不同多酚處理對荔枝果肉抗氧化能力的影響

楊梓萌，白新宇，尹 楠，曾教科

(海南大學(xué)園藝學(xué)院，?？?，570228)

荔枝LitchichinensisSonn.是無患子科荔枝屬常綠果樹，果皮鮮紅色，果肉富含酚類、多糖、維生素等營養(yǎng)物質(zhì)，具有抗氧化、護(hù)肝、改善脂質(zhì)代謝以及降血糖等功效[1-2]。荔枝多以鮮食為主，果實收獲于高溫高濕的季節(jié)，采后呼吸作用強(qiáng)，常溫條件下2～3 d即發(fā)生果皮褐變，品質(zhì)下降或商品性喪失，極不耐貯運(yùn)[3-4]。近年來，大量研究報道荔枝保鮮技術(shù)措施，如SO2熏蒸[5]、低溫[6]、氫水[7]、包裝[8]、有機(jī)酸[9]等，均可用于維持荔枝采后果實品質(zhì)，延緩果皮褐變以及延長貯運(yùn)壽命[4，10]。其中，SO2熏蒸處理是目前荔枝應(yīng)用最廣的一種采后保鮮方式，但會在果實可食部位殘留而影響消費(fèi)者健康[5]。因此，可替代SO2的天然抗氧化劑或保鮮劑被進(jìn)一步研發(fā)。

多酚是植物次生代謝產(chǎn)物，源于莽草酸衍生的苯丙素和聚酮途徑。多酚作為一種天然的抗氧化劑，在植物抗性、植物營養(yǎng)和產(chǎn)品添加劑等方面發(fā)揮重要作用[11]。近年來，多酚在果蔬保鮮上的研究也受到廣泛關(guān)注[12]。研究報道，茶多酚可有效延緩荔枝、油梨等果實品質(zhì)劣變，延長保鮮期[13-14]。蘋果多酚處理可以維持荔枝、芋艿等采后較好的風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)[15-16]。綠原酸處理可延緩油桃果皮色澤轉(zhuǎn)變，增強(qiáng)抗氧化活性，維持采后品質(zhì)[17]。其他多酚類物質(zhì)如p-香豆酸[18]、原花青素[19]、荔枝多酚[20]等，也可延緩果實采后衰老，延長貨架期。

雖然茶多酚和蘋果多酚可維持荔枝采后品質(zhì)，但因其成本較高而并未應(yīng)用于生產(chǎn)。我們前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，原花青素(PA)、p-香豆酸(p-CA)、綠原酸(CHA)、茶多酚(TPP)和蘋果多酚(APP)等酚類物質(zhì)可有效延緩采后荔枝果皮褐變和衰老進(jìn)程，且原花青素處理表現(xiàn)最顯著的抗氧化能力[21]。因此，在前期研究基礎(chǔ)上，我們進(jìn)一步系統(tǒng)評價這5種多酚處理對采后荔枝果肉總酚、總黃酮和維生素C含量及抗氧化活性的影響，為多酚應(yīng)用于荔枝果實采后保鮮提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“妃子笑”荔枝LitchichinensisSonn.cv.Feizixiao果實采摘于?？谑杏琅d鎮(zhèn)荔枝果園，挑選大小均勻、成熟度一致、無機(jī)械損傷和病蟲害的果實，帶枝采摘于當(dāng)天運(yùn)回實驗室備用。

原花青素(≥98%)、蘋果多酚、97%茶多酚、98%綠原酸、98%p-香豆酸均購于西安澤朗生物科技有限公司，97%奎諾二甲基丙烯酸、2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基(≥98.5%)、99% 2，4，6-三吡啶基三嗪、98% 2，2′-聯(lián)氨-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二胺鹽、福林酚購于麥克林生化科技有限公司，三氯化鐵、甲醇、無水乙醇購于西隴科學(xué)股份有限公司，無水乙酸鈉、碳酸鈉購于廣州化學(xué)試劑廠，其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司產(chǎn)；電子天平，上海浦春計量儀器有限公司產(chǎn)；智能數(shù)顯恒溫水油浴鍋，鄭州予華儀器制造有限公司產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)，江蘇省鹽城市凱特實驗儀器有限公司產(chǎn)；超聲儀，浙江省寧波市新芝生物科技股份有限公司產(chǎn)。

1.3 方法

1.3.1 荔枝保鮮處理 帶枝荔枝剪留果柄長0.5 cm果實后，隨機(jī)分成6組，分別用清水(對照)、3 g/L原花青素、0.6 mmol/Lp-香豆酸、1 g/L茶多酚、5 g/L蘋果多酚和50 mg/L綠原酸溶液浸泡10 min，果實自然晾干后分別裝入PE保鮮袋中，放置于(20±1)℃、相對濕度85%～90%的培養(yǎng)箱中貯藏10 d；每2 d取樣1次測定相關(guān)指標(biāo)，每處理重復(fù)3次，每重復(fù)果實15個。

1.3.2 總酚含量測定 參考徐灼輝等[22]的方法并稍作改進(jìn)，稱取果肉1 g用無水甲醇研磨后，4 ℃下避光提取2 h后，12 000 rpm離心20 min即得提取液；取提取液上清液0.1 mL加入福林酚試劑0.2 mL和10%碳酸鈉溶液2.7 mL，在50 ℃恒溫水浴鍋中保溫30 min，取混合液3 mL，以蒸餾水為對照，置于700 nm處測吸光值，并帶入回歸方程計算總酚含量，單位為mg/g，每個樣品重復(fù)測定3次。

1.3.3 總黃酮含量測定 參考朱楊帆等[23]的方法并稍作改進(jìn)，將1.3.2中制作的提取液以無水甲醇為對照，在325 nm波長下測定其吸光值，并帶入回歸方程計算總黃酮含量，單位為mg/g，每個樣品重復(fù)測定3次。

1.3.4 維生素C含量測定 參考曹建康等[24]的方法進(jìn)行，稱取果肉樣品2 g加入草酸溶液研磨后，12 000 rpm離心20 min，收集上層溶液加入三角瓶中，用2，6-二氯靛酚溶液滴定至出現(xiàn)微紅色，且30 s內(nèi)不褪色為止，并記錄用量，計算維生素C含量，單位為 mg/100 g。維生素C含量=V×(V1-V0)×ρ/(VS×m)×100，式中，V為樣品提取液總體積，mL；V1為樣品滴定消耗的染料體積，mL；V0為空白滴定消耗的染料體積，mL；ρ為1 mL染料溶液相當(dāng)于維生素C的質(zhì)量，mg/mL；VS為滴定時所取樣品溶液體積，mL；m為樣品質(zhì)量，g。

1.3.5 DPPH自由基清除能力測定 參考孫海龍等[25]的方法并稍作改進(jìn)，取1.3.2中制作的提取液加入DPPH溶液中，避光反應(yīng)，以無水甲醇加DPPH試劑為參比溶液，在517 nm下測定吸光度值以清除率計算自由基清除能力。DPPH自由基清除能力(%)=[1-(AS-A0)/AC]×100，式中，AS為樣品實測吸光值，A0樣液加無水甲醇的吸光值，AC為DPPH溶液加無水甲醇的吸光值。每個樣品重復(fù)測定3次。

1.3.6 FRAP抗氧化能力測定 參考徐灼輝等[22]的方法并稍作改進(jìn)，稱取樣品進(jìn)行研磨，取研磨緩沖液超聲5 min后，5 000 rpm離心5 min，取上清液并加入70%乙醇3 mL，進(jìn)行第2次超聲離心，離心后合并兩次上清液并冷藏保存獲得提取液。取提取液加入FRAP工作液，混勻反應(yīng)20 min，以蒸餾水代替樣品加入FRAP工作液作為空白調(diào)零，在593 nm處讀取吸光值，以Trolox(水溶性維生素E)濃度0.1～1.6 mmol/L代替樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線。FRAP抗氧化值以Trolox當(dāng)量計，單位為mmol/g。每個樣品重復(fù)測定3次。

1.3.7 ABTS抗氧化能力測定 參考徐灼輝等[22]的方法并稍作改進(jìn)，向試管中加入ABTS工作液，加入1.3.6提取液100 μL，用無水甲醇作空白對照，用紫外可見分光光度計測定其在734 nm的吸光值，以清除率計算抗氧化能力。ABTS抗氧化能力(%)=(A0-A)/A0×100，式中，A0為稀釋后工作液吸光度值，A為樣品吸光度值。每個樣品重復(fù)測定3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行Duncan多重比較、相關(guān)性分析和主成分分析，用Microsoft Excel軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 對果肉總酚含量的影響

由圖1可知，在貯藏期間，所有處理總酚含量整體呈先上升后下降的趨勢。對照(清水)總酚含量在貯藏2 d達(dá)到峰值；不同多酚處理的果實總酚含量在貯藏2～8 d達(dá)到峰值，并且貯藏中后期其值顯著高于對照(清水)(p<0.05)，說明多酚處理能夠增強(qiáng)荔枝果實貯藏中后期總酚含量。其中，原花青素處理的荔枝果肉總酚含量增加最顯著。

注：相同時間不同小寫字母表示差異顯著，p<0.05。圖2至圖6同。

2.2 對果肉總黃酮含量的影響

由圖2可知，總黃酮含量在貯藏過程中略有下降，但變化趨勢不明顯。與對照(清水)相比，除了貯藏8 d，其余時間茶多酚、蘋果多酚和綠原酸處理與對照(清水)之間均無顯著性差異。原花青素和p-香豆酸處理在一定程度上維持較高的總黃酮含量，其中原花青素處理的效果最顯著(p<0.05)。

圖2 原花青素等多酚處理對“妃子笑”荔枝果肉總黃酮含量的影響

2.3 對果肉維生素C含量的影響

由圖3可知，隨著貯藏時間的延長，荔枝果肉中維生素C含量呈下降趨勢。與對照(清水)相比，多酚處理可以延緩維生素C含量下降。其中，原花青素和綠原酸處理對維生素C含量的保持效果較顯著，且與對照(清水)維生素C含量有顯著性差異(p<0.05)；而p-香豆酸處理與對照(清水)的維生素C含量基本無顯著性差異。因此，原花青素和綠原酸處理可顯著維持荔枝果肉維生素C含量。

圖3 原花青素等多酚處理對“妃子笑”荔枝果肉維生素C含量的影響

2.4 對果肉抗氧化活性的影響

由圖4至圖6可知，3種方法測定的對照(清水)果肉抗氧化活性在貯藏過程中均呈下降趨勢。與對照(清水)相比，不同多酚處理顯著(p<0.05)抑制DPPH自由基清除能力的下降。其中，在貯藏前期(0～4 d)，原花青素、p-香豆酸和綠原酸對抗氧化活性的保持效果更顯著；在貯藏中后期(6～10 d)，原花青素、茶多酚、蘋果多酚處理對抗氧化活性的保持效果更顯著。說明多酚處理可以保持荔枝果肉較高的抗氧化活性，其中以原花青素處理的保持效果最顯著(p<0.05)。

圖4 原花青素等多酚處理對“妃子笑”荔枝果肉DPPH自由基清除能力的影響

圖5 原花青素等多酚處理對“妃子笑”荔枝果肉FRAP抗氧化能力的影響

圖6 原花青素等多酚處理對“妃子笑”荔枝果肉ABTS抗氧化能力的影響

采后對照(清水)果肉FRAP抗氧化能力逐漸下降。多酚處理顯著(p<0.05)抑制FRAP的下降。在貯藏前中期(0～6 d)，所有多酚處理均對抗氧化活性有一定的維持效果；在貯藏中后期(8～10 d)，以原花青素和綠原酸處理的效果更顯著(p<0.05)。說明多酚處理可以保持荔枝果肉較高的FRAP活性，以原花青素和綠原酸處理的保持效果較顯著(p<0.05)。

采后對照(清水)果肉ABTS抗氧化能力呈逐漸下降趨勢，多酚處理顯著(p<0.05)抑制ABTS的下降。在貯藏前期(0～4 d)，原花青素、p-香豆酸、茶多酚和蘋果多酚處理均對抗氧化活性有一定的維持效果；在貯藏后期(8～10 d)，以綠原酸處理的效果更顯著(p<0.05)。說明多酚處理可以保持荔枝果肉較高的ABTS活性，且不同多酚發(fā)揮作用的時期不相同。

2.5 相關(guān)性分析

對荔枝果肉中總酚、總黃酮、維生素C含量與DPPH自由基清除能力、FRAP抗氧化能力、ABTS抗氧化能力進(jìn)行相關(guān)性分析。由圖7可知，總黃酮含量與 DPPH自由基清除能力顯著(p<0.05)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.648；維生素C含量則與FRAP及ABTS抗氧化能力均呈顯著(p<0.05)正相關(guān)，且相關(guān)系數(shù)分別為 0.626和0.564?？寡趸笜?biāo)之間也存在相關(guān)性，F(xiàn)RAP抗氧化活性與ABTS抗氧化活性之間顯著(p<0.05)正相關(guān)關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.793。

注：*表示顯著相關(guān)，p<0.05。

2.6 果肉抗氧主成分分析

對不同處理的荔枝果肉抗氧化物質(zhì)和活性進(jìn)行主成分分析，由表1可知，成分1和成分2的特征值大于1，且兩者的累積貢獻(xiàn)率達(dá)到71.858%。因此，可以抽取成分1和成分2代表所有變量，利用成分1和成分2作載荷圖。

表1 “妃子笑”荔枝果肉抗氧主成分分析

由圖8可知，PC1、PC2分別解釋了變量的40.24%、31.62%。總酚含量、總黃酮含量、DPPH自由基清除能力均分布在PC1和PC2的正方向；ABTS抗氧化能力、FRAP抗氧化能力和維生素C含量分布在PC1的正方向、PC2的負(fù)方向。因此，不同處理可以通過PC2較好的區(qū)分，主要通過總黃酮含量和維生素C含量體現(xiàn)。

圖8 “妃子笑”荔枝果肉抗氧主成分分析載荷

2.7 不同處理的果肉抗氧化活性綜合評價

選取前兩個主成分PC1和PC2(累積貢獻(xiàn)率為71.86%)，對不同處理及不同貯藏時間的荔枝果肉進(jìn)行抗氧化活性綜合評價，將標(biāo)準(zhǔn)化后的原始數(shù)據(jù)代入主成分表達(dá)式計算各個樣本的主成分得分，樣本得分為Y1和Y2，F(xiàn)=0.402 43Y1+0.316 15Y2，據(jù)此函數(shù)得出荔枝果肉抗氧化能力綜合得分。由表2可知，綠原酸處理貯藏8 d的綜合抗氧化活性得分最高，其次原花青素處理貯藏6 d的組別、對照貯藏0 d、原花青素處理貯藏4 d的綜合抗氧化活性得分較高。說明原花青素、綠原酸處理的荔枝果肉抗氧化活性較高。

表2 不同多酚處理的不同貯藏時間“妃子笑”荔枝果肉抗氧化活性得分和綜合評價得分

比較不同處理累積得分發(fā)現(xiàn)，原花青素處理的荔枝果肉抗氧化活性得分最高，對照(清水)的得分最低。不同處理的得分從高到低依次為：原花青素、綠原酸、蘋果多酚、茶多酚、p-香豆酸和對照(清水)。

3 結(jié)論與討論

果蔬中具抗氧化活性的營養(yǎng)物質(zhì)如酚類、黃酮類、維生素C等，其抗氧化活性來自氧化還原作用；而多酚是植物天然的抗氧化劑，兼具果蔬保鮮和人體保健功效[26]。本試驗中，隨著貯藏時間延長，荔枝果肉中總酚含量逐漸上升而后下降，呈峰形變化，而多酚處理可增強(qiáng)貯藏中后期果肉總酚的積累。這與采后荔枝果肉總酚含量呈峰形變化[27]，蘋果多酚可延緩采后荔枝果肉總酚含量的下降等結(jié)論相一致[28]。荔枝果肉總黃酮和維生素C含量采后呈下降趨勢[29]，多酚處理可以維持較高的總黃酮和維生素C含量。說明多酚處理可以增強(qiáng)荔枝果肉抗氧化物質(zhì)的含量，以維持果肉較高的抗氧化能力和營養(yǎng)品質(zhì)。采用3種不同的抗氧化評價方法，發(fā)現(xiàn)黃酮含量與DPPH自由基清除能力顯著正相關(guān)，維生素C含量與FRAP和ABTS抗氧化能力顯著正相關(guān)(p<0.05)，說明黃酮和維生素C含量對荔枝果肉總抗氧化能力的貢獻(xiàn)較大。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)，原花青素處理具有比其他多酚處理更顯著的抗氧化能力維持效果(排名第一)。原花青素是植物體內(nèi)的天然多酚物質(zhì)，具有抗氧化和清除自由基作用，能夠有效的清除活性氧進(jìn)而保護(hù)細(xì)胞[30]。相關(guān)研究表明，原花青素處理可以通過增強(qiáng)香蕉抗氧化酶活性和非酶促抗氧化物質(zhì)含量，來維持細(xì)胞氧化還原態(tài)的穩(wěn)定；同時促進(jìn)內(nèi)源原花青素的合成，從而顯著延緩香蕉采后衰老進(jìn)程[19]。本試驗中，原花青素處理也發(fā)揮了類似的作用，通過顯著增強(qiáng)果肉總酚、總黃酮和維生素C等抗氧化物質(zhì)含量，維持較高的抗氧化能力，從而維持荔枝果肉較高的營養(yǎng)品質(zhì)。本試驗篩選的原花青素具有價格低、易獲得等特點(diǎn)，適用于生產(chǎn)實踐。