復(fù)合酶法提取石蓮花多糖及其護(hù)膚特性研究

沈晨露，孔昊，郭嘉文，仇小麗，倪雅萍，姜維娜

（南京師范大學(xué)泰州學(xué)院化學(xué)與生物工程學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

石蓮花，景天科擬石蓮花屬，莖節(jié)間短，株型矮小，葉灰綠色，肥厚多汁，是一類多肉植物的統(tǒng)稱，也是近年來較流行的小型多肉植物[1]。目前對(duì)多功能多肉植物的化學(xué)成分、藥理和臨床等方面的研究取得了一定的進(jìn)展，但對(duì)其有效成分、藥理機(jī)制方面還有待深入研究[2]。因此，加快多功能多肉植物資源及其藥用、觀賞，以及作為食用和食品加工原料于一體的綜合研究和開發(fā)具有重要的意義。

研究表明，多糖類物質(zhì)是石蓮花最主要的活性成分之一，具有降血糖、降血脂、抗氧化、抗腫瘤、保肝、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒、抗炎等療效[3]，并且其在化妝品工業(yè)上也有應(yīng)用，如透明質(zhì)酸、肝素甲殼素及其衍生物等。目前，常用熱水回流法[4]、超聲波法[5]、微波法[6]等提取多糖成分，熱水回流法提取溫度高，提取率較低；超聲波法和微波法有引起糖苷鍵斷裂的可能，因此，本實(shí)驗(yàn)采用果膠酶和纖維素酶的復(fù)合酶法來提取石蓮花多糖[7]。酶提法能在比較溫和的條件下分解植物組織，加速多糖的釋放，有著廣闊的應(yīng)用前景。同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)石蓮花多糖的護(hù)膚特性進(jìn)行了相關(guān)研究，以此為石蓮花多糖的深度開發(fā)及其在化妝品等膚用產(chǎn)品中的應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

石蓮花，市售；果膠酶、纖維素酶，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

鹽酸、苯酚、硫酸、過二硫酸鉀、氫氧化鈉、葡萄糖、無水磷酸氫二鈉、二水合磷酸二氫鈉，分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鉀，分析純，上海凌峰化學(xué)試劑。

FA2004 型電子分析天平，上海方瑞儀器有限公司；XMTD-701 型恒溫水浴鍋，上海碩光電子科技有限公司；RE-52AA 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；DF-101S 型恒溫加熱磁力攪拌器，上海百申儀器設(shè)備有限公司；LGJ-12S 型真空冷凍干燥機(jī)，北京松源華興科技發(fā)展有限公司；WFZ UV-2000 型紫外可見分光光度計(jì)，尤尼柯（上海）儀器有限公司；P8 型皮膚水分測(cè)試儀，深圳市朵美琳科技有限公司；Bruker VERTEX 80 V 傅里葉變換紅外光譜儀。

1.2 從石蓮花葉中提取多糖

采用復(fù)合酶解法提取石蓮花中的多糖。取新鮮的石蓮花葉肉洗凈去皮，研磨碾碎，以料液比1∶20 g/mL 加入到蒸餾水中，用磷酸鹽緩沖液調(diào)節(jié)溶液的pH 值[8]，加入5.0%的復(fù)合酶量（纖維素酶-果膠酶，比例為2∶1，先加入纖維素酶后加入果膠酶），在設(shè)定的溫度條件下于水浴鍋中加熱一定時(shí)間，酶解后將溫度升高到100 ℃滅酶10min 終止酶解反應(yīng)，離心，提取上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)濃縮至10 mL，5 倍體積的無水乙醇，混勻；在低溫冰箱中靜置12 h，再以3 000 r/min 的轉(zhuǎn)速離心10 min 左右，收集沉淀并冷凍干燥。

1.3 石蓮花多糖的含量測(cè)定

采用苯酚-硫酸法[9]，在490 nm 處測(cè)吸光度。以葡萄糖濃度（c）為橫坐標(biāo)、吸光度（A）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：A=27.424c-0.005 900，R2=0.999 2。按下式計(jì)算石蓮花多糖提取率[10]：

多糖質(zhì)量濃度（%）=（C×V×D×M）/（m×W）式中C——標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的濃度（mg/mL）；

V——定容體積，mL；

D——稀釋倍數(shù)；

m——測(cè)定所用的粗多糖質(zhì)量，mg；

M——粗多糖質(zhì)量，g；

W——稱取的石蓮花葉片重量，g。

1.4 單因素實(shí)驗(yàn)

按照1.2 的方法，對(duì)提取工藝中酶解時(shí)間、溫度、溶液pH 值進(jìn)行考察：①在溶液pH 值為4.5，酶解時(shí)間為210 min 的條件下，以酶解溫度35、40、45、50、55 ℃分別進(jìn)行提取[11]；②在酶解溫度為50 ℃，溶液pH 值為4.5，其他條件不變的情況下，用復(fù)合酶法提取180、210、240、270、300 min[12]；③在酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為270 min，其他條件不變的情況下，以溶液pH 值為3、4、5、6、7 分別進(jìn)行提取[13]。

1.5 紅外光譜分析

石蓮花樣品用FT-IR 分光光度計(jì)進(jìn)行分析。樣品用KBr 粉末研磨并壓制成1 毫米顆粒，紅外分析的吸光度模式為4 000～500 cm-1，進(jìn)行FT-IR 分析[14]。

1.6 保濕性的測(cè)定

將石蓮花多糖配制成50 mg/mL 的溶液。隨機(jī)選取十名志愿者，在受試者手臂內(nèi)側(cè)5 cm 處標(biāo)記作為測(cè)試區(qū)域，將多糖溶液均勻的涂抹在測(cè)試區(qū)域，每個(gè)測(cè)試區(qū)涂抹1 mL 樣品溶液。采用皮膚水分測(cè)試儀，分別測(cè)量未涂抹樣品前、涂抹樣品后10、30、50、60、120 min 測(cè)試區(qū)域的皮膚水分含量，以評(píng)價(jià)石蓮花多糖的保濕性能。

1.7 抗紫外活性測(cè)定

配制濃度為2.5 mg/mL 的石蓮花多糖溶液，用分光光度計(jì)測(cè)量其在吸收波長(zhǎng)220～600 nm 之間的吸光度。

1.8 抗氧化性能測(cè)定

采用ABTS 法[15]，取0.8 mL ABTS 工作液進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，加入95%的乙醇0.2 mL，振搖10 s 使其充分混合，靜置6 min 后測(cè)試吸光度。記錄734 nm 處的吸光值A(chǔ)0。

再次取0.8 mL ABTS 工作液，加入1.0 mg/mL多糖溶液0.2 mL，振搖10 s 充分混合后，靜置6 min后測(cè)試吸光度。測(cè)試734 nm 處的吸光值A(chǔ)。根據(jù)公式計(jì)算自由基清除率

ABTS 自由基清除率=（1-A/A0）×100%

其中A0為對(duì)照組的吸光度，A為石蓮花多糖的吸光度。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 溫度對(duì)石蓮花多糖提取率的影響

溶液pH 值為4.5，酶解時(shí)間為210 min，復(fù)合酶加入量5%的條件下，以酶解溫度35、40、45、50、55 ℃分別進(jìn)行提取，考察酶解溫度對(duì)石榴籽多糖得率的影響，結(jié)果如圖1所示。隨著提取溫度的增加，石蓮花多糖得率逐漸增加，在溫度超過50 ℃后多糖得率反而下降，在50 ℃提取得率達(dá)到最大值。這可能是隨著溫度的升高，酶的活性也隨之增強(qiáng)，大大提高了復(fù)合酶對(duì)細(xì)胞壁的破壞能力，促進(jìn)多糖從裂解的細(xì)胞中溶出；而溫度過高時(shí)，酶蛋白變性，復(fù)合酶的活性逐漸喪失或多糖糖苷鍵斷裂，使多糖的溶出受到影響，因而得率下降。故以50 ℃作為最優(yōu)的酶解溫度。

圖1 溫度對(duì)石蓮花多糖提取率的影響Fig.1 The effect of temperature on the extraction rate of Echeveria polysaccharide

2.1.2 酶解時(shí)間對(duì)石蓮花多糖提取率的影響

如圖2所示，酶解時(shí)間在180～270 min 之間，石蓮花多糖得率不斷上升；而在時(shí)間超過270 min 后得率開始下降，最終得到在270 min 時(shí)多糖得率最高。這可能是在適宜的酶解時(shí)間內(nèi)，復(fù)合酶與石蓮花葉肉充分反應(yīng)，從而使石蓮花葉肉細(xì)胞壁組織結(jié)構(gòu)被充分破壞，有利于多糖的溶出；但當(dāng)時(shí)間過長(zhǎng)時(shí)，雜質(zhì)可能也會(huì)被提取出來，以致多糖的提取被抑制，同時(shí)多糖結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，也使得多糖得率降低。故以270 min 為最優(yōu)的酶解時(shí)間。

圖2 酶解時(shí)間對(duì)石蓮花多糖提取率的影響Fig.2 The effect of enzymatic hydrolysis time on the extraction rate of Echeveria polysaccharide

2.1.3 溶液pH 值對(duì)石蓮花多糖提取率的影響

酶解溫度為50 ℃，酶解時(shí)間為270 min，其他條件不變的情況下，以溶液pH 值為3、4、5、6、7分別進(jìn)行提取，結(jié)果如圖3所示。采用復(fù)合酶法提取材料中的有效成分，酶解效應(yīng)受介質(zhì)pH 值影響較大，從圖中可以看到，隨著溶液pH 值逐漸的升高，石蓮花多糖得率呈不斷下降趨勢(shì)；這可能是復(fù)合酶的生物效應(yīng)受溶液pH 值的影響較大，過堿的環(huán)境會(huì)造成多糖中糖苷鍵的斷裂，使得多糖結(jié)構(gòu)遭到破壞，多糖得率降低。故以pH 值為3 為最優(yōu)的溶液pH 值。

圖3 溶液pH 值對(duì)石蓮花多糖提取率的影響Fig.3 Effect of pH value on the extraction rate of Echeveria polysaccharide

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)，確定石蓮花多糖的最佳工藝條件為復(fù)合酶用量為5.0%、料液比1∶20g/mL、酶解溫度為50 ℃、酶解時(shí)間為270 min、pH 值為3，在此條件下，提取得石蓮花粗多糖的含量在6.09%。

2.2 石蓮花多糖的FT-IR 分析

圖4是石蓮花多糖的紅外吸收峰光譜圖，根據(jù)與茯苓多糖、魔芋甘露多糖等紅外光譜圖[16]的對(duì)比，其吸收峰和對(duì)應(yīng)的化學(xué)基團(tuán)分別是：3 393 cm-1（-OH的伸縮振動(dòng)），2 930 cm-1和2 426 cm-1（-C-H 的伸縮振動(dòng)），1 609 cm-1（-OH 的彎曲振動(dòng)），1 416 cm-1（=CH2的變形振動(dòng)），1 079 cm-1和1 022 cm-1（C-O-H，C-O-C 振動(dòng)）、881 cm-1（β-糖苷鍵）。通過紅外光譜的分析，可以推測(cè)得到的多糖屬于β多 糖。

圖4 石蓮花多糖的FT-IR 圖譜Fig.4 FT-IR spectrum of Echeveria polysaccharide

2.3 保濕性結(jié)果

本實(shí)驗(yàn)采用皮膚水分測(cè)試儀，分別在10 位志愿者皮膚表面涂抹樣品，測(cè)量未涂抹樣品前、涂抹樣品后10、30、50、60、120 min 測(cè)試區(qū)域的皮膚水分含量，以評(píng)價(jià)石蓮花多糖的保濕性能。根據(jù)圖5可以看出，石蓮花多糖溶液在涂上樣品后的1 h 內(nèi)可以保持不錯(cuò)的水分含量，在60 min 內(nèi)具有良好的保濕效果。后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)進(jìn)一步在不同年齡，不同性別的實(shí)驗(yàn)對(duì)象中展開研究。石蓮花多糖是由多個(gè)單糖或其衍生物聚合而成的大分子活性化物，其結(jié)構(gòu)中存在大量親水性羥基，使得多糖具有較強(qiáng)的吸水性、良好的成膜性，體現(xiàn)出較好的保濕性，并且植物提取物安全、綠色環(huán)保，可以開發(fā)為一種新型的化妝品保濕劑。

圖5 石蓮花多糖的保濕性效果Fig.5 Moisturizing effect of Echeveria polysaccharide

2.4 抗紫外活性結(jié)果

配制濃度為2.5 mg/mL 的石蓮花多糖溶液，用分光光度計(jì)測(cè)量其在吸收波長(zhǎng)220～600 nm 之間的吸光度，結(jié)果如圖6所示。從圖中可以看到，石蓮花多糖溶液在紫外光波段280～320 nm 之間具有較強(qiáng)紫外吸收，說明石蓮花多糖有很好的抗UV 活性，推測(cè)一方面是由于多糖結(jié)構(gòu)中存在紫外吸收基團(tuán)，另一方面是由于多糖化合物具有很好的成膜性，在皮膚表面形成一層保護(hù)膜。

圖6 石蓮花多糖的抗紫外活性Fig.6 Anti-UV activity of Echidna polysaccharides

2.5 抗氧化性結(jié)果

采用ABTS 法，考察石蓮花多糖對(duì)ABTS 自由基的清除效果，多糖測(cè)得在波長(zhǎng)為734 nm 處，A0=0.208 0，A=0.100 0。ABTS 與過二硫酸鉀反應(yīng)，可以生成綠色的ABTS 自由基。該自由基在734 nm 有最大吸收，一個(gè)物質(zhì)加入到ABTS 自由基溶液后，如果734 nm 的吸光度降低，可以說明該物質(zhì)具有自由基清除活性。通過實(shí)驗(yàn)，質(zhì)量濃度1.0 mg/mL 的石蓮花多糖ABTS 自由基清除率=（1-A/A0）×100%=（1-0.100 0/0.208 0）×10 0%=51.92%，說明石蓮花多糖的具有良好的抗氧化能力。

3 結(jié)論

以石蓮花多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了石蓮花多糖的復(fù)合酶法提取工藝。確定復(fù)合酶法提取石蓮花多糖的最佳工藝條件為：復(fù)合酶用量為5.0%、料液比1：20（g/mL）、酶解溫度為50 ℃、提取時(shí)間為270 min、pH 值為3，在此條件下，提取得石蓮花粗多糖的含量大致在6.09%左右。石蓮花多糖具有一定的保濕性、抗紫外活性和抗氧化活性，對(duì)于其深度開發(fā)利用還必須進(jìn)行更深入的作用機(jī)制研究。