花生瘡痂病菌藍(lán)光受體EaWC 1基因克隆及生物信息學(xué)分析

李洋 張曉天 樸靜子 周如軍 李自博 關(guān)海雯

（沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，沈陽(yáng) 110866）

光是細(xì)胞生物感知信號(hào)和適應(yīng)環(huán)境重要的信息載體，在生長(zhǎng)發(fā)育、有性生殖、次生代謝和晝夜節(jié)律等方面發(fā)揮著重要調(diào)控作用［1-2］。植物病原真菌的各種生理活動(dòng)也同樣受到光調(diào)控，眾多研究結(jié)果表明，光對(duì)于真菌的形態(tài)建成、次生代謝和致病性等具有顯著影響［3-4］，但在不同種類真菌中的影響效應(yīng)明顯不同。光照影響布萊克須霉（Phycomyces blakesleeanus）的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成，孢子囊柄彎曲方向具有明顯的光趨向性［5-6］，而對(duì)于灰霉菌（Botrytis cinerea），光照負(fù)調(diào)控菌核產(chǎn)生和致病力［7］，光刺激竹黃菌（Shiraia bambusicola）分生孢子產(chǎn)量明顯增加，但次生代謝產(chǎn)物竹紅菌素（hypocrellin）產(chǎn)量卻顯著降低［8］，這些研究證實(shí)真菌光效應(yīng)種間差異顯著。

真菌具有復(fù)雜且保守的光感系統(tǒng)-光受體（photoreceptor），主要包括藍(lán)光受體、紅光/遠(yuǎn)紅光受體和綠光受體3種類型［9］，由于藍(lán)光受體更易受光刺激產(chǎn)生光信號(hào)，快速啟動(dòng)光感系統(tǒng)，調(diào)控下游次生代謝產(chǎn)物編碼基因表達(dá)而備受關(guān)注［10-11］。Crosthwaite等［12］最早從粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）中克隆得到第一個(gè)真菌藍(lán)光受體基因WC 1，研究證實(shí)該受體對(duì)真菌晝夜節(jié)律、菌絲趨向性、無(wú)性發(fā)育、有性生殖和類胡蘿卜素等次生代謝產(chǎn)物生物合成具有調(diào)控作用［13］。目前在構(gòu)巢曲霉（Aspergillus nidulans）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）、禾谷鐮孢菌（Fusarium graminearum）、卷枝毛霉菌（Mucor circinelloides）、深 綠 木 霉（Trichoderma atroviride）、交鏈格孢（Alternaria alternata）、灰霉菌（B. cinerea）和玉米灰斑病菌（Cercospora zeae maydis）等多種真菌中均篩選鑒定到藍(lán)光受體WC 1同源基因［14-21］，光照培養(yǎng)C. zeae maydis野生型菌株和突變體發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光受體基因CRP1存在能夠抑制孢子產(chǎn)生，促進(jìn)毒力因子尾孢菌素（Cercosporin）積累，CRP1基因缺失明顯降低病菌致病性和病斑擴(kuò)展能力［20］。

花生瘡痂?。‥lsino? arachidis）是我國(guó)花生生產(chǎn)中的重要病害，發(fā)生普遍，危害嚴(yán)重。其致病菌能夠產(chǎn)生一種光敏性苝醌類真菌毒素——痂囊腔菌素（elsinochromes，ESC），ESC是痂囊腔菌屬重要的毒力因子，生物合成受到光調(diào)控［22］。目前，關(guān)于光調(diào)控ESC生物合成的研究報(bào)道相對(duì)較少，僅在柑橘瘡痂病菌（E. fawcettii）和花生瘡痂病菌（E. arachidis）中闡明了光照對(duì)ESC的生物合成具有正向調(diào)控作用［23-24］，而光質(zhì)對(duì)ESC生物合成影響效應(yīng)及調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究尚未見(jiàn)報(bào)道。研究團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)光能夠顯著促進(jìn)花生瘡痂病菌中ESC生物合成［24］，基因組中存在藍(lán)光受體WC 1同源基 因，命名為EaWC 1。在此基礎(chǔ)上，本文開(kāi)展了花生瘡痂病菌藍(lán)光受體EaWC 1基因克隆，生物信息學(xué)分析和表達(dá)模式研究，旨在為藍(lán)光受體WC 1基因功能、ESC毒素生物合成受光調(diào)控機(jī)制和調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

花 生 瘡 痂 ?。‥lsino? arachidis）菌 株LNJH-C01，分離自遼寧錦州花生種植基地。

1.2 方法

1.2.1 花生瘡痂病菌DNA提取 菌株采用涂布培養(yǎng)法［24］，25℃光照條件下培養(yǎng)14 d，設(shè)置光強(qiáng)度為30 μE·m-2·s-1，采用DNA提取試劑盒（天根生化科技有限公司）提取DNA，1.0%瓊脂糖凝膠電泳，NanoDrop ND-2000分光光度計(jì)檢測(cè)DNA質(zhì)量，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因克隆 根據(jù)前期基因組數(shù)據(jù)進(jìn)行藍(lán)光受體基因序列引物設(shè)計(jì)［24］，通過(guò)Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引 物Eawc-1F：5'- CAGCCATGATGCAAGGAC-3'，Eawc-1R：5'-TTGAGTGGGCGAGGCGTGT-3'。25 μL擴(kuò)增體系，包括Mix酶12.5 μL，ddH2O 9.5 μL，引物各1 μL，DNA模板1 μL。擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸3 min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min，1%瓊脂糖凝膠電泳。由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 用DNAMAN生物軟件進(jìn)行序列比對(duì)，利用ORF Finder、Softberry Web Site、ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam）、NetPhos 3.1 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）、InterProScan、https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin）、Swiss model（https：//www.swissmodel.expasy.org）等在線軟件分析開(kāi)放閱讀框、外顯子、內(nèi)含子、編碼蛋白理化性質(zhì)、保守結(jié)構(gòu)域和二三級(jí)結(jié)構(gòu)等信息，使用DOG 2.0軟件繪制結(jié)構(gòu)域。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 通過(guò)使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，查找藍(lán)光受體WC 1同源基因的氨基酸序列進(jìn)行BLAST分析，利用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，基因序列信息見(jiàn)表1。

表1 WC 1同源基因序列信息Table 1 Sequence information of WC 1 homologous gene

1.2.5 花生瘡痂病菌EaWC 1基因的表達(dá)分析 病菌PDA培養(yǎng)基中黑暗培養(yǎng)14 d后，置于不同光質(zhì)的LED燈下（白光波長(zhǎng)450-465 nm，藍(lán)光波長(zhǎng)490-530 nm），光強(qiáng)度為30 μE·m-2·s-1，以黑暗為對(duì)照，培養(yǎng)36 h，刮取菌絲，采用RNA提取試劑盒（普洛麥格生物技術(shù)有限公司）提取總RNA，置于-80℃保存。使用 HiFiScript cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）反轉(zhuǎn)錄cDNA。以Actin基因?yàn)閮?nèi)參基因，利用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)qPCR引物：EaWC-1-qF：5'-TATCGCCATCGGCACTCA-3'，EaWC-1-qR：5'-CGGATTCGGAAGACTACA-3'。反 應(yīng) 程 序：94℃ 2 min；94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 10 s，循環(huán)45次。每處理3次重復(fù)，以黑暗培養(yǎng)條件為對(duì)照，計(jì)算EaWC 1基因的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 EaWC 1基因克隆

從花生瘡痂病菌中克隆EaWC 1基因（GenBank MZ274346），全長(zhǎng)為3 261 bp（圖1）。含有一條長(zhǎng)度3 261 bp的完整開(kāi)放閱讀框，編碼1 086 aa的蛋白，僅含有1個(gè)外顯子，無(wú)內(nèi)含子。

圖1 EaWC 1基因PCR擴(kuò)增Fig. 1 PCR amplification of EaWC 1 gene

2.2 蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

真菌藍(lán)光受體WC-1具有保守結(jié)構(gòu)域，包括一個(gè)LOV（light oxygen voltage）域、兩個(gè)PAS（Per- Art-Ser）域和一個(gè)ZNF（zinc finger）結(jié)構(gòu)域。結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)表明，花生瘡痂病菌EaWC-1蛋白同樣含有LOV（128 aa）、PAS（109 aa和114 aa）和ZNF（52 aa）結(jié)構(gòu)域（圖2），花生瘡痂病菌結(jié)構(gòu)域分布與N. crassa和C. zeae maydis等真菌中藍(lán)光受體編碼蛋白結(jié)構(gòu)域基本吻合，僅在序列長(zhǎng)度上存在細(xì)微差異。

圖2 WC-1 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析Fig.2 Protein domain analysis of WC-1

2.3 EaWC 1基因同源性分析

藍(lán)光受體WC 1基因的LOV結(jié)構(gòu)域可結(jié)合黃素色團(tuán)感知藍(lán)光。利用DNAMAN對(duì)真菌中藍(lán)光受體WC 1同源基因LOV結(jié)構(gòu)域的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果表明，花生瘡痂病菌藍(lán)光受體EaWC1的LOV結(jié)構(gòu)域與比對(duì)蛋白序列同源性80.1%，擁有11個(gè)結(jié)合黃素色團(tuán)所需殘基（“↓”表示），以及參與光誘導(dǎo)反應(yīng)的保守半胱氨酸殘基（“*”表示）（圖3）。

圖3 WC-1蛋白氨基酸序列比對(duì)Fig. 3 Amino acid sequence alignment of WC-1 protein

BLAST分析結(jié)果表明，EaWC-1編碼蛋白與粗糙脈孢菌（N. crassa）、葡萄黑痘病菌（E. ampelina）、 柑橘瘡痂病菌（E. fawcettii）和玉米灰斑病菌（C. zeae maydis）等多種真菌的特征基因和預(yù)測(cè)基因具有較高的同源性（圖4）。與葡萄黑痘病菌WC-1同源蛋白相似性最高達(dá)97.93%，其次為柑橘瘡痂病菌（94.06%），EaWC-1分布在痂囊腔菌屬形成的緊密分支中，表明所分析的序列為同源蛋白。

圖 4 EaWC-1蛋白序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree of EaWC-1 protein sequence

2.4 EaWC 1基因生物信息學(xué)分析

2.4.1 理化性質(zhì)及親疏水性分析 通過(guò)ExPASy網(wǎng)站ProtParam對(duì)EaWC 1基因所編碼蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析，分子量為119 563.30 Daltons，理論等電點(diǎn)（pI）為8.81，為堿性氨基酸。該蛋白脂溶性系數(shù)為57.92，不穩(wěn)定系指數(shù)為49.71，為不穩(wěn)定蛋白質(zhì)；平均親水性指數(shù)為（GRAVY）為-0.739。利用Protscale 對(duì)EaWC 1編碼蛋白的疏水性/親水性預(yù)測(cè)分析，表明EaWC 1編碼蛋白在413位的I有最大值為2.133，疏水性最強(qiáng)，在948位的E有最小值為-3.711，親水性最強(qiáng)，多肽鏈表現(xiàn)出親水性（圖5）。

圖5 蛋白疏水性 Fig. 5 Protein hydrophobicity

2.4.2 編碼蛋白磷酸位點(diǎn)及亞細(xì)胞定位 對(duì)EaWC 1基因編碼蛋白是否存在可被激酶磷酸化的氨基酸殘基進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，該基因含有多個(gè)可被磷酸化氨基酸殘基，說(shuō)明該蛋白可以被激酶磷酸化后發(fā)揮作用（圖6）。利用亞細(xì)胞定位在線分析工具分析，預(yù)測(cè)EaWC 1基因編碼蛋白可能定位在細(xì)胞核。

圖6 編碼蛋白磷酸位點(diǎn)分析Fig.6 Analysis of phosphate sites of encoded protein

2.4.3 蛋白信號(hào)肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè) 使用在線工具分析EaWC-1蛋白是否存在信號(hào)肽及信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)。分析顯示，編碼蛋白Sec信號(hào)肽（Sec/SPI）結(jié)構(gòu)約為0.0005，不存在信號(hào)肽的剪切位點(diǎn)（CS），說(shuō)明蛋白可能是非分泌蛋白。此外，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，EaWC 1基因編碼蛋白不存在跨膜螺旋結(jié)構(gòu)域，為非膜蛋白。

2.4.4 蛋白質(zhì)二三級(jí)結(jié)構(gòu) EaWC 1基因進(jìn)行了二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，其中α螺旋有283個(gè)，占比26.06%；β轉(zhuǎn)角共有116個(gè)，占比10.68%；無(wú)規(guī)則卷曲共有509個(gè)，占比46.87%（圖7）。

圖7 蛋白二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)Fig. 7 Secondary and tertiary structure prediction of protein

2.5 基因表達(dá)量分析

光質(zhì)對(duì)E. arachidis的ESC生物合成具有顯著影響，白光條件下毒素含量為54 nmol/plug，藍(lán)光處理促進(jìn)ESC積累，毒素含量為71 nmol/plug，黑暗條件下未檢測(cè)到毒素產(chǎn)生。qPCR分析表明，白光和藍(lán)光條件下EaWC 1基因均顯著上調(diào)表達(dá)，相對(duì)表達(dá)量分別為黑暗培養(yǎng)的7.48倍和14.62倍（圖8-9），EaWC 1基因的表達(dá)模式與ESC毒素含量趨勢(shì)相同，該基因參與調(diào)控ESC生物合成。

圖8 病菌培養(yǎng)特性 Fig. 8 Culture characteristics of E. arachidis

圖9 EaWC 1基因表達(dá)分析及ESC含量Fig.9 EaWC 1 expression analysis and ESC production light quality

3 討論

細(xì)胞生物中光感應(yīng)與傳導(dǎo)是一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，藍(lán)光受體是各種真菌生長(zhǎng)發(fā)育和次生代謝等生理生化過(guò)程所必須的生物感受器。藍(lán)光受體WC 1編碼蛋白通常具有3個(gè)PAS結(jié)構(gòu)域和一個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)域，其中兩個(gè)PAS域用于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作，鋅指結(jié)構(gòu)域用于核定位［25-27］，靠近N端的PAS域?qū)儆谝活愄厥獾慕Y(jié)構(gòu)域，稱為L(zhǎng)OV結(jié)構(gòu)域，也稱光、氧或電壓域。LOV結(jié)構(gòu)域含有一個(gè)半胱氨酸殘基，光照條件下半胱氨酸與黃素色團(tuán)（FAD）結(jié)合，發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，形成半胱氨酰復(fù)合物，黑暗條件下，此過(guò)程發(fā)生逆轉(zhuǎn)，完成光周期循環(huán)［27-28］。雖然真菌藍(lán)光受體WC 1基因的結(jié)構(gòu)域高度保守，但基因功能研究證明，該基因在種間的生物功能有所差異，模式真菌粗糙脈孢菌中WC 1基因影響生物鐘和類胡蘿卜素的生物合成［26］，而藍(lán)光受體Fgwc 1基因影響禾谷鐮孢菌有性繁殖和無(wú)性發(fā)育［16］。本研究在花生瘡痂病菌中克隆獲得藍(lán)光受體EaWC 1基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)和同源聚類分析發(fā)現(xiàn)，該基因全長(zhǎng)序列為3 261 bp，具有一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，編碼長(zhǎng)度為1 086個(gè)氨基酸的蛋白質(zhì)。具有明顯的藍(lán)光受體編碼基因WC 1的保守結(jié)構(gòu)域，即一個(gè)LOV結(jié)構(gòu)域，兩個(gè)PAS域和一個(gè)ZNF結(jié)構(gòu)域。系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，EaWC 1與粗糙脈孢菌（N. crassa）、柑橘瘡痂病菌（E. fawcettii）和玉米灰斑病菌（C. zeae maydis）等真菌的藍(lán)光受體基因有高同源性，研究結(jié)果為花生瘡痂病菌藍(lán)光受體基因EaWC 1的功能及毒素光調(diào)控模式研究奠定了分子基礎(chǔ)。

基因表達(dá)是將遺傳信息通過(guò)轉(zhuǎn)錄、剪接和翻譯等方式轉(zhuǎn)變成功能產(chǎn)物的所有加工過(guò)程，能夠體現(xiàn)內(nèi)部生理生化反映的調(diào)控及應(yīng)答效應(yīng)，是生物生命活動(dòng)的基礎(chǔ)和關(guān)鍵［29］。光生物學(xué)研究表明，藍(lán)光受體WC 1基因的表達(dá)調(diào)控與多種真菌次生代謝產(chǎn)物的生物合成具有高度關(guān)聯(lián)性。光照能夠促進(jìn)水稻惡苗病菌（F. fujikuroi）中鐮孢菌素（Fusarins）的生物合成，此時(shí)藍(lán)光受體WcoA基因高表達(dá)［30］，藍(lán)光受體LreA基因正向調(diào)控鏈格孢菌中Altertoxin（ATX）生物合成，但反向調(diào)節(jié)Alternariol（AOH）毒素產(chǎn)生［19］。花生瘡痂病菌ESC生物合成與光照密切相關(guān)，但光調(diào)控機(jī)制尚不清晰，本文開(kāi)展了毒素含量與EaWC 1基因表達(dá)量相關(guān)性研究，結(jié)果表明，白光和藍(lán)光條件下EaWC 1基因均上調(diào)表達(dá)，藍(lán)光培養(yǎng)條件下基因表達(dá)量是白光下的2.15倍，其表達(dá)模式與ESC毒素含量趨勢(shì)相同，進(jìn)而證明了花生瘡痂病菌ESC生物合成受到EaWC 1基因調(diào)控。目前除粗糙脈孢菌、構(gòu)巢曲霉和鏈格孢菌等真菌藍(lán)光受體研究相對(duì)深入外，痂囊腔菌屬的光響應(yīng)研究主要集中在生物學(xué)表型及表達(dá)量研究方面，而基因功能研究相對(duì)較少，調(diào)控模式和分子機(jī)制尚不清晰，應(yīng)盡快開(kāi)展藍(lán)光受體EaWC 1基因功能及ESC毒素生物合成光調(diào)控機(jī)制研究工作，為該病菌的致病機(jī)制、病原寄主互作和精準(zhǔn)防控提供科學(xué)支撐。

4 結(jié)論

本研究成功克隆獲得了花生瘡痂病菌藍(lán)光受體編碼基因EaWC 1，全長(zhǎng)為3 261 bp，編碼蛋白含1 086氨基酸，為不含信號(hào)肽和跨膜螺旋結(jié)構(gòu)的堿性親水蛋白，主要定位于細(xì)胞核上。

光照條件顯著促進(jìn)藍(lán)光受體基因EaWC 1上調(diào)表達(dá)，藍(lán)光條件下基因表達(dá)量最高，表達(dá)模式與ESC毒素含量趨勢(shì)相同，光受體基因EaWC 1在花生瘡痂病菌ESC毒素生物合成光調(diào)控過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。