結(jié)核分枝桿菌德拉馬尼和PA-824耐藥相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展

王曉英，羅 明，李俊剛，張匯征

由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, MTB)感染導(dǎo)致的結(jié)核病仍是全世界十大死因之一，并且是最致命的傳染性疾病之一。而耐藥結(jié)核病的出現(xiàn)，尤其是耐多藥結(jié)核病(multi-drug resistant tuberculosis, MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(extensive drug resistant tuberculosis，XDR-TB)的出現(xiàn)，使得結(jié)核病的防控和治療工作更加困難。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)估算，2020年全球耐多藥結(jié)核病及利福平耐藥結(jié)核病(rifampicin resistant tuberculosis, RR-TB)患者數(shù)約為15.8萬。2019年，我國約有1.6萬名MDR/RR-TB患者，約占全球MDR/RR-TB病例的10%。然而，RR-/MDR-TB的治療非常困難，成功率僅為59%[1]。近年來，抗結(jié)核藥物的研發(fā)取得了一些進(jìn)展。2019年，WHO在耐藥結(jié)核病治療整合版指南中，將德拉馬尼列為MDR-TB和XDR-TB治療的C組藥物[2]。PA-824(Pretomanid)是近半個世紀(jì)以來批準(zhǔn)上市的第3個抗結(jié)核病新藥。其與貝達(dá)喹啉和利奈唑胺組成的BPaL方案針對XDR-TB或無法耐受治療/治療欠佳的MDR-TB成人患者有較好的治療效果。參加此治療方案的109名高度耐藥結(jié)核病患者在經(jīng)過6個月治療后，治療成功率高達(dá)89.9%[3]。然而，德拉馬尼和PA-824作為抗結(jié)核新藥，也被報(bào)道存在MTB對這兩種藥物耐藥的情況。因此，及時(shí)檢測MTB對這兩種藥物的耐藥情況，能夠最大限度的降低耐藥風(fēng)險(xiǎn)并提高治療的有效性。本文對德拉馬尼和PA-824的耐藥機(jī)制及耐藥相關(guān)基因突變情況進(jìn)行了綜述，以期為今后這兩種藥物耐藥株的快速檢測提供參考。

1 德拉馬尼和PA-824的作用機(jī)理

德拉馬尼和PA-824同屬硝基咪唑類抗結(jié)核藥物，均是一種前體藥物，其作用機(jī)理類似。

1.1 德拉馬尼的作用機(jī)理 德拉馬尼是一種硝基二氫咪唑類衍生物的新型抗結(jié)核藥物，于2014年被歐洲藥品管理局批準(zhǔn)用于治療成人肺部MDR-TB。其作用機(jī)制是通過抑制MTB分枝菌酸的合成，尤其是甲氧基分枝菌酸和酮基分枝菌酸的合成，進(jìn)而擾亂MTB細(xì)胞壁的合成，有助于藥物對MTB的滲透，從而達(dá)到殺菌的效果[4-5]。另外，也有研究表明，德拉馬尼對MTB的抑制作用可能與NO等活性自由基的釋放有關(guān)[6]。

1.2 PA-824的作用機(jī)理 PA-824具有較高的抗MTB活性，對復(fù)制期和非復(fù)制期的MTB均有較好的殺菌作用。其對MTB的殺菌機(jī)制體現(xiàn)在好氧殺菌和厭氧殺菌兩個方面。好氧殺菌機(jī)制主要通過將MTB細(xì)胞壁分枝菌酸酯上的羥基氧化為羰基，從而抑制MTB細(xì)胞壁分枝菌酸的合成而發(fā)揮作用[7-9]。因PA-824是一種前體藥物，其在發(fā)揮抗MTB作用之前首先會被MTB激活。激活后的PA-824的4′端硝基咪唑基團(tuán)能夠形成活化的中間體，隨后損傷MTB細(xì)胞內(nèi)的其他分子。而在其厭氧殺菌機(jī)制中，PA-824可直接作為NO供體，而NO可直接抑制MTB呼吸鏈的電子傳遞，從而抑制MTB的生長[10]。

2 德拉馬尼和PA-824的耐藥機(jī)制

德拉馬尼和PA-824同為硝基咪唑類抗結(jié)核藥物，其耐藥機(jī)制也基本相同(圖1)。有研究認(rèn)為，MTB對這兩種藥物耐藥主要與激活前體藥物所需的酶功能的喪失有關(guān)。作為前體藥物，德拉馬尼和PA-824需要脫氮黃素(輔因子F420)依賴性硝基還原酶[deazaflavin (F420cofactor)-dependent nitroreductase, Ddn]激活其抗結(jié)核活性，而脫氮黃素由4種F420生物合成蛋白(F420biosynthesis protein, Fbi)共同參與合成，包括原來已報(bào)道的FbiA、FbiB、FbiC以及最新發(fā)現(xiàn)的FbiD[11-12]。而且F420的氧化還原循環(huán)需要葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(F420dependent glucose 6-phosphate dehydrogenase, Fgd1)的參與[13-15]。因此，ddn、fgd1以及參與F420生物合成途徑的fbiA、fbiB、fbiC和fbiD中任一基因突變都可能會引起MTB對德拉馬尼和PA-824的耐藥。雖然德拉馬尼和PA-824存在類似的耐藥機(jī)制，但目前鮮有關(guān)于這兩種藥物耐藥情況的比較分析。目前的研究表明，對德拉馬尼和PA-824耐藥的MTB存在部分相同的基因突變，但突變位點(diǎn)不盡相同。本文將對這兩種藥物耐藥相關(guān)基因及其突變位點(diǎn)進(jìn)行詳細(xì)的分析，以期為這兩種藥物耐藥株的快速檢測及其在臨床上的合理應(yīng)用提供參考。

注：*為目前的研究尚未證實(shí)fbiD基因突變與德拉馬尼耐藥相關(guān)。圖1 參與德拉馬尼和PA-824生物激活的基因Fig.1 The genes participate in the activation of delamamid and PA-824

2.1ddn(Rv3547)基因 全長456 bp，編碼F420依賴性的硝基還原酶，從而激活前體藥物PA-824和德拉馬尼。Ddn還原活化PA-824是以PA-824為底物、F420為輔酶直接還原PA-824，產(chǎn)生抑菌產(chǎn)物[7]。在MTB對德拉馬尼耐藥相關(guān)的研究中，Schena等的研究采用全基因測序技術(shù)對德拉馬尼耐藥菌株進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)僅ddn突變(Trp-88→STOP)可在德拉馬尼耐藥菌株中檢測到，說明其與德拉馬尼耐藥相關(guān)[16]。Fujiwara等在臨床MDR-TB分離株中檢測到了德拉馬尼耐藥菌株中存在氨基酸改變?yōu)長107P以及nt59-101的刪除突變[13]。Zheng等研究表明在4株德拉馬尼耐藥MTB菌株中，有2株存在ddn基因第81位密碼子突變[17]。而在MTB對PA-824耐藥的相關(guān)研究中，Haver等的研究表明，在183例PA-824誘導(dǎo)耐藥的MTB菌株中，檢測出53株中ddn基因存在19種突變，主要突變類型為C32A，導(dǎo)致的氨基酸改變?yōu)镾er11→STOP(58%，31/53)[12]。此外，多項(xiàng)研究表明，在體外誘導(dǎo)的PA-824耐藥菌株中，發(fā)現(xiàn)了ddn基因突變，但突變位點(diǎn)不盡相同[4,18-19]。Lee等的研究表明，雖然德拉馬尼和PA-824耐藥菌株中均存在ddn基因突變，但德拉馬尼和PA-824附著在Ddn上的位點(diǎn)不同。該研究發(fā)現(xiàn)，ddn基因S78Y突變的MTB對PA-824表現(xiàn)出耐藥但對德拉馬尼卻仍舊敏感，而ddn基因L49P突變卻導(dǎo)致MTB對德拉馬尼和PA-824的交叉耐藥[20]。

2.2fgd1(Rv0407)基因 全長1 011 bp，編碼6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶，催化葡萄糖6-磷酸氧化為磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯，進(jìn)而將F420還原為F420H2[21]。Bolemberg等在MTB臨床分離株中檢測出了fgd1基因突變，發(fā)現(xiàn)密碼子49的位置發(fā)生了移碼突變[22]。而Fujiwara等在MDR-TB臨床分離株中同樣檢測到了fgd1基因突變，發(fā)現(xiàn)在密碼子320的位置發(fā)生了置換突變[13]。而在體外誘導(dǎo)的PA-824耐藥菌株中，多項(xiàng)研究也檢測到了fgd1基因突變，但突變位置比較分散，發(fā)生在密碼子43和密碼子230之間，且每一種突變類型只能在1株突變菌株中檢測到，僅P43R突變在2株P(guān)A-824耐藥菌株中重復(fù)檢出[4,12, 18-19]。

2.3fbiA(Rv3261)基因 全長996 bp，fbiA編碼2-磷酸乳酸轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)將2-二磷酸-5-鳥苷的磷酸乳酯部分轉(zhuǎn)移到FO(7,8-二甲基-8-羥基-5-去氮雜黃素)中，F(xiàn)O隨后參與F420的生物合成[23]。Bloemberg等及Hoffman等關(guān)于德拉馬尼耐藥機(jī)制的研究表明，在德拉馬尼耐藥的臨床MTB分離株以及XDR-TB中檢測到了第49位密碼子突變(分別為D49Y和D49T)[22, 24]，而Schena等則在德拉馬尼耐藥的XDR-TB臨床分離株中檢測到了第250位密碼子突變(K250*)[16]，提示第49位和第250位密碼子突變可能與德拉馬尼耐藥有關(guān)。Battaglia等通過對德拉馬尼耐藥的MTB菌株進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)fbiA基因 K2E、V154I、I208V、I209V、K250*、S126P、R304Q突變與德拉馬尼最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)的升高有關(guān)[25]。在關(guān)于MTB對PA-824耐藥機(jī)制的兩個研究中，Haver等檢測出了27個無義突變或者是移碼突變，突變位點(diǎn)分布在第21-323位密碼子之間，其中第56位(L56P，L56P[T167C])、第81位(Q81P[242C插入])、第119位(L119P，L119P[T356C])以及第192位(K192K[575A插入]，K192S[575A插入])密碼子突變分別在2株P(guān)A-824耐藥菌株中檢測到，而其他密碼子突變僅在1株P(guān)A-824耐藥菌株中檢測到[12]。而Kidwai等的研究也發(fā)現(xiàn)由于fbiA基因滅活導(dǎo)致MTB對PA-824耐藥，但本研究中并未列舉具體的突變位點(diǎn)[19]。

2.4fbiB(Rv3262)基因 全長1 347 bp，fbiB編碼L-谷氨酸連接酶，通過向F420-0中添加L-谷氨酸殘基來催化F420生物合成途徑的最后步驟，產(chǎn)生聚L-谷氨酸尾[26]。目前，關(guān)于MTB對德拉馬尼耐藥機(jī)制的研究中，Battaglia等通過對德拉馬尼耐藥的MTB菌株進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)fbiB基因P361A突變與德拉馬尼MIC的升高有關(guān)[25]。然而，Nieto Ramirez等的研究表明，fbiB基因相關(guān)的突變僅在德拉馬尼敏感的MTB菌株中檢測到[27]。而關(guān)于MTB對PA-824耐藥機(jī)制的研究中，Haver等的研究表明，在體外誘導(dǎo)的PA-824耐藥菌株中，第39位(Y39*[G117A])、第153位(G153V[G458T])以及第361位(P361A[C1081G])密碼子發(fā)生了基因突變且分別僅在1株耐藥菌株中檢測到[12]。雖然，Kidwai等的研究也發(fā)現(xiàn)了由于fbiB基因滅活導(dǎo)致的MTB對PA-824耐藥，但研究中并未列舉具體的突變位點(diǎn)[19]。因此，fbiB基因相關(guān)突變是否與德拉馬尼耐藥相關(guān)，還需要進(jìn)行更深入的研究。

2.5fbiC(Rv1173)基因 全長2 571 bp，fbiC基因編碼FO合酶，將羥基芐基從4-羥基苯丙酮酸轉(zhuǎn)移到嘧啶二酮，隨后參與嘧啶二酮和FO之間F420生物合成途徑的一部分，F(xiàn)biC對F420的合成至關(guān)重要[6]。fbiC基因的失活使MTB對氧化應(yīng)激反應(yīng)變得敏感。Pang等對德拉馬尼耐藥的XDR-MTB菌株進(jìn)行檢測，并在2株XDR-MTB菌株中檢測到了fbiC第318位密碼子突變(V318I)，而且這2株XDR-MTB菌株中并未檢測到fbiA、fbiB、fgd1以及ddn基因突變[28]。Zheng等也在1株德拉馬尼耐藥MTB菌株中檢測到了fbiC第318位密碼子突變(V318I)[17]。Battaglia等通過對德拉馬尼耐藥的MTB菌株進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)fbiC基因C105R、L228F、L377P、A856P、A835V、S762N突變與德拉馬尼MIC的升高有關(guān)[25]。這些研究表明，fbiC基因突變可能與德拉馬尼耐藥相關(guān)。在關(guān)于MTB對PA-824耐藥機(jī)制的研究中，Haver等在6株體外誘導(dǎo)的PA-824耐藥菌株中，檢測到了第720位密碼子突變(V720I和V720G)，并在4株體外誘導(dǎo)的PA-824耐藥菌株中檢測到了第843位密碼子突變[12]。Manjunatha等的研究檢測到了體外誘導(dǎo)的PA-824耐藥MTB菌株中存在fbiC基因突變，突變位點(diǎn)為第630位密碼子(V630E)[4]。其他兩項(xiàng)研究也在體外誘導(dǎo)的PA-824耐藥MTB菌株中檢測到了fbiC基因刪除突變，從而導(dǎo)致MTB對PA-824耐藥[18-19]。

2.6fbiD(Rv2983)基因 FbiD為磷酸烯醇丙酮酸尿苷轉(zhuǎn)移酶，用來合成部分磷酸烯醇丙酮酸并隨后被FbiA轉(zhuǎn)移到FO中，而FO為F420的前體。而且，F(xiàn)420的生物合成也被證實(shí)需要FbiD的參與[11]。Rifat等的研究表明，fbiD基因突變將會導(dǎo)致MTB對德拉馬尼和PA-824耐藥。該研究通過對來自于47只小鼠的161株P(guān)A-824耐藥菌株進(jìn)行全基因組測序發(fā)現(xiàn)了99個突變，其中91%的突變出現(xiàn)在已報(bào)道的5種基因上：fbiC(56%)、fbiA(15%)、ddn(12%)、fgd(4%)以及fbiB(4%)，而剩余9%的PA-824耐藥菌株存在fbiD基因突變，包括8種點(diǎn)突變導(dǎo)致的氨基酸改變(R25S, R25G, A68E, A132V, G147C, C152R, Q114R, A198P)和A27之后插入C以及I129 (-ATC)的刪除突變[11]。fbiD基因突變導(dǎo)致了MTB對德拉馬尼和PA-824耐藥，但值得注意的是，fbiD和fbiB突變的菌株顯示出對PA-824的高水平耐藥，但對德拉馬尼的敏感性卻只有相對很小的改變[11]，這也可能解釋了在以往德拉馬尼耐藥的MTB菌株中未檢測到fbiD和fbiB基因突變的原因。

3 展 望

德拉馬尼和PA-824同屬硝基咪唑類抗結(jié)核藥物，對MDR-TB以及XDR-TB有較好的治療前景，但目前研究表明，德拉馬尼和PA-824的耐藥相關(guān)基因突變卻存在差異。目前報(bào)道的與MTB對德拉馬尼耐藥相關(guān)的基因包括ddn、fgd1、fbiA、fbiB以及fbiC；而與MTB對PA-824耐藥相關(guān)的基因包括ddn、fgd1、fbiA、fbiB、fbiC以及fbiD，且突變位點(diǎn)比較分散。fbiD基因突變與PA-824的高水平耐藥相關(guān)，但卻并未表現(xiàn)出對德拉馬尼的耐藥。而fbiB基因突變是否與德拉馬尼耐藥相關(guān)還需要進(jìn)一步的研究。雖然德拉馬尼和PA-824耐藥相關(guān)基因存在重疊，但突變位點(diǎn)卻不盡相同。另外，對德拉馬尼耐藥MTB菌株的相關(guān)研究中均為臨床分離菌株，而PA-824由于臨床應(yīng)用較少，其耐藥相關(guān)菌株多是體外誘導(dǎo)。因此，在對德拉馬尼和PA-824的耐藥快速檢測的相關(guān)研究中，應(yīng)注意耐藥相關(guān)基因突變位點(diǎn)分布的差異性。綜上所述，本文對德拉馬尼和PA-824耐藥相關(guān)基因的突變情況進(jìn)行了詳細(xì)的分析，為進(jìn)一步研究德拉馬尼和PA-824耐藥相關(guān)機(jī)制以及開發(fā)新的耐藥快速檢測方法提供了理論參考。

利益沖突：無

引用本文格式：王曉英，羅明，李俊剛，等. 結(jié)核分枝桿菌德拉馬尼和PA-824耐藥相關(guān)機(jī)制研究進(jìn)展[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(5)：423-427. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.062