徐州市睢寧縣規(guī)?；B(yǎng)雞場禽流感流行病學(xué)調(diào)查

程漢

關(guān)鍵詞：禽流感;免疫抗體;血凝;血凝抑制試驗

1 材料及方法

1.1 實驗材料

1.1.1 1%紅細胞懸液

采集至少3只SPF公雞或無禽流感或新城疫等抗體的健康公雞的血液與等體積阿氏液混合，用PH7.2、0.01mol/LPBS液或生理鹽水洗滌3次，每次均以1000r/min，洗滌后用PBS或生理鹽水配制成體積分?jǐn)?shù)為1%紅細胞懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 診斷液

標(biāo)準(zhǔn)禽流感（H4、H6）病毒抗原、標(biāo)準(zhǔn)禽流感（H4、H6）陽性血清，由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物疫病診斷液制備中心提供。

1.1.3 儀器

96孔V型微量反應(yīng)版，移液器，微量振蕩器等。

1.1.4 被檢血清樣品

來自睢寧縣各地相當(dāng)規(guī)模的雞場的雞群，每個雞群隨機采取健康雞血樣，翅靜脈采血2ml/羽，20℃以下氣溫24h后大部分血清自動析出，可直接檢測，不能自動析出的則進行離心分離血清，當(dāng)天來不及檢測的則將血清分離至4℃保存。

1.2 檢測方法及步驟

該試驗是目前WHO進行全球流感監(jiān)測所普遍采用的試驗方法，用來檢測禽血清中的免疫抗體。按照《GB/T18936-2003高致病性禽流感診斷技術(shù)》采用血凝（HA）和血凝抑制（HI）試驗，利用血凝素（HA）蛋白的抗體與受體的特異性結(jié)合能夠干擾HA蛋白與紅細胞受體的結(jié)合從而出現(xiàn)抑制現(xiàn)象，用來檢測禽血清中的免疫抗體，在進行HI試驗之前必須先進行HA試驗，以確定HI試驗中所用抗原的HA滴度。完成HA試驗后，以4個HA單位的抗原進行HI試驗，以完全抑制4個血凝單位抗原的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴度，抗體效價以㏒2表示。

1.2.1 血凝（HA）試驗

（1）在v型微量反應(yīng)板的1～12孔均加入0.025ml

PBS或者生理鹽水。

（2）吸取0.025mL病毒懸液（病毒抗原），加入第1孔，混勻。

（3）從第1孔吸取25ul病毒懸液加入第2孔，混勻后吸取25ul加入第3孔，如此進行倍比稀釋至11孔，從第11孔吸取25ul，棄去。

（4）每孔加入25ul的生理鹽水。

（5）每孔加入25ul 1﹪雞紅細胞懸液（紅細胞懸液充分混勻）。

（6）振蕩搖勻，在溫室下靜置40min后觀察結(jié)果 。對照紅細胞將成明顯的紐扣狀沉到孔底。

結(jié)果判定：將血凝板傾斜，觀察紅細胞有無呈淚滴狀流淌，完全血凝（不流淌）的抗原或者病毒最高稀釋倍數(shù)代表一個血凝單位。

1.2.2 血凝抑制（HI）試驗

根據(jù)血凝試驗結(jié)果配制4HUA的病毒抗原，以完全血凝的病毒最高稀釋倍數(shù)作為終點，終點稀釋倍數(shù)除以4即為含4HUA的抗原的稀釋倍數(shù)。

（1）在微量反應(yīng)板的1～11孔加入25ul、第12孔加入50ul的生理鹽水。

（2）吸取25ul血清加入第一孔，充分混勻后吸25ul于第二孔，依次對比稀釋至第10孔，棄去25ul。

（3）1～11孔均加入含4HUA混勻的病毒抗原液25ul，溫室靜置至少30min。

（4）每孔加入25ul1﹪紅細胞懸液，輕輕混勻，室溫靜置40min。

結(jié)果判定：將血凝板傾斜，觀察紅細胞有無呈淚滴狀流淌。以完全抑制4個HAU的血清最高稀釋倍數(shù)作為HI滴數(shù)。

2 統(tǒng)計

根據(jù)血凝試驗和血凝抑制試驗來如實統(tǒng)計各鄉(xiāng)鎮(zhèn)的雞群禽流感免疫抗體合格率。（各鎮(zhèn)血清樣本數(shù)量是20，各鎮(zhèn)合格率達到90%以上即為合格）

H6總體合格率為91.77%

3 大規(guī)模免疫抗體監(jiān)測在防疫中思考與討論

近幾年來，隨著養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，畜禽飼養(yǎng)量日益增加，集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖場層出不窮，有的村組幾乎每個農(nóng)戶家中都養(yǎng)雞，雞舍一幢挨著一幢，且雞群的批次多、品種不一、雞群的免疫時間不同等因素，一旦發(fā)生疫情，將會產(chǎn)生“多米諾骨牌”效應(yīng)，損失慘重，甚至血本無歸。因此為防止疫情的發(fā)生，避免損失，最重要的是做好免疫工作，并確保免疫雞群的抗體在免疫保護范圍內(nèi)，同時做好生物安全管理工作。但在實際生產(chǎn)中，養(yǎng)殖從業(yè)人員素質(zhì)參差不齊，養(yǎng)殖數(shù)量多、批次多、疫苗種類繁多、免疫程序混亂，導(dǎo)致免疫工作存在諸多問題，如應(yīng)免未免、免疫接種的途徑錯誤、免疫劑量較少（拔針?biāo)俣冗^快）、超量頻繁免疫造成免疫麻痹等等，其最終的結(jié)果就是免疫失敗，免疫后的抗體沒有達到應(yīng)有的保護水平。而如何判斷雞群的抗體水平是否達到保護雞群且不發(fā)生疫病，抗體監(jiān)測是唯一最直接、最有效的手段。

3.1 抗體監(jiān)測能及時了解雞群免疫后的免疫效果

當(dāng)疫苗接種到動物體內(nèi)后，經(jīng)過一系列復(fù)雜的反應(yīng)之后才能夠產(chǎn)生保護，而這種保護力的產(chǎn)生往往又容易受到多種因素的影響，如疫苗方面、動物方面、接種方式方法及時機選擇、飼養(yǎng)管理以及環(huán)境等，每一個方面出現(xiàn)變化都有可能對免疫效果產(chǎn)生或多或少的影響。加之動物體的免疫應(yīng)答過程是以一種人們?nèi)庋劭床坏?、摸不著的方式進行的，因此在對動物接種疫苗之后，究竟體內(nèi)的免疫應(yīng)答情況如何，產(chǎn)生的保護情況怎樣，雖然涉及的方面很多，但起決定作用的還是針對該接種抗原所產(chǎn)生的抗體，抗體滴度或效價的高低直接影響著免疫效果，因此對雞群及時采血檢測抗體上升情況，從監(jiān)測即時抗體水平或抗體水平的動態(tài)變化，來判斷雞群接種疫苗的免疫效果能否抵抗與疫苗相對應(yīng)的疫病，免疫完成后只有通過抗體檢測免疫效果，才能有效控制疾病的發(fā)生。

3.2 定期進行抗體監(jiān)測，可以根據(jù)抗體滴度的高低及時進行免疫

體內(nèi)抗體水平會隨著免疫時間的延長逐漸下降到保護值以下，定期檢測雞群的抗體水平，根據(jù)抗體滴度的高低確定加強免疫的時間。系統(tǒng)的監(jiān)測可更多地掌握各類疫病的抗體變化規(guī)律，及時做好免疫工作和時間安排，確保雞群抗體始終處于免疫保護水平以上，方能發(fā)揮最佳的生產(chǎn)性能。

3.3 根據(jù)抗體監(jiān)測的結(jié)果，制定和調(diào)整雞群的免疫程序

免疫程序受母源抗體和自身抗體水平、免疫時間、免疫方法、疫苗種類、免疫次數(shù)和當(dāng)?shù)匾卟×餍星闆r等因素的影響。良好免疫效果的獲得依賴于首次免疫和再次免疫時機是否合適，母源抗體水平?jīng)Q定首次免疫的時間，再次免疫時體內(nèi)的殘留抗體水平?jīng)Q定再次免疫的時間。由于各方面的影響，一個養(yǎng)殖場的免疫程序今年、明年適合，后年可能就不太適合，須隨時加以調(diào)整修訂。一些場照搬其他場免疫程序，或連年不變的做法難免有時免疫失誤而引發(fā)疫病的流行。因此，不能機械地仿效其他場的免疫程序，而應(yīng)根據(jù)當(dāng)?shù)匾咔榍闆r結(jié)合上一代次的免疫情況，以所測的實際抗體水平為依據(jù)，制定適合本場的免疫程序，并隨時監(jiān)測、及時修訂。

3.4 抗體監(jiān)測可提示某些疾病發(fā)生的風(fēng)險

如新城疫、禽流感抗體超過13log2，雞群有可能感染了病毒;低于4log2則不足以抵抗病毒的侵襲。采血檢測發(fā)病前后雞群的抗體水平，剛發(fā)病時新城疫或禽流感抗體水平低，大部分雞抗體水平在保護值以下，離散度在5個以上。病情恢復(fù)時的抗體上升3～5個滴度以上，且高于免疫所產(chǎn)生的抗體，提示該雞群可能發(fā)生了新城疫或禽流感。

總之，動物疫病監(jiān)測是動物疫病防治工作中最重要的技術(shù)手段，是預(yù)防、控制直至根除動物疫病的基礎(chǔ)性工作。只有通過長期、連續(xù)、可靠地監(jiān)測，才能及時準(zhǔn)確地掌握動物疫病的發(fā)生和流行趨勢，制定并實施國家動物疫病預(yù)防、控制措施，界定動物疫情的發(fā)生范圍、數(shù)量和疫源等疫情信息。

3.5 通過調(diào)查免疫抗體不合格的禽群分析原因

主要是養(yǎng)殖戶僥幸，怕麻煩，隱瞞未防疫的真相，二是未按照程序。三是免疫方法不當(dāng)，用苗劑量不足。通過這次大規(guī)模的免疫抗體檢測，找出我縣禽流感免疫工作中存在的問題和不足。針對存在問題，我們對免疫不合格的禽群逐戶監(jiān)督進行補免。

3.6 引起抗體效價不同的原因

家禽機體免疫系統(tǒng)是產(chǎn)生免疫應(yīng)答的物質(zhì)基礎(chǔ)，由免疫器官、免疫細胞組成。用疫苗對家禽進行免疫接種，刺激機體免疫系統(tǒng)發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)，產(chǎn)生特異免疫力。機體受到抗原物質(zhì)（疫苗）刺激后，由免疫器官、免疫細胞產(chǎn)生的能與相應(yīng)抗原特異性結(jié)合反應(yīng)的免疫球蛋白即抗體，具有各種免疫功能，主要存在于機體的血液、淋巴液、組織液中，并以血液中抗體存在最高，血清抗體即循環(huán)抗體是主要免疫力。根據(jù)抗體產(chǎn)生的動力學(xué)，動物機體初次和再次接觸抗原后，引起體內(nèi)產(chǎn)生抗體的水平有較大差異，機體初次接觸抗原，在一定時期內(nèi)體內(nèi)抗體產(chǎn)生很少，抗體水平維持時間也較短。免疫還具有記憶功能，動物機體在初次接觸抗原物質(zhì)時，除刺激機體形成產(chǎn)生抗體外，也形成了免疫記憶細胞，對再次接觸的相同抗原物質(zhì)可產(chǎn)生更快的免疫應(yīng)答，當(dāng)動物機體第二次接觸相同的抗原時體內(nèi)產(chǎn)生的抗體，含量高，而且維持時間長。因此，在對肉雞進行初次免疫后由于免疫系統(tǒng)是初次應(yīng)答，加上母源抗體的干擾，因而血清抗體產(chǎn)生慢，數(shù)量少，抗體效價普遍較低;而蛋雞由于在首次免疫禽流感疫苗后，機體對該種疫苗已具有免疫記憶，當(dāng)再次用此種疫苗進行加強免疫時，機體可迅速產(chǎn)生比上次免疫時更多的抗體，抗體效價普遍較高。同時，禽流感疫苗屬油乳劑滅活疫苗，滅活疫苗不同于活疫苗，滅活疫苗特性是接種后不能在動物體內(nèi)繁殖，使用安全，但滅活苗接種劑量較大，免疫期相對短，并需要重復(fù)接種。

通過對養(yǎng)殖戶禽流感免疫抗體的全面監(jiān)測，使每個養(yǎng)禽戶對自己禽群的實際免疫效果有一個真正地了解，大多數(shù)免疫不合格的養(yǎng)禽戶能認(rèn)真分析免疫工作中存在的問題，更加堅信科學(xué)免疫，按程序免疫的決心。對少數(shù)抱有僥幸心理，不按規(guī)定免疫的抗體不達標(biāo)的養(yǎng)禽戶在監(jiān)督補免后15～20d再次進行抗體監(jiān)測;對個別拒防疫用戶，通過動物衛(wèi)生監(jiān)督機構(gòu)介入，實行強制免疫，同時鄉(xiāng)鎮(zhèn)獸醫(yī)站與拒防戶簽訂免疫責(zé)任狀，真正使高致病性禽流感免疫工作實行強制化。全面進行禽流感抗體免疫檢測，需要花費大量的人力，物力，單靠市獸醫(yī)衛(wèi)生監(jiān)督所很難做到，我們的做法是在每個鄉(xiāng)鎮(zhèn)培訓(xùn)2～3名能力強的防疫員負責(zé)血樣工作。

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