結(jié)核分枝桿菌Rv2941蛋白抗原表位集中區(qū)免疫原性研究

范雪亭，欒秀麗，趙秀芹，李馬超，萬(wàn)康林，盧選成，李曉燕，劉海燦

結(jié)核病(Tuberculosis, TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis, Mtb)引起的一種人獸共患病。它仍然是世界上傳染病中致命的主要原因之一，對(duì)人類健康造成巨大威脅[1-2]。據(jù)估計(jì)，全世界約1/4的人感染過結(jié)核，每年約150萬(wàn)人死于結(jié)核病[3]。隨著耐藥結(jié)核菌感染以及HIV合并感染的出現(xiàn)，使得結(jié)核病的防治面臨更加嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。

目前，預(yù)防和控制傳染病最有效的方法是有效疫苗的預(yù)防接種?？ń槊?Bacillus Calmette Guérin，BCG)仍然是唯一批準(zhǔn)用于人預(yù)防結(jié)核病的疫苗。有研究結(jié)果顯示，接種BCG可以有效預(yù)防兒童結(jié)核病，同時(shí)也可以為麻風(fēng)病患者提供結(jié)核病保護(hù)[4-5]。BCG的保護(hù)效果可以持續(xù)5～10年，可能更長(zhǎng)。但是，BCG對(duì)于預(yù)防成人結(jié)核分枝桿菌的感染以及結(jié)核病復(fù)發(fā)的效果具有較大差異，從0～80%不等[6-8]，以致認(rèn)為無保護(hù)效果。因此，新型結(jié)核病疫苗及其免疫策略的研發(fā)變得十分迫切。國(guó)內(nèi)外大量的研究者致力于尋找更為有效的結(jié)核病疫苗，主要包括以下幾種類型：①活菌疫苗，主要有重組BCG和結(jié)核分枝桿菌減毒活疫苗；②亞單位疫苗，主要有病毒載體疫苗、蛋白疫苗等；③滅活疫苗等。

Rv2941又名fadD28，屬于結(jié)核分枝桿菌脂肪酰基AMP連接酶(fatty-acyl AMP ligase，F(xiàn)AAL)家族蛋白，與結(jié)核分枝桿菌毒力相關(guān)[9]。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于該抗原的研究較少，對(duì)其生物學(xué)功能了解較少。本研究將Rv2941的T細(xì)胞表位集中區(qū)(命名為Rv2941p)在大腸桿菌中表達(dá)，同時(shí)與佐劑PolyI:C和DDA混合免疫BALB/c小鼠，評(píng)價(jià)其免疫原性，旨在為篩選新型結(jié)核病疫苗優(yōu)勢(shì)候選抗原提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒 本實(shí)驗(yàn)中所用的大腸桿菌菌株DH5α和BL21(DE3)感受態(tài)購(gòu)買自北京全式金生物技術(shù)有限公司，所用載體pET32a由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物為6～8周齡SPF級(jí)BALB/c購(gòu)買自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均在中國(guó)疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心完成。

1.3 培養(yǎng)基及主要試劑 大腸桿菌使用LB培養(yǎng)基(1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉，固體培養(yǎng)基中添加1.5%～2%瓊脂粉)培養(yǎng)。蛋白純化所用Ni-NTA填料購(gòu)買自GE Healthcare公司；HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(IgG、IgG1、IgG2a)購(gòu)買自Biotech公司；淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)買自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司；蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑(GolgiPlugTM Brefeldin A)、FITC標(biāo)記的抗CD3抗體、BV421標(biāo)記的抗CD4抗體、APC-Cy7標(biāo)記的抗CD8抗體、PE-CF594標(biāo)記的抗IL-4抗體、PE-Cy7標(biāo)記的抗IFN-γ抗體以及BV650標(biāo)記的抗TNF-α抗體均購(gòu)自BD公司；免疫佐劑DDA和PolyI:C購(gòu)買自Sigma公司。

1.4 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 利用IEDB檢索結(jié)核分枝桿菌Rv2941(NCBI Gene ID：887454)基因T細(xì)胞表位集中區(qū)，選取表位集中區(qū)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。該段基因由生工生物合成連接至pET32a載體，命名為pET32a-2941p，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.5 重組蛋白的表達(dá)與純化 將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒pET32a-2941p轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中。挑取單克隆于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)過夜后，按照1∶1 000的比例轉(zhuǎn)接至300 mL培養(yǎng)基中，當(dāng)培養(yǎng)液OD值到達(dá)0.6～0.8時(shí)，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside, IPTG), 37 ℃震蕩培養(yǎng)4 h。

將培養(yǎng)后菌液4 000 r/min 離心10 min收集菌體。將菌體用普通裂解液(10 mmol/L pH8.0 Tris-HCl，10% TritonX-100)重懸后，超聲破碎10 min后12 000 r/min離心10 min。離心后上清用Ni親和層析純化，具體操作如下：上清中加入終濃度為500 mmol/L的NaCl后上樣于處理后的Chelating Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)中，待上樣完成后分別用含有30 mmol/L、60 mmol/L以及300 mmol/L咪唑的平衡液洗脫，洗脫液用SDS-PAGE電泳分析。將純化后的抗原利用BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 動(dòng)物免疫及抗體檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)6～8周齡的BALB/c 雌性小鼠，隨機(jī)將20只小鼠分成4組，每組5只小鼠，分別為PBS對(duì)照組、單獨(dú)佐劑組、Rv2941p混合佐劑組以及陽(yáng)性對(duì)照組(Ag85B混合佐劑)，具體分組見表1。本研究選用DDA以及PolyI:C作為免疫佐劑，使用方法為抗原與佐劑按照體積1∶1混勻后乳化，經(jīng)皮下多點(diǎn)免疫方式免疫3次，間隔周期為10 d。

表1 小鼠免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.1 Experimetal design of mice immunization

在每次免疫前以及最后一次免疫后1周通過眼眶采血，將收集的血液在37 ℃靜置2 h，4 000 r/min離心10 min，收集血清，放于-20 ℃保存。利用ELISA法檢測(cè)血清中抗原特異性IgG抗體以及IgG亞型抗體滴度。

1.7 ELISA法檢測(cè)淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子分泌水平 末次免疫后1周處死小鼠，取脾臟按照達(dá)科為淋巴細(xì)胞分離液說明書分離淋巴細(xì)胞，然后測(cè)定淋巴細(xì)胞濃度，將部分細(xì)胞濃度調(diào)整至2×105個(gè)細(xì)胞/mL，置于24孔板中，每孔500 μL，加入刺激抗原，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清用于細(xì)胞因子檢測(cè)。ELISA法測(cè)定細(xì)胞因子使用BD公司生產(chǎn)小鼠細(xì)胞因子檢測(cè)試劑盒，檢測(cè)方法按照說明書進(jìn)行。本研究主要檢測(cè)IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6。

1.8 流式細(xì)胞儀分析小鼠CD4+T、CD8+T細(xì)胞增殖及胞內(nèi)細(xì)胞因子表達(dá) 將分離淋巴細(xì)胞調(diào)整濃度至2×106～3×106個(gè)細(xì)胞/mL，置于96孔板中，每孔100 μL細(xì)胞，加入蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)抑制劑以及刺激抗原，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h后收集培養(yǎng)細(xì)胞。用50 μL Staining Buffer重懸細(xì)胞，然后加入7-ADD、CD3、CD4以及CD8抗體，4 ℃孵育30 min，用Staining Buffer清洗細(xì)胞2次。然后利用BD公司的固定破膜試劑盒將細(xì)胞進(jìn)行破膜，破膜后加入IFN-γ、IL-4以及TNF-α抗體，4 ℃孵育30 min，然后Perm/WashTMbuffer清洗兩次，用50 μL Staining Buffer重懸細(xì)胞后加入250 μL 4%多聚甲醛溶液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prim 5.0 中的Tukey的多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 Rv2941基因T表位預(yù)測(cè)結(jié)果 利用IEDB數(shù)據(jù)庫(kù)分析后，結(jié)果如圖1。根據(jù)分析結(jié)果顯示，Rv2941的氨基酸第220位至第340位存在7個(gè)表位區(qū)(F004-F010)，占總表位數(shù)目的50%，同時(shí)考慮表位結(jié)構(gòu)的完整性，因此，選擇核苷酸第649～1 017 bp即氨基酸第216位至第339位用于后續(xù)重組表達(dá)載體構(gòu)建。

圖1 Rv2941基因T表位預(yù)測(cè)結(jié)果Fig.1 T cell epitopes prediction of Rv2941

2.2 重組蛋白的表達(dá)與純化 重組質(zhì)粒pET32a-2941p由生工生物(上海)合成后，將質(zhì)粒交由北京擎科生物科技有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果比對(duì)正確，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在0.1 mmol/L IPTG，37 ℃誘導(dǎo)4 h后收集菌體，超聲破碎離心，SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示在超聲上清樣品34 kDa處有明顯的表達(dá)帶，與目的蛋白大小一致，即該抗原在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中呈可溶性表達(dá)(圖2A)。利用His親和層析純化處理的超聲上清，電泳結(jié)果發(fā)現(xiàn)目的蛋白主要存在于300 mmol/L 咪唑洗脫液中，純化后的目的蛋白純度達(dá)98.89%(圖2B)，將蛋白分裝于-20 ℃保存以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

A：Rv2941p小量表達(dá)(M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1：陰性對(duì)照；2：全菌；3：沉淀；4：上清)；B：純化后蛋白(M：蛋白標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量；1：洗脫目的蛋白)圖2 Rv2941p蛋白表達(dá)純化Fig.2 Expression and purification of Rv2941p

2.3 小鼠體內(nèi)特異性抗體檢測(cè) BALB/c小鼠第3次免疫后1周，利用ELISA法檢測(cè)血清中特異性IgG抗體滴度。結(jié)果顯示Rv2941p聯(lián)合佐劑使用后與單獨(dú)佐劑組以及PBS組間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，即該蛋白作為抗原免疫小鼠，能產(chǎn)生高滴度的特異性抗體(圖3A)。然而，與Ag85B組相比， Rv2941p免疫小鼠產(chǎn)生的特異性抗體滴度較低，兩者間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.4 Rv2941p促進(jìn)IgG2a抗體分化 處死前小鼠血清檢測(cè)IgG1和IgG2a抗體滴度，結(jié)果顯示Rv2941p和Ag85B都提高了IgG2a/IgG1比值，且Rv2941p比Ag85B高(圖3B)。

A：IgG抗體滴度；B：IgG亞型抗體滴度；①：P<0.01; ②：P<0.001圖3 體液免疫反應(yīng)Fig.3 Humoral response

2.5 Rv2941p誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)類型 為進(jìn)一步評(píng)估Rv2941p作為疫苗候選抗原誘導(dǎo)的細(xì)胞免疫反應(yīng)類型，本研究利用ELISA法檢測(cè)免疫48 h后小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分泌IFN-γ、IL-4、IL-2以及IL-6的水平。結(jié)果顯示，與佐劑組相比，Rv2941p顯著提高了IFN-γ的分泌，高達(dá)620 pg/mL，且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=5.193,P<0.001)。同時(shí)比Ag85B組(480 pg/mL)也顯著提高(F=1.152,P<0.001)(圖4A)。此外，與其他各組相比，免疫Rv2941p后顯著提高了IL-6細(xì)胞因子的分泌，高達(dá)2 600 pg/mL，是Ag85B的10倍(F=2.408，P<0.001)(圖4D)。而IL-2和IL-4各組分泌都較低(圖4B和4C)。同時(shí)，本研究利用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)淋巴細(xì)胞內(nèi)IFN-γ、IL-4和TNF-α的分泌水平。與其他組相比，免疫Rv2941p后T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ的表達(dá)明顯提高(F=1.377，P<0.05)(圖5B)。免疫Ag85B和Rv2941p后，都提高了T細(xì)胞內(nèi)TNF-α的表達(dá)，且兩組的表達(dá)水平幾乎一致(圖5B)。顯示Rv2941p誘導(dǎo)更強(qiáng)的Th-1類免疫反應(yīng)。

A：IFN-γ分泌水平；B：IL-4分泌水平；C：IL-2分泌水平；D：IL-6分泌水平；①：P<0.05; ②：P<0.01; ③：P<0.001圖4 小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞中細(xì)胞因子分泌水平Fig.4 Representative cytokine production in mouse spleen T cells after immunization

2.6 Rv2941p促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖 流式細(xì)胞技術(shù)分析免疫后小鼠脾臟T淋巴細(xì)胞內(nèi)CD4+和CD8+細(xì)胞增殖分化情況。結(jié)果顯示，Rv2941p和Ag85B都提高了CD4+T和CD8+T細(xì)胞的比例(圖5A)。Rv2941p中CD4+T細(xì)胞比例比Ag85B中略低，而CD8+T細(xì)胞則比較高。

①：P<0.05圖5 T細(xì)胞增殖(A)及胞內(nèi)細(xì)胞因子(B)表達(dá)情況Fig.5 Proliferation and cytokine profiles of T cells after immunization

3 討 論

盡管目前廣泛采用了標(biāo)準(zhǔn)藥物治療方案，現(xiàn)代診斷方法和疫苗(卡介苗)，但是全球結(jié)核病的流行仍未得到充分的控制，因此，研發(fā)新型安全有效的結(jié)核病疫苗迫在眉睫。而不管是亞單位疫苗還是重組BCG疫苗，篩選有效的抗原尤為關(guān)鍵。據(jù)研究報(bào)道，迄今為止，只有7%的結(jié)核分枝桿菌抗原能夠激活T細(xì)胞反應(yīng)[10]。因此，在剩余的結(jié)核分枝桿菌抗原中篩選更多的免疫顯性T細(xì)胞表位至關(guān)重要。Rv2941是一種參與調(diào)控Mtb細(xì)胞壁脂質(zhì)形成的基因，而這種脂質(zhì)在致病Mtb逃避宿主的防御能力發(fā)揮重要作用[11]，但是對(duì)于該抗原的免疫原性未見報(bào)道，關(guān)于其T細(xì)胞表位區(qū)更是鮮有報(bào)道。因此，我們利用免疫表位數(shù)據(jù)庫(kù)(IEDB，https://www.iedb.org/)分析抗原Rv2941的T細(xì)胞表位區(qū)，根據(jù)分析結(jié)果選擇位于第649～1 017 bp的T細(xì)胞表位集中區(qū)進(jìn)行免疫原性分析。

結(jié)核分枝桿菌是一種胞內(nèi)寄生菌，寄生在特殊的囊泡和結(jié)核分枝桿菌吞噬體，因此，T細(xì)胞免疫對(duì)結(jié)核免疫至關(guān)重要，尤其是Th-1類免疫反應(yīng)[12]。IgG1和IgG2a分別是代表Th-2和Th-1型反應(yīng)的重要生物標(biāo)志物[13]。本研究發(fā)現(xiàn)Rv2941p可以促進(jìn)IgG2a的分化，提高IgG2a/IgG1的比值，這一結(jié)果表明Rv2941p傾向于刺激機(jī)體Th-1類免疫反應(yīng)。此外，本研究中還檢測(cè)了Th-1類細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2，結(jié)果顯示免疫Rv2941p后，小鼠脾臟淋巴細(xì)胞IFN-γ和IL-2的分泌顯著提高，尤其是IFN-γ，這一數(shù)據(jù)也表明Rv2941p可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的Th-1類免疫反應(yīng)。

在結(jié)核分枝桿菌感染中，IL-6是激活分泌IFN-γ的T細(xì)胞的關(guān)鍵，同時(shí)是一種主要的誘導(dǎo)保護(hù)性T細(xì)胞的分子，加強(qiáng)IFN-γ的作用[14]。本研究證實(shí)Rv2941p可以明顯促進(jìn)T淋巴細(xì)胞分泌IL-6細(xì)胞因子，高達(dá)2 600 pg/mL(圖4D)，這一結(jié)果為Rv2941p可以作為結(jié)核病新型疫苗候選抗原提供依據(jù)。

在小鼠感染模型研究中證實(shí)CD4+T和CD8+T細(xì)胞在抗結(jié)核免疫中發(fā)揮關(guān)鍵作用。CD4+T細(xì)胞可以與感染Mtb的巨噬細(xì)胞相互作用，通過分泌細(xì)胞因子(如IFN-γ等)限制結(jié)核分枝桿菌在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制。同時(shí)，CD8+T細(xì)胞分泌穿孔素裂解Mtb感染的巨噬細(xì)胞和直接殺死細(xì)胞內(nèi)Mtb[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，Rv2941的T細(xì)胞表位區(qū)(Rv2941p)顯著提高了CD4+和CD8+T細(xì)胞的增殖分化(圖5A)。另外，有研究證實(shí)，IFN-γ、TNF-α、IL-12以及IL-17的表達(dá)是對(duì)抗結(jié)核的保護(hù)性免疫的重要指標(biāo)，特別是對(duì)高毒性結(jié)核分枝桿菌譜系[16]。本研究利用流式細(xì)胞技術(shù)發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞胞內(nèi)CD4+T細(xì)胞內(nèi)IFN-γ和TNF-α的表達(dá)水平較高(圖5B)，IFN-γ和TNF-α屬于Th-1類細(xì)胞因子，這一結(jié)果表明Rv2941p可以加強(qiáng)CD4+Th-1類免疫反應(yīng)。同時(shí)，從人類疾病和實(shí)驗(yàn)小鼠模型中可以明顯看出，結(jié)核分枝桿菌特異性CD4+和CD8+T細(xì)胞產(chǎn)生的IFN-γ和TNF-α都是控制結(jié)核分枝桿菌感染的基礎(chǔ)[17]。這些結(jié)果都提示Rv2941p的T細(xì)胞表位區(qū)可能是潛在結(jié)核病疫苗抗原。

B細(xì)胞在介導(dǎo)結(jié)核病疫苗效力方面的作用也在逐漸凸顯，但是尚未完全了解其具體功能。在動(dòng)物模型和人類感染的相關(guān)研究已經(jīng)提供了明確的證據(jù)，即增殖的抗原特異性B細(xì)胞定殖于保護(hù)性肉芽腫內(nèi)，這些肉芽腫是高度特殊化的空間結(jié)構(gòu)，可以控制Mtb的進(jìn)一步感染[18]。因此，除了T細(xì)胞外，B細(xì)胞有可能也參與疫苗誘導(dǎo)有效的抗結(jié)核病免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。本研究也證實(shí)Rv2941p可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的IgG抗體，這一結(jié)果表明它可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的體液免疫反應(yīng)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)Rv2941的T細(xì)胞表位區(qū)核苷酸第649～1 017 bp具有較強(qiáng)的免疫原性，可以刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的Th-1類免疫反應(yīng)，可以作為結(jié)核病新型疫苗的候選抗原之一。

利益沖突：無

引用本文格式：范雪亭，欒秀麗，趙秀芹，等. 結(jié)核分枝桿菌Rv2941蛋白抗原表位集中區(qū)免疫原性研究[J]. 中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2022，38(5)：394-399. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.061