響。從圖3-A中可以看出，lon1基因上游為clpP和clPX基因，分別編碼AAA+蛋白酶ClpXP的兩個亞基，ClpXP蛋白酶也是細胞水解系統(tǒng)的重要組成部分；lon1下游的dr_1975和dr_1976分別編碼N-乙?；D移酶和核酸內切酶；從圖3-C中可以看出，lon1的缺失對其上下游基因的轉錄無影響。在此基礎上通過構建重組質粒并轉化△lon1的方式獲得回補株comlon1和對照菌株Z3-△lon1。正常培養(yǎng)條件下的生長曲線測定（圖4）發(fā)現(xiàn)，lon1的缺失和回補以及pRADZ3質粒均不影響耐輻射異常球菌的生長。

圖3 lon1突變株的構建與驗證Fig. 3 Construction and identification of the lon1 mutant strain

圖4 正常培養(yǎng)條件下菌株D. radiodurans、△lon1、com lon1和Z3-△lon1的生長Fig. 4 Growth of D. radiodurans，△lon1，com lon1 and Z3-△lon1 in normal culture condition

2.4 lon1的缺失導致菌株對高溫和鹽脅迫敏感

為了確定lon1基因是否與耐輻射異常球菌響應極端環(huán)境有關，分析了耐輻射異常球菌野生型R1、突變株△lon1和回補株comlon1在48℃高溫脅迫、NaCl脅迫、UV輻射以及不同濃度過氧化氫處理30 min條件下的生長情況。結果（圖5）顯示，相較于野生型菌株R1，48℃高溫脅迫5 h使△lon1的存活率下降一個數(shù)量級，且lon1的回補能夠使菌株恢復至與野生型同樣的生長狀態(tài)，這說明lon1與耐輻射異常球菌的高溫脅迫抗性相關；除此之外，本研究發(fā)現(xiàn)0.2 mol/L的NaCl脅迫條件下，菌株△lon1的生長受到嚴重影響，其存活率比野生型降低約4個數(shù)量級，因此lon1在耐輻射異常球菌的鹽脅迫下發(fā)揮更為重要作用。但在過氧化氫脅迫及UV脅迫條件下，△lon1的存活并未受到嚴重影響，其生長狀態(tài)與野生型菌株相比未見巨大差異。

圖5 高溫、NaCl、H2O2以及UV脅迫對不同菌株生長的影響Fig. 5 Growth of different strains upon high temperature，NaCl，H2O2 and UV stresses

2.5 高溫脅迫條件下耐輻射異常球菌野生型及△lon1的蛋白組分析

48℃脅迫2 h 后，相較于野生型菌株，△lon1中共有31個蛋白發(fā)生顯著差異，其中25個蛋白表達水平發(fā)生顯著上調（P＜0.05，F(xiàn)C＞1.5），6個蛋白水平發(fā)生顯著下調（P＜0.05，F(xiàn)C＜0.667）。如表3所示，顯著上調表達的蛋白主要包括分子伴侶DnaK、GroEL、ClpB、GroS、GrpE，此外參與DNA修復、轉錄調控、能量代謝以及膜功能和轉運相關的蛋白表達量也發(fā)生了顯著上調，而參與氨基酸代謝和翻譯的相關蛋白表達量顯著下調。值得注意的是，5個與細胞形態(tài)建成相關的蛋白表達量顯著下調，這說明在響應高溫脅迫的過程中，Lon1 參與一個廣泛的蛋白調控網(wǎng)絡，且Lon1可能與耐輻射異常球菌的細胞形態(tài)相關。

表3 與lon1有關的響應高溫脅迫的差異表達蛋白Table 3 Differentially expressed proteins associated with lon1 in response to high temperature stress

2.6 Lon1的缺失影響菌株的細胞形態(tài)

由于蛋白組數(shù)據(jù)顯示正常生長條件下lon1基因缺失使5個細胞形態(tài)相關的蛋白發(fā)生差異表達，本研究利用掃描電鏡和透射電鏡觀察野生型菌株DR、△lon1以及comlon1的細胞形態(tài)，結果如圖6所示，從圖6-A中可以看出lon1基因缺失后，耐輻射異常球菌的細胞形態(tài)異常，不再呈典型的四分體或二分體結構，而是呈串狀聚集，并且中間黑色的肽聚糖層顯著變薄，細胞膜出現(xiàn)明顯損傷，細胞外膜出現(xiàn)彌散，有碎片物質從細胞表面分離。圖6-B掃描電鏡結果顯示突變株△lon1的細胞體積顯著大于野生型細胞，形成巨型細胞且lon1的缺失使其向細胞表面分泌大量物質，而lon1基因的回補能夠使菌株恢復正常的形態(tài)。從以上結果可以看出，在耐輻射異常球菌中，lon1參與細胞形態(tài)以及分裂過程。

圖6 耐輻射異常球菌野生型DR、△lon1以及comlon1的電鏡圖Fig. 6 Electron microscopy images of WT D. radiodurans DR，△lon1 and comlon1

3 討論

耐輻射異常球菌能夠在多種極端環(huán)境下存活的原因是能夠在脅迫條件下最大程度維持細胞內蛋白質的穩(wěn)態(tài)［13］。在此基礎上進一步的研究顯示耐輻射異常球菌的蛋白水解酶種類豐富且水解活性 強［14，17］。Lon作為一種重要的蛋白水解酶，在多種細菌脅迫響應過程中發(fā)揮至關重要的作用。耐輻射異常球菌dr_1974（lon1）基因編碼一個Lon蛋白酶同源物，進化分析顯示除了Deinococcus外，Lon1與嗜熱菌的親緣關系最近。此外qRT-PCR結果顯示lon1的轉錄受高溫誘導。高溫主要造成蛋白質變性損傷，但由于細胞本身并不能識別溫度的變化，因此高溫脅迫響應往往是由損傷蛋白的聚集所觸發(fā)的［18］，因此Lon蛋白酶表達受到高溫脅迫調控極有可能是適應高溫的進化結果。以上結果說明耐輻射異常球菌 Lon1可能在高溫脅迫中發(fā)揮作用。

在遭受高溫等非生物脅迫時，細胞除了利用胞內蛋白水解酶高效的清除變性受損蛋白外，同時也會通過分子伴侶蛋白對變性受損以及錯誤折疊的蛋白進行選擇性修復［19］。分子伴侶多為熱休克蛋白，高溫可誘導其大量表達，其主要功能是幫助蛋白恢復至天然構象［20］，因此分子伴侶同樣是維持蛋白質穩(wěn)態(tài)的重要組成部分。高溫條件下蛋白組結果顯示，lon1的缺失引起多個分子伴侶蛋白含量顯著升高，說明這些分子伴侶受高溫誘導大量表達，同時這些分子伴侶可能是Lon1的水解底物，lon1的缺失影響了這些分子伴侶的水解，因此表現(xiàn)為表達量的顯著上調。除此之外，Lon蛋白酶可能通過水解多種天然調控蛋白參與多個生物學過程［6］，本研究的蛋白組結果顯示，lon1的缺失使DNA修復、轉錄調控以及膜功能與轉運相關蛋白的表達量顯著上調等。這說明高溫脅迫條件下耐輻射異常球菌Lon1參與一個廣泛的蛋白調控網(wǎng)。

lon基因突變還會導致多種表型，例如大腸桿菌（E.coli）和根瘤農(nóng)桿菌（Agrobacterium tumefaciens）lon的缺失使菌體呈長線型且對紫外敏感［8，21］；銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）lon的缺失造成細菌運動能力明顯缺陷，分裂過程異常［22］。透射電鏡和掃描電鏡觀察結果顯示，lon1的缺失使耐輻射異常球菌分裂異常，不再呈現(xiàn)典型的四分體或二分體結構，而是以串狀形式聚集，形成巨型細胞，并且細胞膜受損嚴重。蛋白組差異蛋白中的細胞形態(tài)相關蛋白MurB、MurC、MurD、MurE都是細胞膜組分肽聚糖合成途徑中的關鍵酶［23］，這可能是lon1的缺失使細胞膜完整性下降的主要原因，而lon1的缺失使耐輻射異常球菌對NaCl敏感則可能是細胞膜受損造成的。

對于Lon蛋白酶缺失造成的細胞分裂異常也有諸多報導，文獻顯示大部分細菌細胞分裂受抑制基因sulA的調控，該基因的產(chǎn)物可以抑制細胞分裂相關蛋白FtsZ的表達來阻止細胞分裂，以防止母細胞的染色體畸變遺傳［24］。進一步的研究顯示SulA蛋白為Lon的底物，在正常生長條件下，SulA的表達受到抑制，且SulA可被Lon正常降解［25］，其胞質濃度很低。當非生物脅迫造成DNA損傷時，可誘導SulA的表達，其胞質濃度顯著增加。此時，SulA通過與FtsZ結合阻止細胞分裂，在DNA修復后，Lon水解SulA使其胞質濃度恢復至正常水平，細胞分裂逐漸恢復正常［4］。因此在Lon缺失條件下，SulA濃度將會長期處于較高水平進而影響細胞分裂。本研究中l(wèi)on1的缺失雖然使細胞分裂出現(xiàn)了異常，但同源比對發(fā)現(xiàn)耐輻射異常球菌中并沒有SulA同源物，因此耐輻射異常球菌Lon參與細胞分裂的途徑還需要進一步深入研究。

4 結論

耐輻射異常球菌lon1的轉錄受高溫誘導，在響應高溫脅迫的過程中參與DNA修復、轉錄調控、膜功能與代謝等多個生物學過程。除此之外，lon1的缺失雖不影響菌株的生長，但卻使細胞分裂異常，形成巨型細胞，細胞膜受損嚴重。lon1的缺失使耐輻射異常球菌對高溫脅迫和鹽脅迫敏感。