結核分枝桿菌EsxV亞單位疫苗黏膜免疫誘導的免疫應答

白 鷺，寧喚喚，康 健，梁 璇，謝燕玲，彭鈺君，張婧瑤，路延之，柏銀蘭

結核病(Tuberculosis，TB)是由結核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，Mtb)經呼吸道感染引起的危害嚴重的慢性傳染病。據(jù)WHO最新報道，2020年全球新發(fā)TB病例為1 000萬，引起約140萬人死亡[1]?？ń槊?BacillusCalmette-Guerin，BCG)是牛分枝桿菌連續(xù)傳代后獲得的減毒活疫苗，是惟一獲得批準的TB預防性疫苗。但是接種BCG對成人TB的保護作用不完善[2]。此外，BCG是減毒活疫苗，在免疫低下人群接種可能造成播散性感染。因此，研發(fā)安全、有效的疫苗是TB防治領域的重要內容。

BCG在基因傳代中發(fā)生一些基因丟失，丟失的基因片段稱為差異區(qū)域(Region of difference，RD)[3]。RD區(qū)編碼的免疫優(yōu)勢抗原丟失被認為是BCG保護作用不完善的主要原因之一[4]。如RD1區(qū)Rv3875編碼的6 kDa早期分泌靶抗原(6 kDa early secretory antigen target，ESAT-6)具有多個T、B細胞以及遲發(fā)型超敏反應的抗原表位，可誘導特異性體液免疫，刺激T細胞產生IFN-γ[5]。ESAT-6是WXG100蛋白家族中第一個發(fā)現(xiàn)的蛋白[6]，WXG100蛋白家族一般由約100個氨基酸組成，區(qū)域中心含有保守的Trp-X-Gly(WXG)基序，共有23個成員(EsxA-EsxW)。WXG100家族蛋白的編碼基因大多位于ESAT-6分泌系統(tǒng)(ESAT-6 secretion system，ESX)的基因座上，是Mtb特有的VII型分泌系統(tǒng)(type VII secretion system，T7SS)典型的分泌底物。WXG100蛋白家族不僅參與Mtb致病機制，而且大多數(shù)是可誘導T細胞免疫應答的抗原[7]。

Rv3619c基因編碼的WXG100蛋白家族EsxV是一種分泌蛋白，位于RD9區(qū)[8]，也是Mtb和BCG之間的差異蛋白。研究表明，EsxV重組蛋白經肌肉免疫兔，可誘導機體產生抗體[9]。EsxV經皮下接種可誘導小鼠Th1型細胞免疫應答[8]。由脂質體包裹EsxV制備的納米疫苗經皮下接種小鼠，可刺激產生Th1型細胞免疫應答，且能夠誘導長效的免疫記憶，接種后可降低Mtb感染小鼠臟器的荷菌數(shù)[10]。EsxV皮下免疫豚鼠，Mtb感染后可引發(fā)遲發(fā)型超敏反應，表明其可用于診斷試劑的研制[11]。因此，EsxV免疫可誘導宿主抗Mtb感染的免疫力，可用于TB新疫苗的研制。

Mtb主要經呼吸道傳播，所以黏膜免疫在抵抗Mtb感染中發(fā)揮重要作用[12]。細菌第二信號分子環(huán)二腺苷酸(Cyclic dimeric adenosine monophosphate，c-di-AMP)能夠激活I型IFN[13]、自噬、炎癥小體[14-15]等多種固有免疫調控機制。同時，c-di-AMP可作為黏膜佐劑，增強抗原誘導的細胞免疫應答[16]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，c-di-AMP作為黏膜佐劑，可顯著提高ESAT-6誘導的免疫應答水平[17]。表明c-di-AMP可作為黏膜佐劑用于亞單位疫苗的研制。本研究在原核表達系統(tǒng)中誘導表達并純化EsxV重組蛋白，以EsxV和/或以c-di-AMP為佐劑構建亞單位疫苗，對EsxV為基礎的亞單位疫苗黏膜免疫小鼠誘導的體液和細胞免疫應答進行了研究。本研究將為EsxV用于TB疫苗的研制提供一定的理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑 分子生物學試劑：DNA聚合酶、限制性內切酶均購自Takara公司，PCR回收試劑盒、質粒提取試劑盒、凝膠回收試劑盒購自Axygen公司。Ni Sepharose購自GE公司；BCA蛋白定量試劑盒購自Thermo公司；PVDF膜購自Millipore公司；異丙基β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl beta-D-thiogalactoside，IPTG)購自Sigma公司；Total RNA Kit I試劑盒購自OMEGA公司；HiScript II Q RT SuperMix for qPCR試劑盒購自Vazyme公司。

免疫學試劑：6×His單克隆抗體購自Abcam公司；Mtb H37Rv小鼠感染血清為本室制備保存；HRP標記的山羊抗小鼠IgG、IgG 1、IgG 2a、IgG 2b和IgG 3購自北京中杉金橋生物技術有限公司；ECL發(fā)光液購自Selleck公司；c-di-AMP購自InvivoGen公司；細胞增殖MTS檢測試劑盒購自Promega公司；小鼠細胞因子檢測試劑盒購自Invitrogen公司。

1.2 菌株與實驗動物 大腸桿菌(Escherichiacoli，E.coli)DH5α、BL21菌株為本室保存。6～8周齡雌性無特定病原體(Specific pathogen free，SPF)BALB/c小鼠，購自空軍軍醫(yī)大學實驗動物中心。實驗動物使用3R原則給予人道關懷。實驗操作根據(jù)《實驗動物飼養(yǎng)管理與使用指南》的建議進行。

1.3 方 法

1.3.1 引物設計及目的基因獲取 從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫獲取Mtb H37Rv株的esxV編碼序列，設計一步克隆法引物序列，由擎科生物科技有限公司合成引物(表 1)。以Mtb H37Rv株DNA為模板，PCR擴增目的基因esxV。1%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，回收目的基因片段。

表1 PCR引物序列Tab.1 Primer sequences for PCR

1.3.2 原核表達載體的構建 pET 28a(+)質粒以NdeI/Hind III酶切，37 ℃反應3 h。1%核酸電泳后回收線性化載體。線性化pET 28a(+)和純化的PCR產物進行重組反應，37 ℃ 30 min。重組產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，用含25 μg/mL卡那霉素(Kan)的抗性LB平板篩選轉化子。挑取陽性克隆接種于液體培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，提取重組質粒。NdeI/Hind III酶切鑒定陽性質粒進一步序列測定(擎科生物)。

1.3.3 EsxV的誘導表達及鑒定 將測序正確的重組質粒轉化E.coliBL21菌株，挑取陽性克隆于含25 mg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)16 h，按照1∶1 000的比例將細菌培養(yǎng)物轉接至5 mL新鮮培養(yǎng)基中，37 ℃、220 r/min震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。制備誘導菌蛋白樣品，15% SDS-PAGE電泳觀察目的蛋白的表達情況。

菌體蛋白樣品SDS-PAGE電泳后，100 V電壓轉印PVDF膜；PBST洗膜后，加入5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入6×His單克隆抗體(1∶500)和Mtb H37Rv小鼠感染血清(1∶500)4 ℃孵育過夜；PBST洗膜后，加入HRP標記的山羊抗鼠IgG(1∶5 000)37 ℃孵育45 min；PBST洗膜后，ECL化學發(fā)光法顯色，觀察蛋白表達。

1.3.4 EsxV的大量純化 重組菌大量誘導表達，采用Ni-NTA agarose親和層析法純化目的蛋白。用50 mL的Lysis buffer(40 mmol/L NaPO4，0.5 mol/L NaCl，0.5% Trtion-X 100，0.5 mg/mL Lysozyme，1 mmol/L PMSF，pH8.0)重懸菌體沉淀，室溫搖床孵育1 h，冰浴下超聲10 min，5 s ON，10 s OFF。12 000 r/min 4 ℃離心30 min，將上清移入Binding buffer(40 mmol/L NaPO4，0.5 mol/L NaCl，10 mmol/L imidazole，pH8.0)平衡后的純化Ni-NTA agarose柱中，4 ℃旋轉儀上結合2 h，分別以50 mL Binding buffer和Wash buffer(40 mmol/L NaPO4，0.5 mol/L NaCl，50 mmol/L imidazole，pH8.0)洗滌。Elution buffer(40 mmol/L NaPO4，0.5 mol/L NaCl，250 mmol/L imidazole，pH8.0)分段洗脫，分別流出液于1.5 mL EP管。收集包含目的蛋白的洗脫液以尿素梯度PBS透析，最后在10%甘油+PBS緩沖液透析30 min，分裝后-80 ℃保存。

在本實驗教學中，教師先創(chuàng)設情境，展示過氧化氫溶液，提出問題：“在哪些條件下可以加快過氧化氫分解？”以問題引導學生回憶其分解過程，調動已有知識基礎，思考、分析并得出結論：過氧化氫在加熱、加入催化劑FeCl3溶液和過氧化酶時均能加快分解，且不同條件下分解速率不同。由此明確實驗課題——比較過氧化氫在不同條件下的分解速率。

1.3.5 動物免疫 6～8周齡SPF級雌性BALB/c小鼠20只，隨機分成4組，即正常對照組(Na?ve)、佐劑組(c-di-AMP)、蛋白組(EsxV)、聯(lián)合免疫組(EsxV:c-di-AMP)。各組小鼠分別滴鼻給予50 μL/只的PBS、c-di-AMP 5 μg、EsxV 30 μg、EsxV 30 μg+c-di-AMP 5 μg，間隔2周，免疫4次。第3和第4次免疫EsxV蛋白劑量減半，佐劑劑量不變。

1.3.6 小鼠血清抗體及亞類檢測 免疫完成6周后，取小鼠眼靜脈血，分離血清。用10 μg/mL的EsxV抗原包被96孔ELISA酶標板，分別加入經倍比稀釋的小鼠血清，37 ℃孵育1 h；PBST洗滌，分別加入HRP標記的山羊抗小鼠IgG、IgA、IgG 1、IgG 2a、IgG 2b、IgG 3、IgM二抗(1∶5 000)100 μL/孔，37 ℃孵育1 h；TMB顯色，酶標儀檢測OD450值。

1.3.7 小鼠脾細胞增殖檢測 處死小鼠，無菌取脾臟，制備脾細胞懸液，調整濃度至1×107個/mL，接種96孔板100 μL/孔；刺激組加入去除內毒素的EsxV蛋白或者ConA終濃度分別為5 μg/mL和2.5 μg/mL，陰性對照孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，并設置空白對照孔。置細胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)68 h后，加入MTS 20 μL/孔，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，檢測OD490值，計算脾細胞刺激指數(shù)(Stimulated Index，SI)=OD490(刺激組OD490-空白對照OD490)/(陰性對照OD490-空白對照OD490)。

1.3.8 組織RNA的提取及實時定量PCR 取小鼠肺臟和脾臟部分組織，Total RNA Kit I試劑盒提取組織RNA。使用HiScript II Q RT SuperMix for qPCR試劑進行逆轉錄，實時定量PCR檢測IFN-γ、IL-2、IL-10轉錄水平，以GAPDH作為內參。檢測基因引物序列見表1。

1.3.9 脾細胞分泌細胞因子檢測 取1.3.7中的脾細胞懸液，接種96孔板為1×106個/100 μL/孔，刺激組加入去除內毒素的EsxV蛋白至終濃度5 μg/mL，陰性對照孔加入100 μL完全培養(yǎng)基，并設置空白對照孔。培養(yǎng)72 h，收集細胞培養(yǎng)上清。按照ELISA試劑盒說明書，檢測小鼠脾細胞上清中細胞因子IFN-γ、IL-2、IL-10、IL-17的含量。

2 結 果

2.1 載體構建esxV基因大小為285 bp，PCR擴增出與目的片段大小一致的特異條帶(圖1A)。將目的基因亞克隆入pET28a(+)載體，重組質粒NdeI/Hind III酶切鑒定結果顯示，可切出esxV片段大小一致條帶(圖1B)。測序結果表明，插入序列與Mtb H37Rv株esxV公布序列完全一致。表明pET28a(+)-esxV原核表達載體建成功。

A：esxV的PCR擴增； B：重組載體酶切鑒定； M：marker；1：pET28a(+)-esxV圖1 原核表達載體構建Fig.1 Construction of the prokaryotic expression vector

A: EsxV蛋白誘導表達；B: Western Blot鑒定EsxV蛋白(一抗為6xHis單克隆抗體)；C: Western Blot鑒定EsxV蛋白(一抗為H37Rv感染小鼠血清)；D: EsxV蛋白親和層析純化圖2 EsxV蛋白的表達與純化Fig.2 Expression and purification of EsxV

2.3 小鼠血清抗體檢測 ELISA檢測血清中特異性抗體水平，結果顯示EsxV免疫小鼠血清中抗原特異性IgG的滴度為1.6×103(稀釋度為1∶1 600)，EsxV:c-di-AMP免疫組特異性IgG滴度為3.2×103(稀釋度為1∶3 200)(圖3A)。表明EsxV抗原經黏膜免疫可誘導特異性抗體的產生，c-di-AMP作為佐劑可一定程度上提高抗原免疫誘導的體液免疫應答。小鼠血清抗體以IgG為主(圖3B)，同時抗體亞類檢測結果表明，在1∶200稀釋度下，EsxV誘導產生的抗體以IgG 1為主(圖3C)，EsxV一定程度上抑制IgM水平。

A：抗體效價檢測；B：抗體亞類檢測(小鼠血清1∶200稀釋)；C：IgG亞類檢測(小鼠血清1∶200稀釋)；與對照組比較，①為P<0.05,②為P<0.01,③為P<0.001；④為P<0.05，⑤為P<0.01圖3 體液免疫應答水平和抗體亞類檢測Fig.3 Humoral immune response level and antibody subclass detection

2.4 小鼠脾細胞增殖檢測 免疫小鼠脾細胞以ConA、EsxV體外刺激后，MTS法檢測細胞增殖情況，結果表明，非特異性抗原ConA可刺激所有組免疫小鼠脾細胞增殖，各組間差異無統(tǒng)計學意義(圖4A)。與對照組比較，EsxV免疫小鼠后脾細胞增殖呈增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(t=2.243,P>0.05)；EsxV:c-di-AMP免疫小鼠脾細胞增殖顯著(t=6.743，P<0.001)(圖4B)。表明c-di-AMP可增強EsxV經黏膜免疫誘導抗原特異性的脾細胞增殖能力。

A：ConA蛋白刺激脾細胞；B：EsxV蛋白刺激脾細胞；與對照組比較，①為P<0.001圖4 免疫小鼠脾細胞增殖Fig.4 Splenocyte proliferation in immunized mice

2.5 免疫小鼠脾和肺細胞因子轉錄水平檢測 qRT-PCR檢測細胞因子轉錄水平結果顯示，在脾臟，與對照組比較，EsxV免疫組IL-10轉錄水平下降(t=6.422,P<0.01)。EsxV:c-di-AMP免疫組IFN-γ轉錄水平較對照組升高(t=6.359,P<0.01)(圖5A)；在肺部，與對照組比較，EsxV免疫組IFN-γ(t=2.605，P>0.05)、IL-2(t=2.504,P>0.05)轉錄水平差異無統(tǒng)計學意義；IL-10轉錄水平下降(t=3.292，P<0.05)。EsxV:c-di-AMP免疫組IFN-γ轉錄水平較對照組升高(t=7.829，P<0.01)，且高于EsxV免疫組(t=5.627，P<0.05)；IL-2和IL-10轉錄水平與對照組和EsxV免疫組差異無統(tǒng)計學意義(圖5B)。上述結果表明，EsxV免疫誘導脾和肺細胞因子表達水平不高，而c-di-AMP可增強EsxV經黏膜免疫誘導的IFN-γ表達，但對EsxV誘導的IL-2和IL-10水平影響不大。

A：小鼠脾組織IFN-γ、IL-2和IL-10轉錄水平檢測；B：小鼠肺組織IFN-γ、IL-2和IL-10轉錄水平檢測；與對照組比較，①為P<0.05，②為P<0.01；③為P<0.05圖5 小鼠脾和肺細胞因子轉錄水平Fig.5 Cytokine transcription levels in mouse lung and spleen

2.6 脾細胞分泌細胞因子檢測 脾細胞體外抗原刺激后，ELISA法檢測細胞因子的分泌水平。結果顯示，EsxV免疫組各細胞因子的分泌水平與對照組相當。相比于EsxV免疫組，EsxV:c-di-AMP免疫組脾細胞的IFN-γ(t=8.818,P<0.001)、IL-2(t=8.061,P<0.001)、IL-10(t=6.588,P<0.001)和IL-17(t=2.632,P<0.05)分泌水平都增加(圖 6A-D)。結果表明，EsxV經鼻免疫誘導細胞免疫應答的能力不強，而c-di-AMP能夠增強EsxV誘導的脾Th1(IFN-γ、IL-2)、Th2(IL-10)和Th17(IL-17)型細胞免疫應答。炎癥因子分泌水平檢測結果顯示，各組間的TNF-α(F=0.667,P>0.05)、IL-6(F=1.270,P>0.05)分泌水平差異無統(tǒng)計學意義(圖 6E-F)。

注：特異蛋白EsxV刺激小鼠脾細胞后IFN-γ(A)、IL-2(B)、IL-10(C)、IL-17(D)、TNF-α(E)、IL-6(F)的分泌水平。與對照組比較，①為P<0.001；②為P<0.05，③為P<0.001。圖6 小鼠脾細胞的細胞因子分泌水平Fig.6 Cytokine secretion by splenic lymphocytes in immunized mice

3 討 論

亞單位疫苗具有成份明確、安全性良好和誘導高水平的免疫應答等優(yōu)點，是疫苗的重要種類之一。亞單位疫苗可將多個抗原有機組合起來，在適宜的佐劑輔助下誘導高水平抗Mtb感染的免疫應答，且安全性好。增加抗原譜可有效提高亞單位疫苗的保護效率，篩選新的特異性Mtb抗原也是目前TB疫苗研制的重要方向之一。

WXG100蛋白大多具有免疫原性。ESAT-6是目前WXG100蛋白家族中研究最深入的蛋白，多項研究已證實其作為TB疫苗候選抗原的潛能[5]。EsxW、Rv2608以及Mtb潛伏感染蛋白Rv1813的融合蛋白組成的ID83亞單位疫苗與Toll樣受體激動劑聯(lián)合免疫小鼠，可誘導Th1型細胞免疫應答，并對低劑量Mtb呼吸道感染具有保護力[18]。表達EsxH(Rv0288)與Ag85B的重組BCG免疫小鼠，可誘導Th1 CD4+細胞的增殖并且產生顯著的抗Mtb感染保護力[19]。EsxV經肌肉免疫兔，可誘導特異性的抗體產生[9]。此外，有研究報道，EsxV經黏膜接種能夠預防小鼠哮喘[20]。本研究成功構建并原核表達WXG100家族蛋白Esx，重組EsxV蛋白經鼻黏膜免疫小鼠，血清IgG效價可達到1∶1 600，以IgG 1亞類為主(圖3)。表明重組EsxV蛋白經黏膜免疫，可誘導特異性的體液免疫應答。EsxV蛋白經鼻免疫小鼠，對脾和肺組織的Th1(IFN-γ、IL-2)型細胞因子的轉錄影響不大，但能抑制脾細胞Th2(IL-10)型細胞因子轉錄(圖5)。EsxV蛋白體外刺激免疫小鼠脾細胞，脾細胞增殖并不顯著，而且脾細胞分泌細胞因子水平也無變化。表明EsxV蛋白經鼻黏膜免疫誘導的細胞免疫應答水平并不高。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ESAT-6單獨免疫誘導的體液免疫和細胞免疫應答水平均不高，需要加入佐劑提高ESAT-6 的免疫原性[21]。因此，采用合適的佐劑可提高EsxV誘導的免疫應答水平。

目前，用于臨床的疫苗佐劑有鋁佐劑，主要介導體液免疫，對細胞免疫的誘導效果不佳[22]。研究表明，加強小鼠黏膜免疫水平可提高抗Mtb感染能力[23]。c-di-AMP作為細菌的信號分子，可作為黏膜佐劑，與半乳糖苷聯(lián)合經鼻黏膜接種，能夠誘導小鼠黏膜免疫及Th1/Th2/Th17型細胞免疫應答[16]。c-di-AMP可增強流感抗原誘導的Th1/Th2/Th17和炎癥因子應答[24]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，c-di-AMP作為內源性佐劑能夠增強重組BCG誘導的免疫應答水平[25]。c-di-AMP作為黏膜佐劑與ESAT-6聯(lián)合免疫時，可誘導較高水平的固有和適應性免疫應答，并且具有抗Mtb的保護作用[17]。因此，c-di-AMP可增強Mtb抗原的免疫原性，并可用于黏膜免疫，可用于TB黏膜疫苗佐劑。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，ESAT-6:c-di-AMP免疫組的抗體效價為1∶1 600，高于ESAT-6單獨免疫組的1∶800，同時發(fā)現(xiàn)較ESAT-6免疫組，ESAT-6：c-di-AMP免疫小鼠后可顯著提高肺泡灌洗液中的sIgA水平[17]。本研究中，EsxV:c-di-AMP免疫組特異性IgG抗體效價為1∶3 200，高于EsxV單獨免疫組的1∶1 600。本研究雖未檢測sIgA的水平，但血清IgG水平檢測獲得了與前期結果相似的結論[17]。

在小鼠臟器脾和肺中，c-di-AMP免疫后可誘導IFN-γ、IL-2以及IL-10的轉錄水平增加，表明c-di-AMP可增強機體Th1/Th2的免疫反應。EsxV單獨免疫誘導的脾和肺Th1/Th2細胞因子轉錄水平不高，而EsxV:c-di-AMP經鼻黏膜接種后誘導的細胞因子轉錄水平均低于c-di-AMP免疫組(圖5)。研究表明，c-di-AMP能夠激活干擾素基因刺激分子(stimulator of interferon genes，STING)介導的I型干擾素應答，同時c-di-AMP的持續(xù)刺激能夠引發(fā)鈣蛋白酶對STING的降解[26]。因此，推測c-di-AMP在胞漿內自限性、不連續(xù)的免疫調控機制，限制了其與EsxV抗原聯(lián)合免疫誘導的細胞因子表達水平，這與前期研究ESAT-6:c-di-AMP免疫后小鼠肺組織細胞因子轉錄水平比c-di-AMP單獨免疫組有所降低的結果相似[17]。EsxV:c-di-AMP誘導小鼠脾細胞顯著的Th1/Th2/Th17型細胞免疫應答，但并不能增強炎癥因子(TNF-α、IL-6)的轉錄水平(圖6)，且IL-1β分泌水平均低于檢測下限。表明c-di-AMP不僅可增強EsxV誘導的免疫應答，而且不引起可能的炎癥病理損傷，因此，c-di-AMP作為黏膜免疫佐劑也具有安全性。

綜上，本研究獲得的EsxV:c-di-AMP亞單位疫苗組合免疫小鼠，可誘導體液和細胞免疫應答，可用作TB亞單位新疫苗的研制。本課題組將進一步建立呼吸道感染動物模型，評價EsxV:c-di-AMP亞單位疫苗誘導的黏膜免疫應答，并評價該疫苗對Mtb感染的免疫保護效率。

利益沖突：無

引用本文格式：白鷺，寧喚喚，康健，等. 結核分枝桿菌EsxV亞單位疫苗黏膜免疫誘導的免疫應答[J].中國人獸共患病學報，2022，38(5)：379-386. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2022.00.051