紅鰭東方鲀幼魚(yú)中性別分化相關(guān)基因的表達(dá)分析

姜潔明，沈旭芳，劉 鷹,4，張 琦，周慧婷，王 佳，閆紅偉，王辰奇，劉 奇

( 1.大連海洋大學(xué)，遼寧 大連 116023； 2.設(shè)施漁業(yè)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 大連 116023； 3.遼寧師范大學(xué)，遼寧 大連 116029； 4.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237 )

紅鰭東方鲀(Takifugurubripes)，屬鲀形目、鲀科、東方鲀屬，是一種重要的海水經(jīng)濟(jì)魚(yú)類(lèi)。主要分布于西北太平洋區(qū)，從日本、俄羅斯和韓國(guó)沿海至我國(guó)東海均有分布，其味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受人們青睞。在日本和韓國(guó)，河鲀消費(fèi)市場(chǎng)廣闊，尤以紅鰭東方鲀的消費(fèi)量最大[1]。自2016年起，我國(guó)有條件放開(kāi)養(yǎng)殖紅鰭東方鲀和養(yǎng)殖暗紋東方鲀(T.obscurus)加工經(jīng)營(yíng)，有力地促進(jìn)了國(guó)內(nèi)河鲀產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。

紅鰭東方鲀是雌雄異體魚(yú)類(lèi)，雖然生長(zhǎng)性能沒(méi)有明顯性別差異，但經(jīng)濟(jì)價(jià)值卻有很大差異。一般雄魚(yú)2年性成熟，雌魚(yú)需要3年。在繁殖季節(jié)，紅鰭東方鲀性腺質(zhì)量可占體質(zhì)量的20%～30%，其卵巢含有劇毒無(wú)法食用，但雄魚(yú)的精巢無(wú)毒，且非常美味，我國(guó)稱(chēng)之為“西施乳”，日本稱(chēng)為“白子”，市場(chǎng)售價(jià)高達(dá)1400元/kg。因此，開(kāi)發(fā)全雄育種將促進(jìn)國(guó)內(nèi)河鲀產(chǎn)業(yè)發(fā)展，并會(huì)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)效益[3]。解析出紅鰭東方鲀的性別決定和分化的分子機(jī)制，將為全雄育種提供理論基礎(chǔ)。

紅鰭東方鲀具有XX/XY性別決定系統(tǒng)[4]，其全基因組序列早在2002年就已公布[5]。它被認(rèn)為是重要模式生物，其遺傳性別可由抗繆勒氏激素受體Ⅱ型(amhr2)基因上的一個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)判定[6]，可通過(guò)高分辨率熔解曲線(xiàn)分析(HRM)或直接測(cè)序法檢測(cè)該SNP位點(diǎn)，從而有效判別其性別[7]。前期研究發(fā)現(xiàn)，紅鰭東方鲀(孵化溫度14 ℃，逐漸升溫至24 ℃時(shí))性腺一般在孵化后40 d逐漸出現(xiàn)卵巢腔，55～77 d出現(xiàn)輸精管[8-9]。但由于紅鰭東方鲀繁殖周期較長(zhǎng)，且在發(fā)育早期，性腺微小難以分離，有關(guān)紅鰭東方鲀性別分化的分子機(jī)制研究依然較為匱乏。

前期已分離出紅鰭東方鲀未分化期(40 d)微小性腺組織，采用RNA-seq技術(shù)篩選出大量XX和XY個(gè)體差異表達(dá)基因。其中包括在其他魚(yú)類(lèi)性別決定及分化過(guò)程中也具有重要作用的基因，如doublesex和mab-3相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子1(dmrt1)、性腺體細(xì)胞衍生因子(gsdf)、細(xì)胞色素P450第19家族A亞家族多肽1a(cyp19a1a)和叉頭框蛋白L2(foxl2)基因等[10]。筆者擬在前期研究工作的基礎(chǔ)上，以不同發(fā)育時(shí)期的性腺作為試驗(yàn)對(duì)象，查明上述基因的表達(dá)規(guī)律，以期為后續(xù)解析這些基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅鰭東方鲀魚(yú)卵購(gòu)自大連某養(yǎng)殖廠，魚(yú)卵質(zhì)量150 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 養(yǎng)殖與樣品采集

養(yǎng)殖試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)生物學(xué)重復(fù)，分別將魚(yú)卵置于300 L圓形養(yǎng)殖桶中曝氣孵化。自孵化后第3天開(kāi)始投喂輪蟲(chóng)，第12天開(kāi)始投喂輪蟲(chóng)的同時(shí)添加鹵蟲(chóng)(Artemia)，第23天開(kāi)始同時(shí)投喂配合飼料(海童1號(hào)沉降型飼料，三通生物工程，濰坊)和生物餌料，且配合飼料的投喂比例逐漸增多，生物餌料的投喂比例逐漸減少，第35天至第80天，僅投喂配合飼料。試驗(yàn)期間飽食投喂，日投喂2～4次。日換水2次，每次換水1/2，水中不斷充氣，光照周期為12L∶12D，水溫(19±1) ℃。

在孵化后40、60、80 d，從3個(gè)生物學(xué)重復(fù)中各取30尾幼魚(yú)做組織學(xué)切片，觀察其性腺發(fā)育情況。每個(gè)取樣點(diǎn)取60尾(20尾/桶)，經(jīng)麻醉，解剖出性腺。將每尾紅鰭東方鲀的性腺分別放入裝有100 μL RNAlater動(dòng)物組織RNA穩(wěn)定保存液(Ambion，美國(guó))的離心管中，立即保存在-80 ℃冰箱中，用于RNA提取。同時(shí)，將所采集性腺相對(duì)應(yīng)的每尾紅鰭東方鲀的肌肉組織保存于無(wú)水乙醇中，-20 ℃冰箱保存，用于性別鑒定。

1.2.2 性腺組織學(xué)切片

樣品經(jīng)過(guò)梯度乙醇脫水，二甲苯透明、石蠟包埋，之后連續(xù)切片(5 μm)，37 ℃烘片3 h后室溫下冷卻，然后用二甲苯脫蠟、復(fù)水，再經(jīng)蘇木精—伊紅染色，脫水，二甲苯透明并封片。使用顯微鏡(卡爾蔡司，德國(guó))觀察性腺組織學(xué)結(jié)構(gòu)、拍照[11]。

1.2.3 性別鑒定和RNA提取

用蛋白酶K處理(55 ℃，2 h)紅鰭東方鲀肌肉組織后，用TIANamp海洋動(dòng)物DNA試劑盒(天根，中國(guó))提取基因組DNA。用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量后，為確定amhr2基因第9外顯子上SNP的基因型，使用amhr2基因特異性引物SDexonF(5′-CAGATGCACACAAACCACCT-3′)和SDexonR(5′-TCCCAGTGTTGCGGTATGTA-3′)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增體系(共50 μL)：ddH2O 30.5 μL，10×PCR Buffer 5 μL，dNTP Mix(2.5 mmol/L)8 μL，上、下游引物(10 mol/L)各2 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.5 μL，模板DNA(10倍稀釋后使用)2 μL。PCR流程為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)之后，測(cè)序PCR產(chǎn)物。根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行性別鑒定(圖1)，如果amhr2基因的SNP位點(diǎn)是雜合型，則對(duì)應(yīng)個(gè)體為雄性；如果SNP位點(diǎn)是純合型，則對(duì)應(yīng)個(gè)體是雌性。將每個(gè)養(yǎng)殖桶性別相同的個(gè)體性腺組織混合后作為一個(gè)樣本，分別用于RNA提取，使用RNeasy Mini RNA試劑盒(QIAGEN，德國(guó))提取性腺組織中的總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)其完整性，檢測(cè)其濃度。提取的RNA置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 雄性(a)和雌性(b)紅鰭東方鲀的amhr2質(zhì)譜圖區(qū)別

使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)對(duì)3個(gè)取樣時(shí)期(3個(gè)生物學(xué)重復(fù))的2種遺傳性別的共18個(gè)樣品中的基因表達(dá)進(jìn)行分析，分析的基因?yàn)槲墨I(xiàn)[10]中篩選的在雄性紅鰭東方鲀未分化性腺中2個(gè)雄性高表達(dá)的基因(gsdf、dmrt1)和2個(gè)雌性高表達(dá)的基因(cyp19a1a、foxl2)，以及DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1(dnmt1)和amhr2基因。使用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)引物(表1)。用DNA酶Ⅰ預(yù)處理1 μg RNA(37 ℃，30 min)，然后采用1st Strand cDNA Synthesis 試劑盒，進(jìn)行cDNA的合成。使用β-actin做內(nèi)參基因。使用Applied Biosystems 7900 HT Real-Time PCR System進(jìn)行qRT-PCR。qRT-PCR反應(yīng)體系(10 μL)為：ddH2O 6.15 μL，10×Ex Taq PCR Buffer 1 μL，dNTP Mix (2.5 mmol/L) 0.8 μL，上、下游引物(10 mol/L)各0.5 μL，Ex Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.05 μL，模板cDNA 1 μL。具體步驟為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個(gè)循環(huán)；最后在72 ℃延伸10 min[10,12]。繪制熔融曲線(xiàn)，保證每對(duì)引物都能擴(kuò)增出單一的PCR產(chǎn)物。

表1 試驗(yàn)用引物序列

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析

表達(dá)量的計(jì)算用2-ΔΔCt法處理。采用統(tǒng)計(jì)軟件IBM SPSS 19.0(IBM，美國(guó))中的t檢驗(yàn)分析XX和XY個(gè)體性腺之間的基因表達(dá)量的差異顯著性，使用Duncan′s多重檢驗(yàn)法檢驗(yàn)不同發(fā)育時(shí)期基因表達(dá)的顯著性差異，顯著性設(shè)定為P<0.05。

2 結(jié) 果

2.1 紅鰭東方鲀性腺組織學(xué)觀察

紅鰭東方鲀性腺的組織學(xué)切片見(jiàn)圖2。在孵化后40 d時(shí)，XX和XY個(gè)體未觀察到形態(tài)上的性別分化，所有幼魚(yú)均為未分化的性腺(表2)。孵化后60 d時(shí)，在觀察的30尾魚(yú)中，14尾雌性，16尾雄性，XX個(gè)體的卵巢腔開(kāi)始形成，卵原細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生，XY個(gè)體的性腺為橢圓形或圓形，性腺中開(kāi)始有大量精原細(xì)胞形成；孵化后80 d時(shí)，在觀察的30尾魚(yú)中，18尾雌性，12尾雄性，XX個(gè)體的卵巢內(nèi)能夠清楚地觀察到由卵巢生殖上皮向卵巢腔凸起形成的產(chǎn)卵板和完整的卵巢腔，在產(chǎn)卵板上有大量的卵原細(xì)胞和少量的卵母細(xì)胞，在XY個(gè)體的精巢中，能夠清楚地觀察到完整的精巢結(jié)構(gòu)，精巢由精小囊組成，內(nèi)含精母細(xì)胞或精原細(xì)胞(圖2)。

圖2 孵化后40、60、80 d紅鰭東方鲀性腺組織學(xué)觀察結(jié)果

表2 不同采樣時(shí)期紅鰭東方鲀幼魚(yú)性別比例

2.2 性別分化相關(guān)基因的表達(dá)量

采用qRT-PCR對(duì)XX和XY紅鰭東方鲀幼魚(yú)性腺中amhr2、dmrt1、gsdf、cyp19a1a、foxl2、dnmt1基因的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。孵化后40、60 d，amhr2基因在XX和XY個(gè)體性腺中的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，孵化后80 d，amhr2基因的表達(dá)量顯著上升(P<0.05)，且XX個(gè)體顯著高于XY個(gè)體(P<0.05)(圖3a)。在孵化后40、60、80 d，XY個(gè)體性腺中dmrt1的表達(dá)量均顯著高于XX個(gè)體性腺中的表達(dá)量(P<0.05)，且自孵化后40 d開(kāi)始顯著升高，在XX個(gè)體性腺中，dmrt1基因在孵化后80 d的表達(dá)量也顯著高于在孵化后40、60 d的表達(dá)量，而孵化后40 d與60 d的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)(圖3b)。孵化后40、60、80 d，gsdf基因在XY個(gè)體性腺中的表達(dá)量也均顯著高于在XX個(gè)體性腺中的表達(dá)量(P<0.05)，且自孵化后40 d開(kāi)始，其在XY個(gè)體性腺中表達(dá)量顯著增加。自孵化后60 d開(kāi)始，gsdf基因在XX個(gè)體性腺中表達(dá)量顯著上升(P<0.05)(圖3c)。孵化后40 d開(kāi)始，cyp19a1a基因在XX個(gè)體性腺中的表達(dá)量均顯著高于在XY個(gè)體性腺中的表達(dá)量，但在XX個(gè)體性腺中，孵化后60 d的表達(dá)量顯著低于孵化后40、80 d的表達(dá)量(P<0.05)。在XY個(gè)體性腺中，cyp19a1a基因表達(dá)量從孵化后40 d開(kāi)始逐漸上升，但在整個(gè)采樣期間差異不顯著(P>0.05)(圖3d)；foxl2基因的表達(dá)模式與cyp19a1a基因相同，整個(gè)采樣期間，在XX個(gè)體性腺中的表達(dá)量均顯著在高于XY個(gè)體性腺中的表達(dá)量(P<0.05)，且在XX個(gè)體性腺中，孵化后80 d的表達(dá)量顯著高于40、60 d的表達(dá)量；而在XY個(gè)體性腺中，foxl2基因在整個(gè)取樣時(shí)期的表達(dá)量差異不顯著(圖3e)。孵化后40、60 d，dnmt1基因在XX和XY個(gè)體性腺中的表達(dá)量差異不顯著(P>0.05)，但在孵化后80 d， XY個(gè)體性腺中的表達(dá)顯著高于XX個(gè)體性腺中的表達(dá)量(P<0.05)。同時(shí)，在XX個(gè)體性腺中，dnmt1基因在整個(gè)取樣期間的表達(dá)差異不顯著(P>0.05)(圖3f)。

圖3 孵化后40、60、80 d XX和XY紅鰭東方鲀性腺中amhr2(a)、dmrt1(b)、gsdf(c)、cyp19a1a(d)、foxl2(e)以及dnmt1(f)基因表達(dá)水平

3 討 論

在性別決定和分化這個(gè)復(fù)雜的過(guò)程中，一般認(rèn)為，魚(yú)類(lèi)未分化的性腺最初具有向精巢或卵巢發(fā)育的雙向潛能，當(dāng)性別決定的“總開(kāi)關(guān)”通過(guò)性別決定基因起始后，一類(lèi)保守的性別決定和分化的遺傳網(wǎng)絡(luò)隨之激活，這類(lèi)下游性別相關(guān)基因能調(diào)控性類(lèi)固醇激素的表達(dá)，從而控制著性腺發(fā)育最終分化為一個(gè)有功能的性腺并與性別表型相對(duì)應(yīng)[13]。

3.1 性別決定位點(diǎn)所在基因amhr2基因表達(dá)

哺乳動(dòng)物中有繆勒管結(jié)構(gòu)，其形成是由于雙潛能性腺分化為精巢之后，精巢支持細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生抗繆勒氏激素(amh)抑制繆勒管的形成，抗繆勒氏激素主要通過(guò)amhr2在哺乳動(dòng)物和其他脊椎動(dòng)物生殖器官的發(fā)育和維持中發(fā)揮重要作用。魚(yú)類(lèi)無(wú)繆勒管結(jié)構(gòu)，但是有的魚(yú)類(lèi)性腺中仍然發(fā)現(xiàn)有amh和amhr2基因表達(dá)[14]。Hattori等[15]在研究銀漢魚(yú)(Odonthesteshatcheri)時(shí)發(fā)現(xiàn)，將Y染色體特異性基因(amhy基因)敲除，會(huì)使XY個(gè)體發(fā)生由雄性到雌性的性別逆轉(zhuǎn)，同時(shí)foxl2和cyp19a1a基因表達(dá)上調(diào)。使用CRISPR/Cas9基因敲除技術(shù)對(duì)尼羅羅非魚(yú)(Oreochromisniloticus)進(jìn)行amhr2基因外顯子2和3進(jìn)行突變，會(huì)導(dǎo)致由雄性到雌性的性別逆轉(zhuǎn)[16]。Morinaga等[17]對(duì)XX青鳉(Oryziaslaatipes)進(jìn)行amhr2基因突變，在純合突變體中發(fā)現(xiàn)生殖細(xì)胞過(guò)度增殖導(dǎo)致腹部增大，因此卵巢增大。對(duì)成年魚(yú)的研究結(jié)果顯示，XX和XY突變體均不育，與野生對(duì)照型相比，壽命更短。通過(guò)對(duì)硬骨魚(yú)中amh和amhr2基因突變體的研究，發(fā)現(xiàn)amh通路在生殖細(xì)胞增殖中有重要作用。在硬骨魚(yú)類(lèi)中，amh通路也控制性別，因此，amh在硬骨魚(yú)生殖細(xì)胞發(fā)育中的生物學(xué)功能可能先于繆勒管的形成[18]。Kamiya等[6]在對(duì)紅鰭東方鲀的研究中發(fā)現(xiàn)，amhr2基因中的一個(gè)錯(cuò)義SNP位點(diǎn)突變可能是其主要性別決定的候選基因。在這個(gè)位點(diǎn)(G/C)上，雄性是雜合子，而雌性是純合子，在這個(gè)SNP位點(diǎn)上可以造成一個(gè)氨基酸的突變(His/Asp384)。前期結(jié)果表明，amhr2基因在2～10月齡雌雄紅鰭東方鲀性腺中均有表達(dá)，表達(dá)部位在生殖細(xì)胞周?chē)捏w細(xì)胞中。筆者測(cè)定了紅鰭東方鲀性別分化期雌雄性腺中amhr2基因的表達(dá)量，結(jié)果顯示，amhr2基因的表達(dá)量在孵化后80 d顯著上調(diào)，且卵巢中的表達(dá)量顯著高于精巢中的表達(dá)量(P<0.05)，說(shuō)明amhr2基因不但在精巢分化中起作用，在卵巢形成中可能也起到一定作用。已有研究表明，amh及其受體在魚(yú)類(lèi)性別決定及分化過(guò)程中具有重要的作用[15-18]，檢測(cè)紅鰭東方鲀性腺分子分化關(guān)鍵期amhr2基因的表達(dá)，有助于闡明性別分化早期的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，并為性腺功能相關(guān)基因的研究提供新的信息。后續(xù)還應(yīng)在紅鰭東方鲀研究中采用基因敲除技術(shù)對(duì)amhr2上性別連鎖的SNP位點(diǎn)進(jìn)行突變，驗(yàn)證其在這一物種的功能。

3.2 雄性性別分化相關(guān)基因表達(dá)

Dmrt1基因?yàn)閯?dòng)物界中參與雄性性別決定和精巢分化的保守基因[19]，它被證明是青鳉的性別決定因素[20]。在迄今研究的所有雌雄異體魚(yú)類(lèi)中，dmrt1基因的表達(dá)模式總是與精巢發(fā)生和進(jìn)一步分化密切相關(guān)，與性別決定系統(tǒng)無(wú)關(guān)[19]。Dmrt1基因總是在魚(yú)的精巢中高表達(dá)，在卵巢中低表達(dá)，青鳉中dmrt1基因的突變會(huì)誘導(dǎo)雌雄性別逆轉(zhuǎn)[21]。對(duì)斑馬魚(yú)(Daniorerio)進(jìn)行dmrt1基因突變，結(jié)果表明，XY個(gè)體表現(xiàn)出精巢發(fā)育缺陷和生殖細(xì)胞凋亡[22]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，dmrt1基因在XY個(gè)體性腺中隨著性腺發(fā)育表達(dá)量急劇增加，在孵化后80 d時(shí)表達(dá)量最高，在XX個(gè)體中孵化后80 d的表達(dá)量顯著高于孵化后40、60 d，dmrt1基因在孵化后40、60、80 d XY個(gè)體中的表達(dá)量均顯著高于XX個(gè)體。因此，這一功能基因正如在其他物種中所報(bào)道的那樣，可能在紅鰭東方鲀的精巢分化以及雄性性腺發(fā)育中同樣發(fā)揮著重要作用。然而，本試驗(yàn)結(jié)果與Yamaguchi等[9]的報(bào)道存在一定差異。Yamaguchi等[9]認(rèn)為，dmrt1基因在性別分化期僅在支持細(xì)胞中有一定量表達(dá)，并不存在性別二態(tài)性，因此認(rèn)為dmrt1基因不參與紅鰭東方鲀的精巢分化，而是在精子發(fā)生過(guò)程中僅僅參與精原細(xì)胞的增殖。原因可能是Yamaguchi[9]的研究?jī)H依據(jù)逆轉(zhuǎn)錄PCR，而本試驗(yàn)中采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)開(kāi)展分析，結(jié)果更準(zhǔn)確。

gsdf是一個(gè)僅在魚(yú)類(lèi)中發(fā)現(xiàn)的新的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(TGF-β)超家族成員，且是硬骨魚(yú)特有的性腺發(fā)育的功能基因。其首先在虹鱒(Oncorhynchusmykiss)[23]中被發(fā)現(xiàn)，并被確定為虹鱒精子發(fā)生的關(guān)鍵基因。在青鳉中，Y染色體上的gsdf基因已被證實(shí)是性別決定基因[24]，青鳉中的gsdf-/-純合突變誘導(dǎo)XY個(gè)體性腺進(jìn)行卵巢分化[25-26]。Jiang等[27]認(rèn)為，在尼羅羅非魚(yú)中，gsdf基因是dmrt1基因的下游基因，gsdf基因可能通過(guò)抑制雌激素的產(chǎn)生誘導(dǎo)精巢分化。本試驗(yàn)中，gsdf基因也與dmrt1基因一樣，在孵化后40、60、80 d XY個(gè)體中的表達(dá)量顯著高于XX個(gè)體(P<0.05)。推測(cè)gsdf基因在紅鰭東方鲀精巢分化中具有重要的作用，但其功能如何與其他性別分化相關(guān)基因(如dmrt1、cyp19a1a基因等)之間的上下游聯(lián)系仍需深入研究。

3.3 雌性性別分化相關(guān)基因表達(dá)

雌激素在魚(yú)類(lèi)的性別分化中起著重要作用，由cyp19a1a基因編碼的芳香化酶通過(guò)催化雄激素轉(zhuǎn)化為17β-雌二醇(E2)，負(fù)責(zé)雌二醇的合成[28]。已有研究表明[10]，與類(lèi)固醇生成途徑相關(guān)的性腺差異表達(dá)基因cyp19a1a在卵巢中高表達(dá)；筆者用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步分析了此基因在孵化后40、60、80 d的紅鰭東方鲀性腺中的表達(dá)，結(jié)果顯示cyp19a1a基因在孵化后40、60、80 d的XX個(gè)體中表達(dá)水平均顯著高于在XY個(gè)體中的表達(dá)水平(P<0.05)；本試驗(yàn)結(jié)果與在其他魚(yú)類(lèi)中的結(jié)果類(lèi)似，表明cyp19a1a基因在紅鰭東方鲀卵巢分化中具有重要作用且在魚(yú)類(lèi)性腺分化中的功能具有保守性。對(duì)雌性斑馬魚(yú)進(jìn)行cyp19a1a基因的敲除導(dǎo)致了全雄性表型[29]。Wu等[30]對(duì)斑馬魚(yú)進(jìn)行dmrt1和cyp19a1a基因的雙突變，結(jié)果顯示，cyp19a1a基因通過(guò)抑制dmrt1基因的表達(dá)在決定卵巢分化中起作用。此外，編碼cyp19a1a激活轉(zhuǎn)錄因子的foxl2基因在雌性中的表達(dá)水平顯著高于雄性，這可能是cyp19a1a基因在雌性中表達(dá)水平高于雄性的原因之一[31]。本試驗(yàn)中，XX個(gè)體性腺中foxl2基因的表達(dá)量在孵化后40、60、80 d均顯著高于XY個(gè)體(P<0.05)，推測(cè)foxl2基因可能通過(guò)調(diào)控cyp19a1a基因的表達(dá)進(jìn)而影響其性別。在尼羅羅非魚(yú)中，foxl2-/-的XX個(gè)體表現(xiàn)出雌—雄逆轉(zhuǎn)，證明了foxl2基因在雌性分化中的作用[32]。在斑馬魚(yú)中，已分離到2個(gè)foxl2基因(foxl2a和foxl2b)，在foxl2a-/-和foxl2b-/-突變體中，卵巢的初始分化和卵母細(xì)胞發(fā)育都是正常的，而純合子foxl2a-/-/foxl2b-/-雙突變體在早期表現(xiàn)出完全的雌—雄性別逆轉(zhuǎn)[33]。在金錢(qián)魚(yú)(Scatophagusargus)中，只有一個(gè)foxl2基因存在，而且它是雌性偏向的，表明其在卵巢發(fā)育中也具有保守的功能[34]。綜上所述，foxl2基因在紅鰭東方鲀卵巢分化中可能有著十分重要的作用，但其功能和作用機(jī)制仍需進(jìn)一步分析。

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果顯示，dmrt1、gsdf基因在紅鰭東方鲀幼魚(yú)XY個(gè)體性腺中顯著高表達(dá)(P<0.05)，而cyp19a1a、foxl2基因在XX個(gè)體性腺中顯著高表達(dá)(P<0.05)。筆者揭示的性別決定及分化關(guān)鍵作用基因的表達(dá)規(guī)律，可為后續(xù)解析這些基因的功能奠定重要基礎(chǔ)，也可為其他魚(yú)類(lèi)繁殖生理學(xué)研究提供理論參考。此外，對(duì)相關(guān)基因的功能尚需進(jìn)一步深入研究。