桉木預(yù)水解液中半纖維素多糖分離純化及抗氧化活性研究

李學(xué)秀 劉海棠 安永貞 劉 婧 陳 琳 金 鑫

（中國輕工業(yè)造紙與生物質(zhì)精煉重點實驗室，天津科技大學(xué)天津市制漿造紙重點實驗室，天津，300457）

隨著黏膠纖維以及纖維制品需求量的不斷增加，未來幾年內(nèi)用于生產(chǎn)再生纖維的溶解漿產(chǎn)量也日益增多[1]。在生產(chǎn)溶解漿過程中會產(chǎn)生大量的預(yù)水解液，如何對預(yù)水解液進行合理利用成為當(dāng)前研究熱點。預(yù)水解液中半纖維素含量豐富，其他如木素、糠醛等含量較少，因此利用半纖維生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品可實現(xiàn)預(yù)水解液的有效利用[2]。

在預(yù)水解液半纖維素進行高附加值利用時，預(yù)水解液中的雜質(zhì)會阻礙其有效利用，因此需要對半纖維素進行分離和純化[3]。離子交換柱層析法在多糖的純化中應(yīng)用十分廣泛[4]，離子交換柱層析常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂。其機理主要是利用物質(zhì)所帶正負(fù)電荷的差異對管柱上的離子交換劑有不同的親和力，通過改變淋洗液的離子強度和pH 值，使得不同性質(zhì)的多糖依次從層析柱中分離出來[5]。半纖維素在眾多領(lǐng)域均具有潛在的應(yīng)用前景[6]，Anmad 等人[7]從車前子殼中分離出阿拉伯聚木糖，以此為原料制備出了抗菌薄膜。陳婷等人[8]對桉木堿性過氧化性機械漿（APMP）廢液中的半纖維素進行改性后發(fā)現(xiàn)其具有一定的生物活性。汪心娉等人[9]報道稱使用低共熔溶劑選擇性處理玉米秸稈，可將其中的半纖維素轉(zhuǎn)化為低聚木糖。但是有關(guān)預(yù)水解液半纖維素多糖分離純化和結(jié)構(gòu)分析的研究報道較少。

本研究通過對半纖維素粗多糖分離純化得到純化多糖，對其單糖成分、結(jié)構(gòu)表征及體外抗氧化活性進行研究，以期對預(yù)水解液的進一步研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 實 驗

1.1 材料及試劑

桉木預(yù)水解液（PHL），山東太陽紙業(yè)股份有限公司；濃硫酸、氯化鈉、無水乙醇，分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司；無水甲醇，色譜純，天津市康科德科技有限公司；DEAE-650M，生化試劑，TOSOH 公司；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等，色譜純，Sigma公司。

1.2 實驗儀器

7000 B氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；T6新世紀(jì)紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責(zé)任；N-1100 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；FTIR-650 傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；H3021D 高速離心機，上海知信實驗儀器技術(shù)有限公司；SCIENTZ-10N冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；1530VP 掃描電子顯微鏡，德國LEO公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 預(yù)水解液糖組分分析

桉木預(yù)水解液原樣以及酸水解后的預(yù)水解液經(jīng)離心機（8000 r/min，15 min）離心除雜，過0.22μm 濾膜后稀釋到一定濃度，用高效陰離子交換色譜儀測定糖含量。

1.3.2 半纖維素粗多糖的制備

將離心除雜后的桉木預(yù)水解液原樣進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，使用濃硫酸酸化預(yù)水解液至pH 值2.0，除去木素，靜置過夜。取上清液以體積比1∶4 的比例加入無水乙醇沉淀（使無水乙醇含量達到80%），靜置24 h，8000 r/min 離心15 min，收集沉淀物，真空冷凍干燥獲得半纖維素粗多糖（PHLP）。

1.3.3 半纖維素粗多糖的分離純化

將PHLP配制成濃度為1 mg/mL的溶液，取20 mL溶液加樣至DEAE-650M 陰離子交換層析柱，依次用蒸餾水、0.2、0.4、0.6 mol/L 的NaCl 溶液進行梯度洗脫，每個梯度洗脫100管。使用收集器收集，每管收集5 mL。采用苯酚-硫酸法[10]檢測各管的多糖含量。洗脫曲線的橫坐標(biāo)為洗脫管數(shù)，縱坐標(biāo)為測定的多糖含量。將洗脫曲線中各峰對應(yīng)管數(shù)的洗脫液合并，對收集的洗脫液減壓濃縮后用去離子水透析除鹽。透析完全后進行真空冷凍干燥即得到純化后的2 種多糖PHLP-1和PHLP-2。

1.3.4 葡萄糖醛酸含量測定

釆用硫酸-咔唑法測定[11]葡萄糖醛酸含量。精確稱取干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖醛酸50 mg，用蒸餾水溶解，定容于100 mL 容量瓶中。分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 和0.6 mL 濃度為0.5 mg/mL 的葡萄糖醛酸溶液于試管中，分別補加水至1 mL，在冰水浴中加入6 mL 濃硫酸?；靹蚝?，在85℃下水浴20 min，冷卻至室溫，每管加入0.2 mL 咔唑溶液（1 g/L，用無水乙醇配制）。室溫下保持2 h，在530 nm 下測定吸光度。以葡萄糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖醛酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。按上述操作步驟測定吸光度，從而計算葡萄糖醛酸濃度。

圖1 葡萄糖醛酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of glucuronic acid solution

1.3.5 單糖組分測定

1.3.5.1 標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生化[12]

分別配置1 mg/mL 的各單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，包括葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖及半乳糖放入試管中。分別取0、40、80、100、250、500μL 單糖凍干。在凍干后的標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品中，分別加入50μL濃度為20 mg/mL 的甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液，40℃水浴80 min 后加入80μL 的N,O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA），混勻，40℃水浴80 min，然后在10000 r/min 下離心10 min，取上清液過0.22μm 濾膜后置于進樣瓶，進行氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（GCMS）分析。

1.3.5.2 純化后的多糖水解及衍生化[13]

稱取2 mg 多糖于反應(yīng)釜中，加入5 mL 三氟乙酸（2 mol/L 三氟乙酸（TFA）），密封后120℃水解2 h，之后加入無水甲醇旋蒸除去殘留TFA，最后加入2 mL去離子水，混勻，取100μL 混合液于新的離心管中，真空冷凍干燥。按照1.3.5.1標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生化方法處理，反應(yīng)產(chǎn)物進行氣質(zhì)分析。

1.3.5.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件

色譜柱為HP-5 氣相色譜柱（30 cm×0.32 mm×0.25μm）；進樣口溫度設(shè)定為250℃，檢測器溫度設(shè)定為240℃，流速1 mL/min；升溫程序：初始溫度為110℃，保持2 min，以8℃/min 速率升到160℃，再以2℃/min 速率升到230℃，最后以5℃/min 的速率升到250℃，保持2 min。載氣為氮氣，進樣量為1μL，分流比為10∶1。

1.3.6 紅外光譜（FT-IR）測定

稱取純化后的多糖至瑪瑙研缽中，按照1∶100的比例加入干燥后的溴化鉀做分散劑，研磨成微細(xì)粉末，然后置于模具中，以10 MPa 壓力壓制1 min制片，進行紅外光譜測定。光譜掃描范圍400~4000 cm-1，掃描32 次，分辨率為4 cm-1，掃描時扣除H2O 和CO2的背景。

1.3.7 掃描電子顯微鏡（SEM）觀察

在金屬樣品臺上粘貼一塊導(dǎo)電膠用于固定樣品，取適量純化后的多糖樣品置于導(dǎo)電膠上，用洗耳球輕輕吹去浮樣，將金屬樣品臺放入離子濺射裝置中鍍一層導(dǎo)電金膜，鍍膜后用1530VP 掃描電子顯微鏡進行觀察。

1.3.8 PHLP抗氧化活性分析

1.3.8.1 DPPH自由基清除活性測定

參考馮炘等人[14]的方法稍作修改，具體步驟為：取不同濃度的多糖溶液（0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mg/mL） 和VC 溶 液 與1 mL DPPH-乙 醇 溶 液（0.1 mmol/L） 混合均勻，避光反應(yīng)30 min 后測定517 nm 下的吸光度。以VC 為陽性對照。按式（1）計算1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的清除率。

DPPH自由基清除率=

式中，A1為實驗組吸光度；A2為樣品本底吸光度；A0為空白組吸光度。

1.3.8.2 ABTS自由基清除活性測定

參考XU 等人[15]的方法稍作修改，具體為：取2,2′-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）溶液（7.4 mmol/L）30 mL 于50 mL 離心管中，加入30 mL過硫酸鉀溶液（2.6 mmol/L），混合均勻，避光反應(yīng)12 h。然后用蒸餾水稀釋，使其在734 nm下的吸光度約為0.7±0.02，制成ABTS 反應(yīng)液。取1 mL 不同濃度的多糖溶液和VC溶液（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）與4 mL ABTS 反應(yīng)液混合均勻，靜置10 min 后測定734 nm 下的吸光度。以VC 為陽性對照。按式（2）計算ABTS自由基清除率。

ABTS自由基清除率=

式中，B1為實驗組吸光度；B2為樣品本底吸光度；B0為空白組吸光度。

1.3.8.3 O2-自由基清除活性測定

參考DONG 等人[16]的方法。具體為：取4.5 mL Tris-HCl 緩沖溶液（pH 值=8.2，50 mmol/L）于試管中，加入1 mL 不同濃度的多糖溶液和VC 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8 和1.0 mg/mL），加入0.3 mL 經(jīng)25℃水浴后的鄰苯三酚溶液（10 mmol/L，以10 mmol/L HCl 配制）。迅速搖勻后，25℃水浴5 min，然后加入1 mL HCl（8 mmol/L）終止反應(yīng)，在320 nm 處測定吸光度。以VC 為陽性對照。按式（3）計算O2-自由基清除率。

式中，C1為實驗組吸光度；C2為樣品本底吸光度；C0為空白組吸光度。

1.3.8.4 OH-自由基清除活性測定

參考CHEN 等人[17]的方法稍作修改，具體為：取不同濃度的多糖溶液及VC 溶液（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）于試管中，依次加入1 mL FeSO4溶液（5 mmol/L）、1 mL 水楊酸-乙醇溶液（5 mmol/L），最后加入1 mL H2O2溶液（5 mmol/L），混合均勻后，在37℃下水浴30 min。在510 nm 處測定吸光度，VC 為陽性對照。按式（4）計算OH-自由基清除率。

式中，D1為實驗組吸光度；D2為樣品本底吸光度；D0為空白組吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 預(yù)水解液糖組分分析

表1 為預(yù)水解液中糖組分的含量。由表1 可知，預(yù)水解液中單糖主要有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，其中以木糖為主，占單糖含量的57.6%。聚糖以聚木糖為主，占聚糖含量的65.7%。

表1 預(yù)水解液中糖組分的含量Table 1 The monosaccharide and polysaccharide contents of PHL g/L

2.2 PHLP分離純化分析

在陰離子交換層析柱中，氯化鈉溶液中的陰離子（氯離子）將會與吸附在填料上的多糖競爭，而使用蒸餾水和不同濃度的氯化鈉溶液洗脫則可以達到分離多糖的目的。

以DEAE-650M 離子交換層析柱對PHLP 進行分離純化，得到洗脫曲線如圖2 所示。由圖2 可以看出，經(jīng)蒸餾水、0.2、0.4、0.6 mol/L NaCl 溶液洗脫后，有3 個洗脫峰。第1 個洗脫峰是經(jīng)蒸餾水洗脫出來的，因為這一部分糖對填料的親和力較小，吸附能力較弱，所以最先被洗脫出來[18]；而另外擁有較強吸附能力的糖組分則隨著洗脫液中陰離子的逐漸增多被洗脫下來，得到第2個洗脫峰，當(dāng)用0.4 mol/L的NaCl洗脫時出現(xiàn)了較小的洗脫峰，因其糖含量較少沒有純糖的必要，故不再進行收集。以蒸餾水和0.2 mol/L NaCl 溶液作為洗脫液洗脫下的多糖，分別為PHLP-1中性糖和PHLP-2 酸性糖[19]。測定PHLP-1 的得率為33.9%，PHLP-2 的得率為25.5%。PHLP-1 和PHLP-2的葡萄糖醛酸含量分別為0.0057、0.081 mg/mL，PHLP-2 的糖醛酸含量明顯高于PHLP-1，這與洗脫液鹽濃度的增加可能有極大的關(guān)系，氯化鈉溶液濃度越高，洗脫下來的多糖側(cè)鏈所帶酸根基團越多，多糖的酸性也就越強[20]。

圖2 多糖的DEAE-650M洗脫曲線Fig.2 Elution curve of crude polysaccharides on DEAE-650M

2.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析

因糖類物質(zhì)的極性較大，難以汽化，因此在使用氣質(zhì)聯(lián)用分析多糖時，需要對糖進行衍生化處理，使其成為易于汽化的衍生物。本研究采用硅烷化法對5種單糖標(biāo)準(zhǔn)品進行衍生化，然后進行GC-MS 分析，結(jié)果如圖3 和圖4 所示。從圖3 和圖4 可以看出，從PHLP-1、PHLP-2中檢測出5種單糖：阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖，其摩爾比分別為0.09∶1∶0.13∶0.07∶0.35和0.1∶1∶0.03∶0.09∶0.08。

圖3 單糖標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS色譜圖Fig.3 GC-MS chromatogram of monosaccharide standard

圖4 多糖PHLP-1、PHLP-2的GC-MS色譜圖Fig.4 GC-MS chromatogram of polysaccharides of PHLP-1,PHLP-2

2.4 紅外光譜測定

圖5 為PHLP-1 和PHLP-2 的FT-IR 圖。如 圖5 所示，PHLP-1 和PHLP-2 具有多糖的典型吸收帶。3400 cm-1處為羥基伸縮振動峰，由多糖分子內(nèi)或分子間的—OH 伸縮振動引起；2923 cm-1處是C—H 鍵的伸縮振動吸收峰；在PHLP-2 中，1735 cm-1處出現(xiàn)了1 個弱吸收峰，是由酯羰基（COOR）伸縮振動引起的，1600 cm-1處共有的強峰為羧酸酯振動峰，是由—COO—的伸縮振動引起，說明分子含有糖醛酸，表明PHLP-2 是酸性多糖[21]；1400 cm-1處的中強峰代表羧基的存在；1120、1076、1045 及620 cm-1處出現(xiàn)的振動峰，是由吡喃糖的C—O—C 的特征骨架振動造成的[22]；900 cm-1處的振動吸收峰，代表2 個多糖是以β-糖苷鍵連接的[23]；但840 cm-1處左右有較弱的吸收信號，證明PHLP-1 中α-糖苷鍵的存在[24]。根據(jù)結(jié)果得知，PHLP-1和PHLP-2均含有吡喃環(huán)和β-糖苷鍵，PHLP-1 中含有α-糖苷鍵，PHLP-2 為沒有α-糖苷鍵的酸性多糖。

圖5 PHLP-1、PHLP-2的FT-IR圖Fig.5 FT-IR spectra of PHLP-1 and PHLP-2

2.5 形貌分析

圖6 為多糖PHLP-1、PHLP-2 的SEM 圖。從圖6可以看出，PHLP-1 形態(tài)不一，比較雜亂；PHLP-2 呈疏松的碎片狀結(jié)構(gòu)，且表面比較光滑。SEM 圖直觀的說明了PHLP-1 和PHLP-2 均呈無序雜亂的結(jié)構(gòu)形態(tài)。2 種多糖結(jié)構(gòu)的差異性可能與其單糖組成比例不同有很大的關(guān)系[24]。

圖6 多糖PHLP-1、PHLP-2的SEM圖Fig.6 SEM images of polysaeeharides from PHLP-1 and PHLP-2

2.6 抗氧化活性分析

2.6.1 DPPH自由基清除活性

DPPH 自由基是一種常見的穩(wěn)定自由基，常被用于評估抗氧化劑自由基清除能力[25]。DPPH 自由基在溶液中呈現(xiàn)深紫色，并且在517 nm左右有1個強吸收帶，DPPH 自由基的清除機理是抗氧化劑提供的氫和電子，可以將DPPH 自由基還原為黃色，降低其在517 nm 處 的 吸 光 值[26]。圖7 為PHLP-1、PHLP-2 及粗多糖對DPPH 自由基的清除能力。由圖7 可以看出，PHLP-1 和PHLP-2 對DPPH 自由基的清除能力均隨多糖濃度的提高而增強，且呈現(xiàn)明顯的量效依賴關(guān)系。當(dāng)多糖的質(zhì)量濃度達到1 mg/mL 時，PHLP-1、PHLP-2 和粗多糖的DPPH 自由基清除率分別達到44.12%、47.79%和20.44%，但是它們清除DPPH 自由基的能力明顯低于VC 清除DPPH 自由基的能力。其清除自由基能力強弱順序為VC>PHLP-2>PHLP-1>粗多糖，IC50值依次為0.3×10-5、0.553、0.603、2.204 mg/mL，IC50值作為半抑制濃度，該值越小，代表自由基清除能力越強[20]。粗多糖由于其中含有的復(fù)雜成分較多，清除DPPH 自由基能力降低，影響了其抗氧化活性[27]，因此清除能力低于PHLP-1 和PHLP-2。而PHLP-2 較PHLP-1 的清除自由基能力強的原因是PHLP-2為酸性多糖，其糖醛酸含量較高，可以活化異頭碳上的氫原子，從而賦予其更高的抗氧化活性[28]。2.6.2 ABTS自由基清除活性

圖7 PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對DPPH自由基的清除能力Fig.7 DPPH radical scavenging activities of PHLP-1,PHLP-2 and crude polysaccharides

多糖作為供氫體可以和ABTS 自由基反應(yīng)，通過反應(yīng)后溶液吸光度值降低的大小，從而來判斷多糖的抗氧化能力[29]。圖8 為PHLP-1、PHLP-2 及粗多糖對ABTS 自由基的清除能力。由圖8 可知，PHLP-1、PHLP-2 和粗多糖對ABTS 自由基具有一定的清除能力，且隨著濃度的增加，清除率逐漸提高。當(dāng)濃度達到1 mg/mL 時，PHLP-1、PHLP-2 和粗多糖的清除率分別達到67.62%、71.81%和31.05%，清除ABTS 自由基的能力弱于VC 清除ABTS自由基的能力。PHLP-2 對ABTS 自由基的清除能力最好，其次是PHLP-1，它們的抗氧化能力均大于粗多糖。PHLP-2、PHLP-1、粗多糖對ABTS 自由基清除濃度的IC50值依次為0.580、0.669、3.721 mg/mL。有研究[30-31]發(fā)現(xiàn)多糖中糖醛酸含量與自由基清除能力呈線性正相關(guān)，這與本研究的實驗結(jié)果相吻合。此外Sun 等人[32]也報道了糖醛酸含量越高的黑木耳實體多糖其清除自由基的能力也越強。

圖8 PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對ABTS自由基的清除能力Fig.8 ABTS radical scavenging activities of PHLP-1,PHLP-2 and crude polysaccharides

2.6.3 O2-自由基清除活性

圖9 PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對O2-自由基的清除能力Fig.9 O2-radical scavenging activity of PHLP-1,PHLP-2 and crude polysaccharides

2.6.4 OH-自由基清除活性

OH-自由基是較為活潑的自由基之一，OH-自由基的存在可能會引起機體生物大分子氧化受損[36]。圖10 為PHLP-1、PHLP-2 及粗多糖對OH-自由基的清除作用。由圖10可知，PHLP-1、PHLP-2兩種多糖組分對OH-自由基的清除能力均較弱。在1 mg/mL 時，PHLP-1、PHLP-2 和粗多糖的清除率分別為20.74%、22.70%和11.68%，明顯低于同濃度下VC 的清除能力。PHLP-2、PHLP-1、粗多糖對OH-自由基清除能力 的IC50值 依 次 為6.932、7.216、89.857 mg/mL。PHLP-2 的OH-自由基清除能力略強于PHLP-1，這可能是由于PHLP-2的糖醛酸含量比PHLP-1較多，糖醛酸與反應(yīng)溶液中的Fe2+螯合減少了羥基的生成[37]。

圖10 PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對OH-自由基的清除能力Fig.10 OH-radical scavenging activity of PHLP-1,PHLP-2 and crude polysaccharides

3 結(jié) 論

本研究采用醇沉法從桉木預(yù)水解液中提取半纖維素粗多糖（PHLP），并利用DEAE-650M 離子交換柱對其進行分離純化，對純化得到的中性多糖PHLP-1和酸性多糖PHLP-2兩種組分進行分析。

3.1 單糖組分結(jié)果表明，PHLP-1 和PHLP-2 兩種多糖均由阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖及葡萄糖組成，其摩爾比分別為0.09∶1∶0.13∶0.07∶0.35 和0.1∶1∶0.03∶0.09∶0.08。

3.2 紅外光譜測定表明，PHLP-1 和PHLP-2 均具有多糖典型的特征吸收峰，都含有吡喃環(huán)和β-糖苷鍵，并且PHLP-1 含有α-糖苷鍵，而PHLP-2 為不含α-糖苷鍵的酸性多糖。掃描電子顯微鏡觀察PHLP-1 和PHLP-2均呈無序雜亂的結(jié)構(gòu)形態(tài)。

3.3 抗氧化結(jié)果表明，PHLP-1 和PHLP-2 及粗多糖對DPPH 自由基和ABTS 自由基均具有較強的清除能力，對O2-自由基和OH-自由基的清除能力較弱，但是均呈現(xiàn)隨質(zhì)量濃度的增加清除率逐漸升高的現(xiàn)象，說明PHLP-1和PHLP-2具有一定的抗氧化潛力，其中PHLP-2的抗氧化活性高于PHLP-1。