血清HER-2、CD44聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌中的臨床價值

陳 思，劉 華，劉鷖雯，何怡青，張國良，楊翠霞，杜 艷，高 鋒

（1.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200233；2.上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，上海 200233）

結(jié)直腸癌是居全球第2位的癌癥相關(guān)死亡原因，約有20%的患者在確診時已發(fā)生轉(zhuǎn)移，有近30%的患者會發(fā)生復(fù)發(fā)[1]。近年來，我國結(jié)直腸癌發(fā)病率及死亡率也呈現(xiàn)明顯上升趨勢[2]。盡管血清腫瘤標(biāo)志物，如癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）和糖類抗原（carbohydrate antigen，CA）19-9已廣泛用于結(jié)直腸癌的篩查，但二者的敏感性均較低。另外，結(jié)腸鏡檢查屬于有創(chuàng)檢查，患者依從性較差；糞便隱血試驗(yàn)的影響因素較多，敏感性也較低。因此，目前的臨床篩查方法可能會導(dǎo)致結(jié)直腸癌患者確診及治療的滯后[3]。臨床迫切需要可有效用于結(jié)直腸癌診斷、預(yù)后評估和療效監(jiān)測的新的無創(chuàng)性生物標(biāo)志物。人表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）的異常表達(dá)與乳腺癌、胃癌等多種惡性腫瘤的進(jìn)展相關(guān)。有研究結(jié)果顯示，約有6%的結(jié)直腸癌患者存在HER-2過表達(dá)。分化抗原簇44（cluster of differentiation 44，CD44）是經(jīng)典的腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。值得關(guān)注的是，CD44是HER-2的共受體，二者之間存在緊密的二硫鍵連接[4-5]。HER-2與CD44均位于細(xì)胞表面，但在選擇性剪接或蛋白酶消化的情況下可進(jìn)入血液循環(huán)。有研究發(fā)現(xiàn)，HER-2、CD44有望成為結(jié)直腸癌的血清學(xué)標(biāo)志物[6-7]，但與傳統(tǒng)血清學(xué)指標(biāo)CEA、CA19-9相比，其臨床應(yīng)用前景尚不明確，血清HER-2及CD44水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的相關(guān)性，及其對結(jié)直腸癌的預(yù)后評估價值也未達(dá)成共識。另外，HER-2與CD44作為共受體，二者的聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌的臨床應(yīng)用中是否具有協(xié)同互補(bǔ)的優(yōu)勢的研究尚未見報(bào)道。為此，本研究擬探討結(jié)直腸癌患者血清HER-2及CD44水平及二者之間的相關(guān)性，以期為結(jié)直腸癌的輔助診斷及術(shù)后療效監(jiān)測提供新的生物學(xué)標(biāo)志物。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2021年6—9月上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院經(jīng)病理檢查確診的結(jié)直腸癌患者38例（結(jié)直腸癌組），其中男24例、女14例，年齡47～75歲，包括結(jié)腸癌18例、直腸癌20例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)后病理學(xué)診斷為原發(fā)性結(jié)直腸腺癌；（2）術(shù)前未行放化療；（3）優(yōu)先納入能夠獲取術(shù)前、術(shù)后配對血清的患者。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）結(jié)直腸原位癌、鱗癌、腺鱗癌；（2）轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌、復(fù)發(fā)性惡性腫瘤；（3）伴有其他部位、其他類型的原發(fā)惡性腫瘤。選取同期上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院結(jié)直腸良性病變患者35例（良性病變組），其中男24例、女11例，年齡40～74歲，包括結(jié)腸炎7例、克羅恩病1例、潰瘍性結(jié)腸炎4例、腺瘤23例。另選取同期上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院健康體檢者36名作為正常對照組，其中男26名、女10名，年齡50～72歲，血壓、血脂、血糖、肝功能和腎功能等均正常。本研究經(jīng)上海交通大學(xué)附屬第六人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有研究對象或其家屬均知情同意。

1.2 方法

收集所有對象的臨床一般資料，包括年齡、性別、腫瘤類型、腫瘤大小、TNM分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、是否有神經(jīng)侵犯、是否有脈管侵犯、Ras基因型和CEA、CA19-9檢測結(jié)果等，其中有5例患者的腫瘤大小未知，1例患者TNM分期未知，4例患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、神經(jīng)侵犯、脈管侵犯情況不明，13例結(jié)直腸癌患者的Ras基因型病理信息缺失。

采用分離膠促凝管采集結(jié)直腸癌患者術(shù)前、術(shù)后2～3 d和正常對照者、結(jié)直腸良性病變患者的空腹靜脈血2 mL，離心分離血清，轉(zhuǎn)移至滅菌Eppendorf管中，保存于-80 ℃冰箱，統(tǒng)一采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測血清HER-2及CD44水平，試劑盒均購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。人可溶性CD44分子（sCD44）ELISA試劑盒的最低檢測限為10 pg/mL，線性范圍為100～3 200 pg/mL，批間和批內(nèi)變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）均＜15%，標(biāo)準(zhǔn)曲線r2=0.981。人表皮生長因子受體2（sp185，H E R-2）E L I S A試劑盒的最低檢測限為0.1 ng/mL，線性范圍0.5～16 ng/mL，批間CV＜15%，批內(nèi)CV＜10%，標(biāo)準(zhǔn)曲線r2=0.997。檢測儀器為Epoch酶標(biāo)儀（美國BioTek公司）。嚴(yán)格按儀器和試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 23.0軟件和Graphpad Prism 7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料采用±s表示，2個組之間比較采用t檢驗(yàn)或配對t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。呈偏態(tài)分布的計(jì)量資料以中位數(shù)（M）[四分位數(shù)（P25～P75）]表示，組間比較采用Wilcoxon符號秩和檢驗(yàn)。兩變量的相關(guān)分析采用Pearson線性相關(guān)分析，兩變量的回歸分析采用線性回歸分析。采用受試者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲線評估各項(xiàng)指標(biāo)輔助診斷結(jié)直腸癌的效能。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組、良性病變組及正常對照組血清HER-2及CD44水平的比較

結(jié)直腸癌組術(shù)前血清HER-2水平均高于良性病變組和正常對照組（P＜0.05、P＜0.000 1）。結(jié)直腸癌組術(shù)前血清CD44水平高于正常對照組（P＜0.05），與良性病變組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 3組之間血清HER-2和CD44水平的比較

2.2 血清HER-2和CD44水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

Ras基因突變型及有周圍神經(jīng)侵犯的結(jié)直腸癌患者血清HER-2水平分別高于Ras基因野生型及無周圍神經(jīng)侵犯的患者（P＜0.05），而CD44水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。不同年齡、性別、腫瘤類型、腫瘤大小、TNM分期以及有、無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和脈管侵犯的結(jié)直腸癌患者之間血清HER-2及CD44水平差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 血清HER-2和CD44水平與結(jié)直腸癌患者臨床病理特征的關(guān)系

2.3 血清HER-2和CD44相關(guān)性分析

結(jié)直腸癌患者術(shù)前血清HER-2與CD44水平呈正相關(guān)，相關(guān)方程為：Y=0.7696X+1.515（r=0.50，P＜0.01）。見圖1。

圖1 結(jié)直腸癌患者術(shù)前血清HER-2與CD44水平的相關(guān)性

2.4 血清HER-2和CD44輔助診斷結(jié)直腸癌的效能

（1）以正常對照組為對照，建立血清HER-2、CD44、CEA、CA19-9聯(lián)合檢測的Logistic回歸模型，方程為：Logit（P）=-3.901+0.700×HER-2+0.711×CD44+0.055×CEA+0.079×CA19-9。HER-2、CD44、CEA、CA19-9單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測輔助診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積（area under curve，AUC）分別為0.779、0.692、0.620、0.634及0.837，敏感性分別為84.2%、55.3%、63.2%、44.7%及76.3%，特異性分別為66.7%、77.8%、61.1%、100.0%及80.6%。見表3。

表3 以正常對照組為對照時各項(xiàng)指標(biāo)單項(xiàng)和聯(lián)合檢測輔助診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線參數(shù)

（2）以良性病變組為對照，建立血清HER-2、CD44、CEA、CA19-9聯(lián)合檢測的Logistic回歸模型，方程為：Logit（P）=-0.584-0.135×HER-2-0.017×CD44+0.069×CEA+0.055×CA19-9。HER-2、CD44、CEA、CA19-9單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測鑒別診斷結(jié)直腸癌的AUC分別為0.471、0.534、0.677、0.645及0.723，敏感性分別為81.6%、97.4%、63.2%、63.2%及60.5%，特異性分別為29.4%、23.5%、67.6%、70.6%及79.4%。見表4。

表4 以良性病變組為對照時各項(xiàng)指標(biāo)單項(xiàng)和聯(lián)合檢測鑒別診斷結(jié)直腸癌的ROC曲線參數(shù)

2.5 30例結(jié)直腸癌患者術(shù)前、術(shù)后血清HER-2、CD44、CEA、CA19-9水平的比較

結(jié)直腸癌患者術(shù)后血清CD44、CEA、CA19-9水平均顯著低于術(shù)前（P＜0.000 1、P＜0.000 1、P＜0.01），而血清HER-2水平術(shù)前、術(shù)后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表5、圖2。

圖2 30例結(jié)直腸癌患者術(shù)前、術(shù)后血清HER-2、CD44、CEA、CA19-9水平變化

表5 30例結(jié)直腸癌患者術(shù)前、術(shù)后血清HER-2、CD44、CEA、CA19-9水平的比較

3 討論

HER-2是人表皮生長因子受體家族成員之一，在抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖及腫瘤血管生成等方面發(fā)揮重要作用。作為HER-2的共受體，CD44是公認(rèn)的結(jié)直腸癌腫瘤干細(xì)胞標(biāo)志物。既往研究多關(guān)注結(jié)直腸癌組織中HER-2和CD44的表達(dá)水平及臨床意義，而關(guān)于血清HER-2和CD44聯(lián)合檢測的臨床應(yīng)用鮮有報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者HER-2與CD44呈正相關(guān)（r=0.50，P＜0.01）。由于CD44和HER-2在結(jié)構(gòu)和功能上均存在緊密聯(lián)系，我們認(rèn)為二者在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過程中可能發(fā)揮協(xié)同效應(yīng)。因此，血清HER-2和CD44的聯(lián)合應(yīng)用在結(jié)直腸癌的輔助診斷及療效監(jiān)測中可能具有協(xié)同互補(bǔ)的優(yōu)勢。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組術(shù)前血清HER-2水平均明顯高于良性對照組和正常對照組（P＜0.05、P＜0.000 1）。提示血清HER-2在結(jié)直腸癌的輔助診斷和鑒別診斷中具有較大價值。本研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者術(shù)前血清CD44水平明顯高于正常對照組（P＜0.05），與良性病變組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示血清CD44在結(jié)直腸癌診斷及鑒別診斷中的特異性較低，有必要與其他腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示，以正常對照組為對照，HER-2、CD44、CEA、CA19-9單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測輔助診斷結(jié)直腸癌的AUC分別為0.779、0.692、0.620、0.634及0.837，敏感性分別為84.2%、55.3%、63.2%、44.7%及76.3%，特異性分別為66.7%、77.8%、61.1%、100.0%及80.6%，相對于CEA和CA19-9，血清HER-2輔助診斷結(jié)直腸癌的敏感性更高；以良性病變組為對照，HER-2、CD44、CEA、CA19-9單項(xiàng)檢測及聯(lián)合檢測鑒別診斷結(jié)直腸癌的AUC分別為0.471、0.534、0.677、0.645及0.723，敏感性分別為81.6%、97.4%、63.2%、63.2%及60.5%，特異性分別為29.4%、23.5%、67.6%、70.6%及79.4%，血清HER-2、CD44鑒別診斷結(jié)直腸癌的敏感性均高于CEA、CA19-9。由此可見，血清HER-2、CD44的優(yōu)勢在于具有較高的敏感性，可彌補(bǔ)CEA和CA19-9敏感性低的不足。本研究結(jié)果提示，4項(xiàng)指標(biāo)聯(lián)合檢測的診斷效能顯著優(yōu)于單項(xiàng)指標(biāo)，可明顯提高結(jié)直腸癌診斷的敏感性。因此，血清HER-2和CD44與傳統(tǒng)腫瘤標(biāo)志物聯(lián)合應(yīng)用或可提高結(jié)直腸癌的檢出率。

復(fù)發(fā)是影響結(jié)直腸癌患者預(yù)后的關(guān)鍵因素，術(shù)后監(jiān)測對于結(jié)直腸癌患者至關(guān)重要。本研究發(fā)現(xiàn)，與CEA、CA19-9的變化情況類似，結(jié)直腸癌患者術(shù)后2～3 d血清CD44水平顯著降低，表明血清CD44可能來源于腫瘤組織，其水平變化可以反映結(jié)直腸癌患者的手術(shù)效果。GUO等[8]的研究結(jié)果顯示，化療也會使結(jié)直腸癌患者血清CD44水平降低。因此，血清CD44可能具有動態(tài)監(jiān)測結(jié)直腸癌患者療效的價值。此外，本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者術(shù)前、術(shù)后血清HER-2水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。TSIGRIS等[9]的研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌患者術(shù)后7 d血清HER-2水平明顯降低。這可能與血清HER-2的半衰期較長有關(guān)。因此，與CD44相比，結(jié)直腸癌患者術(shù)后血清HER-2水平下降可能相對滯后，進(jìn)一步提示二者在結(jié)直腸癌中的臨床價值具有協(xié)同互補(bǔ)的特點(diǎn)?？傊?，聯(lián)合檢測血清HER-2及 CD44可能在結(jié)直腸癌患者的療效監(jiān)測中發(fā)揮重要作用，后續(xù)研究將進(jìn)一步探索其在監(jiān)測結(jié)直腸癌患者復(fù)發(fā)中的潛在價值。

本研究結(jié)果還顯示，結(jié)直腸癌患者血清HER-2水平與Ras基因突變及周圍神經(jīng)侵犯相關(guān)。Ras基因的突變狀態(tài)是臨床判斷結(jié)直腸癌患者是否適合表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）靶向治療的預(yù)測因子，HER-2是EGFR家族成員之一。本研究結(jié)果顯示，發(fā)生Ras基因突變的結(jié)直腸癌患者血清HER-2水平顯著升高，提示血清HER-2可作為臨床制定治療方案的參考指標(biāo)。美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（the National Comprehensive Cancer Network，NCCN）將周圍神經(jīng)侵犯作為Ⅱ期結(jié)直腸癌患者的高危因素，提示此類患者更易發(fā)生腫瘤侵犯和轉(zhuǎn)移。有多項(xiàng)研究結(jié)果表明，宮頸腺癌及壺腹周圍癌患者HER-2過表達(dá)與周圍神經(jīng)侵犯相關(guān)[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，有周圍神經(jīng)侵犯的結(jié)直腸癌患者血清HER-2水平顯著升高，提示血清HER-2水平在一定程度上可反映腫瘤的侵襲狀況，檢測HER-2水平有助于判斷結(jié)直腸癌患者的病程進(jìn)展和預(yù)后。本研究的不足之處在于樣本量較小，為了觀察術(shù)后血清學(xué)相關(guān)指標(biāo)的變化，本研究側(cè)重要求納入的結(jié)直腸癌患者術(shù)前、術(shù)后血清樣本的配對性，導(dǎo)致入選病例較少，后續(xù)將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，并進(jìn)行跟蹤研究。

綜上所述，HER-2與CD44在結(jié)構(gòu)和功能上存在緊密聯(lián)系，且在結(jié)直腸癌輔助診斷及療效監(jiān)測中展現(xiàn)出明顯的相關(guān)性和互補(bǔ)性，提示血清HER-2及CD44聯(lián)合檢測在結(jié)直腸癌中具有重要的臨床價值。