過表達(dá)Spt7對(duì)黑曲霉生長(zhǎng)及抗逆性影響

薛鮮麗 王靜然 畢杭杭 王德培，2

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300457；2. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300457）

Spt-Ada-Gcn5-乙酰轉(zhuǎn)移酶（SAGA）復(fù)合體是一種多蛋白復(fù)合物，是一個(gè)多亞基保守的轉(zhuǎn)錄輔助因子，主要負(fù)責(zé)體內(nèi)10%以上的基因轉(zhuǎn)錄［1］。Spt7是構(gòu)成 SAGA 復(fù)合物的核心結(jié)構(gòu)之一，維持 SAGA 復(fù)合物的穩(wěn)定。其含有至少一個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，參與生物體轉(zhuǎn)錄調(diào)控，例如Bromo結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合乙?；嚢彼幔?-3］。SAGA作為一類多功能蛋白復(fù)合體，通過對(duì)組蛋白進(jìn)行乙酰化［4］和去泛素化［5］修飾，實(shí)現(xiàn)染色質(zhì)結(jié)構(gòu)在沉默和活躍狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，為基因轉(zhuǎn)錄起始創(chuàng)造了合適的遺傳條件；另外它通過與轉(zhuǎn)錄激活因子以及RNA 聚合酶 II等結(jié)合，幫助將它們募集到靶基因的啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)揮作用；除此之外它還參與到DNA損傷修復(fù)、mRNA輸出［6-8］等多種生物學(xué)過程。

目前發(fā)現(xiàn) SAGA 復(fù)合體由至少 20 個(gè)蛋白組成［9］，以酵母SAGA復(fù)合物為例，它是由20個(gè)亞基組成，在結(jié)構(gòu)上可分為4個(gè)不同的模塊：由Ubp8、Sgf11、Sgf73和Sus1組成的雙歧化（DUB）模塊，由Gcn5、Ada2、Ada3和Sgf29組成組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶（HAT）模塊，TATA結(jié)合蛋白（TBP）相關(guān)因子（TAF）模塊，以及由Spt3、Spt8、Tra1、Spt20、Spt7和Ada1組成Ty（SPT）模塊。SAGA復(fù)合體的完整性主要依賴核心組件Spt7、Spt20和Ada1三個(gè)亞基，其中SPT模塊與SAGA復(fù)合體的招募有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)Spt7參與調(diào)節(jié)Spt20和Ada1的水平，并且含有Spt7的部分SAGA復(fù)合物可以在Spt20和Ada1都不存在的情況下組裝［10］。Spt7最初被發(fā)現(xiàn)是通過在釀酒酵母HIS4和LYS2基因的5'非編碼區(qū)的δ 插入突變以及Ty表型的影響［11］，后來發(fā)現(xiàn)spt7編碼一種定位于細(xì)胞核的大型酸性蛋白質(zhì)，缺失spt7基因的細(xì)胞可以存活，但生長(zhǎng)緩慢，并呈現(xiàn)多種表型如肌醇營(yíng)養(yǎng)不良、細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變、產(chǎn)孢缺陷以及Ty元素的轉(zhuǎn)錄改變［12］等。最新研究發(fā)現(xiàn)來自釀酒酵母的SAGA復(fù)合物核心是Taf5、Sgf73和Spt20亞基和組蛋白八聚體樣折疊［13-14］，八具體折疊中還包含了異二聚體Taf6-Taf9、Taf10-Spt7和Taf12-Ada1，以及Spt3中的兩個(gè)組蛋白折疊結(jié)構(gòu)域。

SAGA 復(fù)合體在真核生物中高度保守，釀酒酵母中 SAGA 復(fù)合物各亞基的同源蛋白已在果蠅、植物與人中得到鑒定［15-19］。雖然 SAGA 復(fù)合體三維結(jié)構(gòu)在酵母與人體細(xì)胞中高度相似，但研究發(fā)現(xiàn)SAGA 復(fù)合體在不同物種中發(fā)揮的功能存在差異性。迄今為止，黑曲霉乃至絲狀真菌范疇中均未見有關(guān)Spt7的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)過程中意外的發(fā)現(xiàn)spt7基因缺失使菌株與原始菌株黑曲霉的菌落形態(tài)大相徑庭。與原始菌株相比，Δspt7菌株菌絲頂端膨大、菌絲短小、粗細(xì)不均勻，且部分區(qū)域出現(xiàn)類似酵母的念珠狀結(jié)構(gòu)，不生成分生孢子。且spt7基因的缺失無法通過添加外源碳源得到彌補(bǔ)。從文獻(xiàn)得知此基因是 SAGA 復(fù)合物結(jié)構(gòu)穩(wěn)定核心亞基之一，其缺失可能使 SAGA 復(fù)合體失活，從而影響黑曲霉菌體生長(zhǎng)發(fā)育及分生孢子形成關(guān)鍵性基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證Spt7的功能，本研究構(gòu)建一株過表達(dá)Spt7的菌株，對(duì)其生長(zhǎng)形態(tài)、分生孢子形成、抗氧化脅迫、高溫及高滲耐受性等進(jìn)行觀察分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 黑曲霉（Aspergillus niger 1062）由江蘇國(guó)信協(xié)聯(lián)能源有限公司天津分公司保藏。大腸桿菌DH5α和根癌農(nóng)桿菌AGL1采購(gòu)于中國(guó)普通微生物菌株保藏管理中心，由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院生化過程與技術(shù)研究室保藏。

1.1.2 試劑 無水葡萄糖、酵母粉、瓊脂粉、胰蛋白胨采購(gòu)自天津市北方天醫(yī)試劑公司，硫酸銨、磷酸二氫鉀、磷酸氫二甲、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鉀、七水合硫酸亞鐵、五水合硫酸銅、硫酸錳、硼酸、七水合硫酸鋅、六水合氯化鈷、苯酚、氯仿、冰乙酸、甲醇、氯化鈉、氫氧化鈉、氫氧化鉀、無水乙醇、甘油、乙酰丁香酮、頭孢噻肟鈉、氨芐青霉素、卡那霉素、潮霉素（均為分析純）采購(gòu)自北京市索來寶科技有限公司，DL5000 DNA Maker、快速 DNA 聚合酶（5 U/μL）采購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，T4-DNA連接酶（10 U/μL），限制性內(nèi)切酶 BamH I（15 U/μL）采購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司，真菌RNA提取試劑盒（50T）采購(gòu)自北京酷來博科技有限公司，RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒HiS cript III RT Super Mix for qPCR（+Gdna wiper）（100rxn）采購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（500 rxns）采購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：1% NaCl，0.5%酵母粉，1%胰蛋白胨；大腸桿菌感受態(tài)轉(zhuǎn)化篩選培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加（0.01%）卡那霉素；電轉(zhuǎn)根癌農(nóng)桿菌篩選培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基添加0.012%卡那霉素；CM培養(yǎng)基：ASP+N-母液2%、葡萄糖1%、1 mol/L MgSO4母液0.2%、CM Trace elements 0.1%、酪蛋白水解物0.1%、酵母浸出物0.5%（ASP+N-母液：氯化鉀2.61%、磷酸二氫鉀7.48%、硝酸鈉29.75%、氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至5.5；CM Trace elements：七水合硫酸鋅2.1%、硼酸1.1%、四水合氯化錳0.5%、七水合硫酸亞鐵0.5%、四水合氯化鈷0.17%、五水合硫酸銅0.16%、二水合鉬酸鈉0.15%、EDTA5.1%）；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化初步篩選培養(yǎng)基：CM培養(yǎng)基外源添加0.01%氨芐青霉素、0.008%頭孢噻肟鈉和0.015%潮霉素；根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化初步篩選培養(yǎng)基：CM培養(yǎng)基添加0.025%潮霉素；農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化所用 IM 培養(yǎng)基參照文獻(xiàn)［20］配制；提RNA 所用培養(yǎng)基：2%葡萄糖，1%酵母粉，0.2%磷酸二氫鉀，0.2%硫酸鎂。

1.1.4 儀器與設(shè)備 LRH-250A生化培養(yǎng)箱采購(gòu)自韶關(guān)市泰宏醫(yī)療器械有限公司，WXL-A30002電子天平采購(gòu)自北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，LDZX-50FB 立式壓力蒸汽滅菌器采購(gòu)自上海申安醫(yī)療器械廠，ChampGel5000全自動(dòng)凝膠成像儀采購(gòu)自北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司，Eppendorf PCR儀采購(gòu)自上海恒久醫(yī)療器械有限公司，CX23 型光學(xué)顯微鏡采購(gòu)自O(shè)LYMPUS 公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Stepone Plus）采購(gòu)自美國(guó)ABI公司，由天津科技大學(xué)生物學(xué)院分析測(cè)試中心保存。

1.2 方法

1.2.1 Spt7同源序列分析及進(jìn)化樹的構(gòu)建 根據(jù) GenBank中登錄的相關(guān)Aspergillus niger CGMCC 10142中spt7序列，采用NCBI比對(duì)后獲得的Spt7的同源氨基酸序列。選取釀酒酵母及黑曲霉中的Spt7蛋白序列在SMART網(wǎng)址進(jìn)行比對(duì)分析其內(nèi)部結(jié)構(gòu)。選取序列Aspergillus niger CBS 513.88來源的轉(zhuǎn)錄激活因子Spt7（XP 001399796.1），Aspergillus sclerotioniger CBS 115572來源的溴結(jié)構(gòu)域 蛋 白（bromodomain protein）（XP 025466510.1），Aspergillus saccharolyticus JOP 1030-1來源的組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶SAGA/ADA 催化亞基PCAF/GCN5（XP 025427320.1），Penicilliopsis zonata CBS 506.65來源的假定蛋白ASPZODRAFT 127728（XP 022586128.1），Byssochlamys spectabilis No. 5來源的溴結(jié)構(gòu)域蛋白（GAD99092.1），Monascus purpureus來源的轉(zhuǎn)錄激活因子Spt7（TQB67779.1），用MEGA7.0.26軟件構(gòu)建Spt7氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.2 spt7過表達(dá)質(zhì)粒pOE spt7的構(gòu)建 pOE spt7質(zhì)粒即p66-PglaA-spt7的構(gòu)建：以p66質(zhì)粒為出發(fā)質(zhì)粒，選用BamH I進(jìn)行單酶切線性化，A. niger 1062基因組為模板，分別通過引物spt7-F和spt7-R（含終止子）、引物Pgla-F和Pgla-R擴(kuò)增片段片段spt7和pgla；將片段pgla和片段spt7通過Over-lap PCR的方法融合成一個(gè)片段pgla-spt7。通過重組酶進(jìn)行連接獲得質(zhì)粒pOE spt7，并熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌。以大腸桿菌菌液為模板驗(yàn)證pOE spt7質(zhì)粒。本研究所用引物均由金唯智生物科技公司合成，如表1 所示。

表1 試驗(yàn)中用到引物Table 1 Primers used in the experiment

1.2.3 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化黑曲霉及過表達(dá)spt7陽性轉(zhuǎn)化子的篩選 將pOE spt7質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌 AGL1 感受態(tài)細(xì)胞，并以菌液為模板驗(yàn)證農(nóng)桿菌。按照文獻(xiàn)所述方法孵育農(nóng)桿菌［21］，之后將農(nóng)桿菌與黑曲霉新鮮孢子置于 IM 固體培養(yǎng)基硝酸纖維膜上，25℃避光共培養(yǎng) 48 h。待共培養(yǎng)過后用無菌生理鹽水將黑曲霉孢子從膜上洗到篩選培養(yǎng)基，37℃黑暗培養(yǎng) 2-3 d。待初篩版上長(zhǎng)出白色單菌落后，挑單菌落進(jìn)行復(fù)篩驗(yàn)證。

1.2.4 OE spt7轉(zhuǎn)化子菌落、菌絲觀察及分生孢子計(jì)數(shù) 將OE spt7轉(zhuǎn)化子及出發(fā)菌株同時(shí)接種到CM培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)3 d，取爬片顯微鏡下觀察菌絲形態(tài)；對(duì)菌落孢子數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)：用直徑 20 mmol/L 的打孔器從菌落中心打孔采樣，將孢子用 1 mL 無菌水洗下，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，進(jìn)行產(chǎn)孢量分析。

1.2.5 OE spt7菌株抗氧化脅迫性觀察 將OE spt7轉(zhuǎn)化子及出發(fā)菌株同時(shí)接種到含有6 mmol/L H2O2、15 mmol/L H2O2的CM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)4 d，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

1.2.6 OE spt7轉(zhuǎn)化子高溫、高滲抗逆性實(shí)驗(yàn) 將OE spt7轉(zhuǎn)化子及出發(fā)菌株同時(shí)接種到含有15% NaCl的CM培養(yǎng)基中，置于30℃下培養(yǎng)9 d，觀察菌落生長(zhǎng)狀況。

將對(duì)照組與OE spt7轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種在CM培養(yǎng)基上，置于39℃下培養(yǎng)，觀察1-4 d菌落生長(zhǎng)形態(tài)。

1.2.7 OE spt7菌株RNA提取及過氧化物酶及熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄水平 將OE spt7菌株及對(duì)照組的孢子置于含有15 mmol/L H2O2的CM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)40 h，參考真菌RNA提取試劑盒說明書提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR。目前在生物體內(nèi)常見的抗氧化酶有過氧化氫酶（catalase，CAT），超氧化物歧化酶Orgotein（superoxide dismutase，SOD），谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），過氧化氫酶過氧化物酶編碼基因（catalase-peroxidaseencoding gene，CpeB）。

選取熱休克蛋白家族中的Hsp40、Hsp70、Hsp90蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè)。將OE spt7菌株及對(duì)照組的孢子置于CM液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)36 h后在置于42℃水浴分別熱處理3 h和5 h，提取RNA，經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行qRT-PCR。

qRT-PCR方法及操作步驟參考 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒說明書進(jìn)行，所使用的引物如表1所示。

2 結(jié)果

2.1 Spt7氨基酸序列比對(duì)及遺傳進(jìn)化樹分析

目前關(guān)于以Spt7為核心組分的SAGA復(fù)合物的研究?jī)H集中在酵母、果蠅、人、植物細(xì)胞內(nèi)，不同物種的Spt7氨基酸相似性極低，但結(jié)構(gòu)相似，如圖1-A所示，在黑曲霉與釀酒酵母的Spt7序列中，都含有溴結(jié)構(gòu)域，但是溴結(jié)構(gòu)域所在位點(diǎn)不同。本研究中黑曲霉和釀酒酵母Spt7多肽鏈全長(zhǎng)分別含有1 175和1 332個(gè)氨基酸殘基，二者Spt7氨基酸多序列比對(duì)結(jié)果如圖1-B所示，相似性僅有21.96%。將不同絲狀真菌來源的Spt7的氨基酸序列比對(duì)后構(gòu)建進(jìn)化樹如圖1-C所示，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑曲霉Spt7與曲霉菌A. sclerotioniger的溴域蛋白處于同一分支，通過文獻(xiàn)查找發(fā)現(xiàn)1995年報(bào)道了一篇關(guān)于酵母的Spt7，它是一個(gè)含有溴結(jié)構(gòu)域的酸性蛋白，推測(cè)在曲霉菌中Spt7同樣含有溴結(jié)構(gòu)域。同時(shí)與糖曲霉A. saccharolyticus JOP 1030組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶SAGA/ADA催化亞基PCAF/GCN5也有較近的親緣關(guān)系。曲霉菌與帶狀青霉P. zonata CBS 506.6的假定蛋白分別處于一分支。與絲衣霉B. spectabilis No. 5的溴域蛋白及紫色紅曲M. purpureus的轉(zhuǎn)錄活性因子Spt7的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

2.2 Spt7對(duì)絲狀真菌菌絲形態(tài)及分生孢子形成的影響

將轉(zhuǎn)化子與對(duì)照組孢子點(diǎn)種在CM培養(yǎng)基上觀察3 d，結(jié)果如圖2-A所示，對(duì)照組與轉(zhuǎn)化子的菌落大小無明顯區(qū)別，兩菌株整體呈棕色，菌落中間有大量棕色孢子，邊緣菌絲呈乳黃色；與對(duì)照組菌株相比，轉(zhuǎn)化子菌落中間褶皺更深，有更多凸起，而對(duì)照組菌株較為平整。第2天對(duì)照組產(chǎn)孢比轉(zhuǎn)化子多但是轉(zhuǎn)化子菌絲更加茂密，而到第3天轉(zhuǎn)化子的孢子產(chǎn)量（數(shù)值）明顯比對(duì)照組高（數(shù)值）（圖2-B），3個(gè)轉(zhuǎn)化子的孢子數(shù)量分別是5.8×107/cm2、6.2×107/cm2、6.3×107/cm2比對(duì)照組2.3×107/cm2高了2.5-2.7倍。說明過表達(dá)spt7基因使菌體產(chǎn)孢延遲，但是增加了孢子產(chǎn)量。為了進(jìn)一步觀察過表達(dá)spt7對(duì)菌體菌絲的影響，通過制備爬片并在顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，如圖2-C所示，對(duì)照菌株菌絲相對(duì)疏松，枝節(jié)細(xì)長(zhǎng)且直，轉(zhuǎn)化子菌株菌絲稠密，枝節(jié)較多且短而粗。

圖2 30℃下對(duì)照組及轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)形態(tài)觀察及孢子計(jì)數(shù)Fig. 2 Growth morphology observation and spore count of control and transformants at 30℃

2.3 OE spt7菌株抗氧化脅迫性分析

氧化脅迫的產(chǎn)生是由于胞內(nèi)活性氧含量過高，使得胞內(nèi)氧化還原的狀態(tài)失衡，進(jìn)而引起菌體一系列應(yīng)激反應(yīng)，菌體通過激活相關(guān)基因的表達(dá)來降解活性氧從而修復(fù)和維持細(xì)胞的動(dòng)態(tài)平衡。為探究Spt7對(duì)黑曲霉氧化耐受的影響，分別測(cè)定6 mmol/L H2O2以及15 mmol/L H2O2脅迫下，黑曲霉對(duì)照組及OE spt7菌株的生長(zhǎng)情況。如圖3 所示，在6 mmol/L H2O2上對(duì)照組延遲24 h萌發(fā)，但在后期4-5 d時(shí)生長(zhǎng)情況與轉(zhuǎn)化子無明顯差異。在15 mmol/L H2O2的CM培養(yǎng)基上，對(duì)照組孢子延遲萌發(fā)且萌發(fā)后菌落生長(zhǎng)受到抑制，菌落直徑明顯小于轉(zhuǎn)化子，充分說明了過表達(dá)Spt7可以提高菌株的抗氧化脅迫能力。通過轉(zhuǎn)化子對(duì)H2O2的抗逆性觀察實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Spt7增加了菌體對(duì)的H2O2耐受性。

圖3 對(duì)照組及OE spt7轉(zhuǎn)化子在含有不同濃度H2O2 CM培養(yǎng)基的生長(zhǎng)情況Fig. 3 Growths of control group and OE spt7 transformants in CM medium containing different concentrations of H2O2

2.4 OE spt7菌株高滲耐受性分析

本研究進(jìn)一步驗(yàn)證OE spt7轉(zhuǎn)化子對(duì)其他不良環(huán)境的耐受性，于是將轉(zhuǎn)化子與對(duì)照組孢子點(diǎn)種在含有15% NaCl的CM培養(yǎng)基上進(jìn)行9 d的觀察實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖4所示。從整體來看，對(duì)照組與轉(zhuǎn)化子都能在高鹽板上萌發(fā)及生長(zhǎng)，但是萌發(fā)都受到抑制，對(duì)照組受抑制較為明顯。轉(zhuǎn)化子在第2天即可看到孢子的萌發(fā)跡象，但對(duì)照組則是在第3天開始出現(xiàn)氣生菌絲，隨后較轉(zhuǎn)化子均生長(zhǎng)緩慢，菌體顏色偏灰白色；從第3-5天的生長(zhǎng)情況觀察，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子的氣生菌絲明顯比對(duì)照組稀少，但在培養(yǎng)6 d后氣生菌絲忽然增加，并且隨著菌落的生長(zhǎng)，氣生菌絲也越來茂密；在菌體生長(zhǎng)的7-9 d，轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)明顯比對(duì)照組快，且菌落顏色相對(duì)對(duì)照組更加嫩黃，菌體更加鮮活。說明過表達(dá)Spt7可以提高菌株對(duì)高滲不良環(huán)境的耐受能力。

圖4 對(duì)照組及OE spt7轉(zhuǎn)化子在含有15%NaCl的CM培養(yǎng)基生長(zhǎng)情況Fig. 4 Growths of control group and OE spt7 transformants in CM medium containing 15% NaCl

2.5 OE spt7菌株高溫耐受性分析

將對(duì)照組與OE spt7轉(zhuǎn)化子點(diǎn)種在CM培養(yǎng)基上，置于39℃下培養(yǎng)，觀察1-4 d菌落生長(zhǎng)形態(tài)，結(jié)果如圖5所示，對(duì)照組與轉(zhuǎn)化子在39℃孢子均能萌發(fā)，較最適溫度30℃相比生長(zhǎng)緩慢，與對(duì)照組相比轉(zhuǎn)化子孢子萌發(fā)更快、生長(zhǎng)狀態(tài)良好且菌落依然飽滿，但是對(duì)照組在后期不僅生長(zhǎng)相對(duì)緩慢且菌落干癟、失水嚴(yán)重。

圖5 對(duì)照組及OE spt7轉(zhuǎn)化子在39℃高溫下生長(zhǎng)情況Fig. 5 Growths of control group and OE spt7 transformants at 39℃ of high temperature

2.6 過氧化物酶qRT-PCR結(jié)果

從表征觀察發(fā)現(xiàn)過表達(dá)Spt7后，菌株的抗氧化能力提高，于是對(duì)轉(zhuǎn)化子及對(duì)照組通過qRT-PCR分析關(guān)鍵性的過氧化物酶的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果如圖6所示，可以看出在含有H2O2的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化子與對(duì)照組，過表達(dá)Spt7使spt7的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)2.15倍；同時(shí)超氧化物歧化酶SOD轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)對(duì)照組上調(diào)了3.8倍，谷胱甘肽過氧化物酶GPX以及過氧化氫酶-過氧化物酶CepB編碼基因的轉(zhuǎn)錄也上調(diào)了1.89倍；但是對(duì)于過氧化氫酶CatR的轉(zhuǎn)錄下調(diào)了3.56倍。

圖6 對(duì)照組及OE spt7轉(zhuǎn)化子抗氧化物酶的轉(zhuǎn)錄水平Fig. 6 Transcript levels of antioxidant enzymes in the control and OE spt7 transformants

2.7 熱休克蛋白qRT-PCR結(jié)果

因OE spt7轉(zhuǎn)化子在高溫下生狀態(tài)良好，因此推測(cè)其內(nèi)部熱休克蛋白發(fā)揮作用。將其與對(duì)照組分別熱激3 h與5 h后，qRT-PCR驗(yàn)證其熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄水平。如圖7-A所示，熱激3 h后，OE spt7轉(zhuǎn)化子Spt7的轉(zhuǎn)錄水平相對(duì)對(duì)照組上調(diào)了1.92倍，OE spt7轉(zhuǎn)化子的熱休克蛋白Hsp40、Hsp70、Hsp90相比對(duì)照組分別下調(diào)了0.9、0.1、0.5倍，但OE spt7轉(zhuǎn)化子與對(duì)照組熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄水平并未呈現(xiàn)出顯著差異性。為了進(jìn)一步觀察熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄情況，作者將熱激時(shí)間延長(zhǎng)到5 h，較熱激3 h結(jié)果相比，OE spt7轉(zhuǎn)化子與對(duì)照組Spt7、Hsp40及Hsp70的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有差異性，但OE spt7轉(zhuǎn)化子Hsp90轉(zhuǎn)錄水平較對(duì)照組上調(diào)了19倍（圖7-B）。

圖7 對(duì)照組及OE spt7轉(zhuǎn)化子在42℃熱激條件下胞內(nèi)熱休克蛋白的轉(zhuǎn)錄水平Fig. 7 Transcript levels of intracellular heat shock proteins in the control and OE spt7 transformants under heat stress conditions at 42℃

3 討論

3.1 Spt7同源序列分析結(jié)果及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

系統(tǒng)進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)，不同菌種中Spt7的氨基酸序列差別很大，黑曲霉與釀酒酵母的Spt7氨基酸序列比對(duì)后只有21.9%的相似性，說明在不同物種間，Spt7同源性較低。通過與釀酒酵母的Spt7蛋白結(jié)構(gòu)比較，發(fā)現(xiàn)兩菌種中的Spt7都含有溴結(jié)構(gòu)域，只是結(jié)構(gòu)域所在位點(diǎn)不同。而溴結(jié)構(gòu)域本身是一種能識(shí)別乙?；嚢彼釟埢牡鞍捉Y(jié)構(gòu)域。有些學(xué)者認(rèn)為溴結(jié)構(gòu)域作為調(diào)節(jié)蛋白可以直接識(shí)別組蛋白中乙?；馁嚢彼?，從而被乙?；慕M蛋白募集。在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中，啟動(dòng)子可以通過溴結(jié)構(gòu)域蛋白判斷許多的關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子是否存在，從而決定相關(guān)基因的表達(dá)或者沉默［22］。目前已經(jīng)鑒定出大量含有溴結(jié)構(gòu)域的調(diào)節(jié)蛋白。并且關(guān)于溴結(jié)構(gòu)域的功能還未完全發(fā)現(xiàn)，而溴結(jié)構(gòu)域作為Spt7蛋白結(jié)構(gòu)的主要結(jié)構(gòu)域，其在Spt7相關(guān)功能中可能起到主要作用。

3.2 過表達(dá)spt7對(duì)菌體表征的影響

通過與原始菌株的形態(tài)觀察比較，從整體來看，菌體形態(tài)并無太大區(qū)別，但是在生長(zhǎng)過程中，轉(zhuǎn)化子與對(duì)照組在產(chǎn)生分生孢子前，轉(zhuǎn)化子的菌絲更加茂密，進(jìn)一步用顯微鏡觀察菌絲形態(tài)，發(fā)現(xiàn)菌絲分枝增多。但是菌體產(chǎn)孢延遲說明過表達(dá)spt7對(duì)菌體生長(zhǎng)繁殖十分有利，并且在產(chǎn)孢期，轉(zhuǎn)化子的孢子數(shù)量明顯提高是對(duì)照組的2-3倍，通過以上現(xiàn)象我們推測(cè)spt7可能是菌體生長(zhǎng)繁殖的關(guān)鍵基因。研究發(fā)現(xiàn)Spt7基因的缺失導(dǎo)致釀酒酵母生長(zhǎng)緩慢且Ty、INO1、MFA1等基因的轉(zhuǎn)錄受到抑制［10-12］，且本課題組獲得的一株缺失Spt7基因的高產(chǎn)檸檬酸黑曲霉菌落聚縮生長(zhǎng)、不產(chǎn)分生孢子以及無法正常產(chǎn)酸，總之Spt7是酵母細(xì)胞、黑曲霉生長(zhǎng)很重要的核蛋白，對(duì) RNA 聚合酶轉(zhuǎn)錄的某些基因的表達(dá)有關(guān)鍵性的調(diào)控作用。

3.3 OE spt7菌體對(duì)不良環(huán)境的抗逆性分析

過氧化氫作為強(qiáng)氧化劑損耗細(xì)胞內(nèi)抗氧化物質(zhì)，使細(xì)胞抗氧化能力低下，進(jìn)而引起細(xì)胞衰亡。過表達(dá)spt7轉(zhuǎn)化子菌體在高濃度過氧化氫環(huán)境培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子的生長(zhǎng)幾乎不受過氧化氫的影響，推測(cè)Spt7參與了抗氧脅迫關(guān)鍵性基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。有研究顯示細(xì)胞在與逆境和活性氧做斗爭(zhēng)的過程中，細(xì)胞進(jìn)化出一套完整的應(yīng)答調(diào)控機(jī)制，通過調(diào)節(jié)體內(nèi)活性氧的代謝平衡，來保護(hù)DNA、脂質(zhì)和蛋白質(zhì)等免受氧化攻擊［23］。胞內(nèi)相應(yīng)抗氧化酶表達(dá)量提高，抗自由基氧化能力增強(qiáng)。在好氧發(fā)酵過程氧脅迫是影響發(fā)酵菌種生物量和菌體存活的關(guān)鍵因素之一。而過表達(dá)spt7提高菌體的抗氧化能力，降低氧脅迫對(duì)菌體造成的損失，對(duì)菌體發(fā)酵及提高發(fā)酵產(chǎn)物產(chǎn)量提供了一個(gè)思路。

在15%NaCl的高滲透壓的條件下培養(yǎng)OE spt7轉(zhuǎn)化子與對(duì)照組，生長(zhǎng)過程中可見對(duì)照組菌體變白，菌落較為干癟且菌體直徑變化不明顯。相對(duì)對(duì)照組轉(zhuǎn)化子菌絲依舊為淡黃色，說明菌體在高滲條件下依舊保持較高的活性。從分子層面分析，推測(cè)Spt7蛋白對(duì)相關(guān)Na+/K+-ATPase亞基基因［24］有所調(diào)節(jié)，從而提高了菌體對(duì)高滲環(huán)境的耐受性。

本研究中的黑曲霉1062最適生長(zhǎng)溫度是30℃，但在39℃條件下，OE spt7轉(zhuǎn)化子較對(duì)照組孢子萌發(fā)更快、生長(zhǎng)狀態(tài)良好且菌落依然飽滿，但是對(duì)照組孢子不僅萌發(fā)緩慢且在后期生長(zhǎng)也滯后且菌落干癟、失水嚴(yán)重。說明了過表達(dá)Spt7可以提高菌體的高溫耐受性。

3.4 OE spt7菌體過氧化物酶轉(zhuǎn)錄水平分析

常見的抗氧化酶有過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶Orgotein（superoxide dismutase，SOD）以及谷胱甘肽過氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px），為了驗(yàn)證該猜測(cè)，進(jìn)一步對(duì)這些過氧化物酶做轉(zhuǎn)錄組分析，驗(yàn)證過表達(dá)Spt7對(duì)這些酶的影響。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，過表達(dá)Spt7對(duì)CAT的轉(zhuǎn)錄水平無明顯影響，但是SOD、GPX、CpeB的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，推測(cè)過表達(dá)spt7提高了細(xì)胞對(duì)氧自由基的氧化損傷的防御，因氧化損傷的根本原因是細(xì)胞內(nèi)蛋白結(jié)構(gòu)的破壞，推測(cè)Spt7對(duì)維持蛋白結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有著決定性的作用。接下來對(duì)高溫耐受性的分析及細(xì)胞內(nèi)熱休克打敗的轉(zhuǎn)錄水平情況分析也進(jìn)一步證明了該猜測(cè)。

在大腸桿菌中有人提出了饑餓誘導(dǎo)交叉保護(hù)，即在大腸桿菌細(xì)胞生長(zhǎng)過程中，因?yàn)槿狈Ρ匾獱I(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)停滯，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生過氧化氫酶和其他過氧化物酶使細(xì)胞對(duì)過氧化氫產(chǎn)生了較強(qiáng)抵抗力［25-28］。另外還有人認(rèn)為在真核細(xì)胞中細(xì)胞衰老過程中各種功能逐漸下降是因?yàn)樵谡ＩL(zhǎng)代謝過程中產(chǎn)生的活性氧（ROS）引起的氧化損傷的累 積［29］。被氧化的蛋白質(zhì)失去了完整的結(jié)構(gòu)而喪失了催化活性［30］，從而引起細(xì)胞的衰老與死亡。在耗氧細(xì)胞進(jìn)化過程中產(chǎn)生了相應(yīng)的抗氧化機(jī)制即抗氧化酶如氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SODs）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPXs）。它們協(xié)同工作以保護(hù)細(xì)胞免受來自內(nèi)源性代謝或外部微環(huán)境的過多活性氧物種（ROS）的傷害。它們分工明確，其中CAT將H2O2分解為H2O與O2［31］，負(fù)責(zé)去除高濃度H2O2；而SOD將高活性的超氧陰離子（O2-）歧化為O2與低活性的H2O2［32］；GPXs和PRDXs負(fù)責(zé)降解低濃度下的H2O2［33］。在實(shí)驗(yàn)中CAT的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，作者推測(cè)是H2O2的濃度對(duì)于轉(zhuǎn)化子來說過低，不足以CAT發(fā)揮作用，所以發(fā)揮主要作用的為SOD以及GPX。

3.5 OE spt7菌體熱休克蛋白轉(zhuǎn)錄水平分析

以往研究表明，在植物細(xì)胞中，高溫會(huì)加快細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）的積累，從而導(dǎo)致細(xì)胞衰老甚至死亡［34-36］。同時(shí)應(yīng)激會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞蛋白質(zhì)平衡失調(diào)和細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)聚集［37-38］。熱休克反應(yīng)機(jī)制包括高溫引起的熱休克轉(zhuǎn)錄因子（heat shock factors HSFs）和熱休克蛋白（heat shock proteins HSPs）的變化［39］。其中HSF是調(diào)節(jié)植物中HSP表達(dá)的重要轉(zhuǎn)錄因子。熱休克蛋白具有分子伴侶的功能，可以穩(wěn)定蛋白質(zhì)，修復(fù)受損的蛋白質(zhì)，并確保在熱應(yīng)激期間蛋白質(zhì)的正確組裝和折疊［40］。作者對(duì)轉(zhuǎn)化子及對(duì)照組的部分熱激蛋白進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的觀察，有意思的是，在熱激3 h條件下，較對(duì)照組相比轉(zhuǎn)化子的Spt7轉(zhuǎn)錄水平略微上調(diào)，但Hsp40、Hsp70及Hsp90的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著性差異；在熱激5 h條件下，僅有Hsp90的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了差異性的變化。查文獻(xiàn)得知當(dāng)HSP處于應(yīng)激狀態(tài)下時(shí)，它們的合成速度會(huì)很明顯的加快，通常能夠在半小時(shí)內(nèi)達(dá)到巔峰水平。因?yàn)榇藸顟B(tài)下熱休克蛋白的合成增多，所以其他的蛋白會(huì)相應(yīng)的合成速度降低，合成數(shù)量減少［41］。

從菌體表征看過表達(dá)Spt7對(duì)菌體的生長(zhǎng)及對(duì)不良環(huán)境的耐受性均有很大的幫助。該蛋白可能對(duì)生物細(xì)胞內(nèi)糖代謝、各類氨基酸代謝途徑的關(guān)鍵酶基因具有調(diào)控作用，作為SAGA復(fù)合體的組成成分之一，Spt7可能參與SAGA的調(diào)控，在不同的環(huán)境中作為單獨(dú)的調(diào)控因子對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)基因進(jìn)行定向調(diào)控。對(duì)黑曲霉內(nèi)Spt7的研究彌補(bǔ)絲狀真菌領(lǐng)域Spt7相關(guān)研究的空缺。

4 結(jié)論

本文以黑曲霉1062為出發(fā)菌株過表達(dá)Spt7，OE spt7轉(zhuǎn)化子較原始菌株菌絲生長(zhǎng)更茂盛，菌絲分枝增多，且分枝變短，菌體產(chǎn)孢延遲但產(chǎn)孢增多。較原始菌株相比OE spt7轉(zhuǎn)化子的過氧化氫耐受性、高溫耐受性及高滲耐受性均明顯增強(qiáng)。對(duì)不同環(huán)境下相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄情況觀察發(fā)現(xiàn)，Spt7通過對(duì)抗氧化脅迫及高溫調(diào)控關(guān)鍵性的基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄調(diào)控從而提高菌株的不良環(huán)境的抗逆性。總之，過表達(dá)Spt7有利于菌體的生長(zhǎng)及繁殖，在不良環(huán)境下，延長(zhǎng)了菌體的時(shí)序壽命，增加了菌體對(duì)不良環(huán)境的耐受性。